肖興玉,劉世博,張瑩輝,王 楠,李俊平,徐 磊*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所/國家動(dòng)物布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室,北京 100081;2.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130062;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,吉林長春 130118)

布魯氏菌病(Brucellosis,簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)侵染機(jī)體后所引起的一種急性或慢性人獸共患傳染病[1-2]。布魯氏菌自1887年被首次分離后布病迅速蔓延至全球170多個(gè)國家和地區(qū),遍布于亞洲、非洲、歐洲、大洋洲和拉丁美洲,嚴(yán)重威脅公共健康和畜牧業(yè)發(fā)展[3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報(bào)道,全球每年有超50萬人被確診為布病感染者,實(shí)際發(fā)病率應(yīng)為該數(shù)字的10～25倍[4]。同時(shí),僅在我國,牲畜患布病每年所造成的經(jīng)濟(jì)損失便高達(dá)713億元。2005年,世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,WOAH)將布病列為B類法定傳染病,我國將其列為二類傳染病[5-6]。

1985年,WHO根據(jù)宿主類型,將布魯氏菌屬分為6個(gè)種(羊種、綿羊型副睪種、牛種、豬種、沙林鼠種和犬種)和19個(gè)生物型[7]。目前已發(fā)現(xiàn)的豬布魯氏菌有5個(gè)生物型, 其中1、2、3型可以引起豬發(fā)病,4、5型可引起其他動(dòng)物發(fā)病[8-9]。豬肉作為全球消費(fèi)量最大的飼養(yǎng)動(dòng)物肉類,在提供動(dòng)物蛋白上起著十分關(guān)鍵的作用。因此,豬在全球尤其是發(fā)展中國家的畜牧生產(chǎn)中,占據(jù)重要地位。而豬布病作為威脅豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要疾病之一,對(duì)其進(jìn)行有效的預(yù)防與診斷,具有十分重要的意義。

1 流行病學(xué)

1.1 傳染源

主要指患病母豬的流產(chǎn)胎兒、乳汁、胎衣、胎水等分泌物,還可通過污染水源、飼料、飼養(yǎng)用具、感染健康牲畜?；疾」i的精液同樣有致病性,可通過交配或人工授精感染母豬[5,8]。

1.2 傳染方式

主要通過3種方式進(jìn)行傳播。(1)通過消化道進(jìn)行傳染,即牲畜食用污染過的飼料和水源進(jìn)行傳染;(2)通過皮膚黏膜、呼吸道、損傷或未損傷的皮膚、結(jié)膜進(jìn)行傳染;(3)通過交配進(jìn)行傳播;有時(shí)吸血昆蟲也可傳播此疾病[8-10]。

1.3 流行特點(diǎn)

本病一般為散發(fā),性成熟年齡豬群易感,產(chǎn)仔季為多發(fā)季節(jié)。母豬感染后一般只發(fā)生1次流產(chǎn),流產(chǎn)2次的較為少見[8,10]。

1.4 流行情況

1914年,從印第安納州的流產(chǎn)豬胎中首次分離出豬布魯氏菌,這是關(guān)于豬布病的最早記載。但由于20世紀(jì)初微生物學(xué)發(fā)展的局限性,直至1929年,該分離株才被認(rèn)定為獨(dú)立的豬布魯氏菌。此后,豬布病在世界范圍內(nèi)蔓延開來,并在野生動(dòng)物群體尤其是野豬中廣泛流行,但豬布病不同生物型的流行情況卻存在較大差異。

在美國,預(yù)計(jì)有600萬頭野豬患有1型或3型豬布魯氏菌病,豬布病的高流行率所導(dǎo)致的疾病傳播,不僅是在家豬群體中,還嚴(yán)重影響了牛的養(yǎng)殖[11];在歐洲,分離出1型豬布魯氏菌的記載極少,3型豬布魯氏菌僅在克羅地亞有過報(bào)道,主要是以褐兔為宿主的2型豬布魯氏菌傳播為主[5,11];在中國,雖然以3型豬布病零星暴發(fā)的情況為主,卻仍然會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5,11];在非洲、南美洲、東南亞,關(guān)于豬布病的流行病學(xué)數(shù)據(jù)有限,但都有分離到豬布魯氏菌1型的相關(guān)記載。盡管在各國制定的豬布病防控措施下,有效地降低了該病在家豬中的流行率,但近5年來,在德國、法國、澳大利亞、塞爾維亞、意大利、埃及、巴西等國家的流行病學(xué)調(diào)查中,均有檢出豬布病的相關(guān)報(bào)道[12-18]。

2 豬布病臨床癥狀

母豬患病后,最典型的癥狀為流產(chǎn)。一般在懷孕第2、第3個(gè)月,流產(chǎn)情況最為明顯,個(gè)別患病母豬也會(huì)在妊娠第2周、第3周出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀。流產(chǎn)胎兒,多數(shù)為死胎。有時(shí)因胎衣不下,還會(huì)伴發(fā)子宮內(nèi)膜炎,影響后期配種。由于流產(chǎn)前癥狀不明顯,且早期有流產(chǎn)狀況出現(xiàn)時(shí),胎兒、胎衣常被母豬吃掉,而使豬布病不易被發(fā)現(xiàn)。此外,母豬感染,重復(fù)流產(chǎn)的情況較為少見[9]。

公豬患病后,最典型癥狀為睪丸發(fā)炎和附睪炎。患病公豬睪丸有熱痛感,表現(xiàn)為一側(cè)或兩側(cè)睪丸腫大,嚴(yán)重的會(huì)發(fā)生睪丸萎縮甚至硬化,影響性欲,失去配種能力。

除上述表現(xiàn)癥狀之外,無論是患病公豬,還是患病母豬,都可能產(chǎn)生以下癥狀。免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用,出現(xiàn)高熱;食欲減退,體重下降;出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng);出現(xiàn)呼吸困難、氣喘等癥狀;出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)腫脹和疼痛的癥狀,常見在后肢。受此影響,病豬會(huì)出現(xiàn)行走不便、跛行等現(xiàn)象[11,19]。

3 豬布病診斷方法

豬布病診斷方法主要有3種,分別是病原學(xué)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法[20]。根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織的相關(guān)規(guī)定,需要將所有豬的流產(chǎn)和睪丸炎病例均視為布魯氏菌病,同時(shí)還應(yīng)觀察是否有胎衣滯留、關(guān)節(jié)炎、腹瀉等布病臨床相關(guān)癥狀。然后輔以流行病學(xué)調(diào)查,通過實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行最終確診。但豬布病早期臨床癥狀不明確,使豬布病不易被發(fā)現(xiàn),只能通過分離和鑒定布魯氏菌才能得到明確診斷,除此之外,沒有任何一種單一的檢測方法可以將一種細(xì)菌明確鑒定為布魯氏菌。因此,為了準(zhǔn)確鑒別,通常需要結(jié)合生長特征、免疫學(xué)、病原學(xué)或分子方法進(jìn)行聯(lián)合診斷。

3.1 病原學(xué)方法

細(xì)菌培養(yǎng)鑒定作為豬布病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,是最精確也是最直接的診斷方法[21]。所以在有實(shí)驗(yàn)條件的情況下,應(yīng)以病原培養(yǎng)鑒定為唯一標(biāo)準(zhǔn),盡可能的進(jìn)行,以鑒別疾病和確定所涉及的豬布病的生物型。對(duì)豬布魯氏菌進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),通常使用TSB培養(yǎng)基或Farrell氏培養(yǎng)基,對(duì)患病豬的乳腺、妊娠或產(chǎn)后子宮、精液樣本、流產(chǎn)胎兒樣本進(jìn)行培養(yǎng)[22]。但培養(yǎng)鑒定法在使用時(shí),對(duì)實(shí)驗(yàn)室等級(jí)和實(shí)驗(yàn)人員有嚴(yán)格要求,同時(shí)還存在耗時(shí)長、分離率低、安全隱患高的缺點(diǎn),極大地制約該方法的實(shí)際應(yīng)用。

此外,布魯氏菌作為一種革蘭氏陰性菌,具有抵抗弱酸脫色的特性,可通過Ziehl-Neelsen染色法對(duì)豬布病進(jìn)行初步鑒別[23]。同時(shí),無論是Braun &Bonestell的結(jié)晶紫菌落染色法或Henry的斜反射光外觀鑒定法,還是直接觀察菌落形態(tài)、生長特性、使用脲酶和氧化酶試驗(yàn)進(jìn)行鑒別,都只能作為豬布魯氏菌病存在的假定證據(jù),所以無論檢測結(jié)果是陽性還是陰性,都應(yīng)通過培養(yǎng)進(jìn)行確認(rèn)。

3.2 免疫學(xué)方法

3.2.1 血清凝集試驗(yàn) 試管凝集試驗(yàn)(SAT)作為早期一種經(jīng)典的血清凝集試驗(yàn)方法,具有敏感性高、可定性定量、檢出率高的優(yōu)點(diǎn),是我國官方指定布病診斷方法[24]。但由于SAT不適用于現(xiàn)場診斷,特異性容易受豬血清中非特異抗體IgM的影響,造成假陽性結(jié)果。在歐美等國家,SAT逐漸被虎紅平板凝集試驗(yàn)(rose bengal test,RBT)、緩沖平板凝集試驗(yàn)(buffered plate agglutination test,BPAT)所替代?；⒓t平板凝集試驗(yàn)與試管凝集試驗(yàn)相比,受特異性凝集干擾小,常被用于全球貿(mào)易中豬布病的初篩[3,20]。

參考WOAH對(duì)虎紅平板凝集抗原的制備方法,虎紅平板凝集抗原是對(duì)死亡的流產(chǎn)桿菌S99或S1119-3細(xì)胞沉淀離心后,使用孟加拉玫瑰染料進(jìn)行染色,溶于乳酸形成的粉紅色液體。RBT檢測效果相比SAT有所提高,仍存在特異性不高,檢測結(jié)果易受樣品質(zhì)量影響、凝集現(xiàn)象不明顯,易漏檢的問題。對(duì)于RBT檢測為陽性的樣本,還需通過其他手段檢測為陽性,才可最終判定為陽性。

補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test,CFT)作為WOAH推薦的布病診斷方法,可用于羊布病和牛布病的診斷,不可單獨(dú)用于豬布病的診斷。這是由于對(duì)豬進(jìn)行檢測時(shí),豬補(bǔ)體與豚鼠補(bǔ)體相互作用,會(huì)降低檢測敏感性,無法排除假陽性,故常作為RBT的補(bǔ)充試驗(yàn)[25]。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)作為一種靈敏度高、特異性好、操作簡便、檢測成本低、可定性定量的免疫學(xué)檢測方法,自1971年Engvall和Perlmann發(fā)明ELISA技術(shù)后,就被迅速應(yīng)用到各種抗原和抗體的測定[26]。1976,Garin-Basuji等年首次將ELISA方法應(yīng)用于布魯氏菌抗體的檢測,并發(fā)現(xiàn)檢測靈敏度是SAT的10～100倍[27]。目前,關(guān)于豬布病已有非常成熟的ELISA診斷體系,其中在布病診斷方面應(yīng)用最多的是間接ELISA(iELISA)和競爭ELISA(cELISA)。

抗原的選擇直接決定著ELISA的靈敏性和特異性,iELISA以光滑型布魯氏菌的脂多糖O-鏈結(jié)構(gòu)為包被抗原,對(duì)待測抗體進(jìn)行檢測,第二抗體多為商品化的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗IgG重鏈表位的單克隆抗體。酶與底物相互作用后,如有明顯顏色變化,則證明有布魯氏菌的存在。由于進(jìn)行iELISA時(shí),是以檢測多糖O-鏈的抗體為基礎(chǔ),但有一些細(xì)菌,如豬普遍感染的耶爾森氏菌O∶9,有類似的脂多糖O-鏈,在檢測中極易造成誤檢。同時(shí),iELISA還無法對(duì)自然感染和接種疫苗所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行鑒別,但對(duì)豬布病進(jìn)行大規(guī)模篩查時(shí),仍是一種極為有效的鑒別方法。

為解決耶爾森氏菌O∶9所導(dǎo)致的檢測假陽性和無法判斷抗體產(chǎn)生原因的問題,實(shí)驗(yàn)人員發(fā)明了cELISA,即待測游離抗原與固定于載體上的抗原一起競爭相同的抗體。cELISA鑒別的關(guān)鍵在于所使用的抗體,親和力介于疫苗和自然感染所產(chǎn)生的抗體之間,針對(duì)脂多糖O-鏈特異表位的單克隆抗體。1990年,Macmillan A P首次使用cELISA對(duì)牛布病進(jìn)行診斷,結(jié)果表明,該方法不僅可對(duì)耶爾森氏菌O∶9進(jìn)行鑒別,還可對(duì)布病疫苗和自然感染進(jìn)行區(qū)分[28]。cELISA的敏感性低于iELISA,但高于RBT,在檢測疫苗接種豬和假陽性樣品時(shí),特異性高于iELISA和RBT。因此,cELISA更適用于對(duì)高患病率豬群進(jìn)行檢測。但無論是iELISA還是cELISA,都存在重現(xiàn)性不好、實(shí)驗(yàn)要求多,無法對(duì)多種病菌同時(shí)檢出的缺點(diǎn),因此有時(shí)需同時(shí)使用其他檢測方法進(jìn)行輔助診斷。

3.2.3 熒光偏振檢測法 熒光偏振檢測法(fluorescence polarization assay,FPA)是由Nielsen和Gall發(fā)明的一種基于分子旋轉(zhuǎn)特性,對(duì)抗原抗體相互作用進(jìn)行檢測的診斷技術(shù)。FPA分為試管法和玻片法,檢測原理是對(duì)分子質(zhì)量為22 ku的布魯氏菌進(jìn)行熒光染料標(biāo)記,該染料可被相應(yīng)的平面偏振光所激發(fā)。分子大小是影響分子在溶液中旋轉(zhuǎn)速率的關(guān)鍵因素。當(dāng)存在布魯氏菌抗體時(shí),熒光標(biāo)記的抗原與抗體特異性結(jié)合,導(dǎo)致抗原分子質(zhì)量增大,進(jìn)而使旋轉(zhuǎn)速率(偏振值)減小,速率減小程度可通過熒光偏振儀進(jìn)行測定[29-30]。同時(shí),FPA作為一種同質(zhì)分析,無需對(duì)檢測樣本進(jìn)行分離,只需在每次檢測時(shí)進(jìn)行空白或背景讀取,因此均有簡便快捷的優(yōu)點(diǎn)。

Nielsen等使用FPA和其他4種檢測方法(iELISA、cELISA、CFT、BPAT)同時(shí)對(duì)14 431份布魯氏菌血清樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,無論檢測陰性樣本還是陽性樣本,FPA檢測準(zhǔn)確性均高于其他檢測方法[30]。任燕斌等[31]同時(shí)使用FPA、iELISA及cELISA對(duì)牛布魯氏菌血清樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果證明FPA的特異性最高,為100%。FPA對(duì)豬布病進(jìn)行檢測時(shí),也可以去除大部分由耶爾森氏菌O∶9所造成的非特異性抗體。FPA因具有準(zhǔn)確性高,特異性強(qiáng),簡便快速 成本低的優(yōu)點(diǎn),是《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》所指定的檢測手段,在豬布病檢測方面發(fā)揮著重要作用。但FPA不能完全消除由于疫苗接種產(chǎn)生的殘留抗體的影響,所以與所有其他血清學(xué)檢測一樣,陽性反應(yīng)應(yīng)采用適當(dāng)?shù)尿?yàn)證手段進(jìn)行調(diào)查。

3.2.4 免疫膠體金技術(shù) 自1875年法拉第發(fā)現(xiàn)可從氯金酸水溶液中制備膠體金后,免疫膠體金技術(shù)(immune colloidal gold technique,GICT)便應(yīng)具有標(biāo)志物穩(wěn)定、應(yīng)用范圍廣、檢測結(jié)果可視化的特點(diǎn),被迅速應(yīng)用于大規(guī)模的傳染病初篩和現(xiàn)場檢測。GICT是以膠體金為顯色標(biāo)志物,利用抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)原理,所發(fā)展起來的一種新型免疫標(biāo)記檢測技術(shù)。

Kim等建立了對(duì)犬種布魯氏菌的進(jìn)行檢測的GICT方法,并與細(xì)菌培養(yǎng)鑒定法和凝集試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果表明GICT擁有等同的敏感性和特異性[32]?？子穹降萚33]利用布魯氏菌OMP22和OMP28的混合蛋白作為診斷抗原,發(fā)明了一種可對(duì)布病進(jìn)行特異性檢出的膠體金快速檢測試紙條。目前,在我國,應(yīng)用GICT對(duì)包括豬布病在內(nèi)的各種布病的檢驗(yàn)尚無完整的法律法規(guī),因此相關(guān)的診斷技術(shù)尚未被廣泛應(yīng)用,具有極大的研究前景。

在免疫學(xué)領(lǐng)域,除了上述提及的血清凝集試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光偏振檢測法、免疫膠體金技術(shù)以外,免疫組化法、變態(tài)反應(yīng)中的布魯氏菌皮膚試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、乳汁環(huán)狀試驗(yàn)可能不適用于豬布病檢測,但在其他樣本的布魯氏菌檢測中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。對(duì)疫苗接種和自然感染所產(chǎn)生的布魯氏菌抗體進(jìn)行區(qū)分,以及對(duì)耶爾森氏菌O∶9造成的假陽性進(jìn)行鑒別一直是布病血清試驗(yàn)中普遍存在的兩個(gè)關(guān)鍵問題,因此任何一種免疫學(xué)方法對(duì)樣本檢測呈陽性時(shí),都應(yīng)使用其他方法對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 分子生物學(xué)方法

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)一經(jīng)發(fā)明,就因高特異性和高靈敏性被應(yīng)用于人類生活的方方面面,尤其在病原體檢測上應(yīng)用最為廣泛。待測基因的選擇直接決定著PCR檢測能否成功,檢測結(jié)果是否可信。IS711作為布魯氏菌所特有的基因,是布病診斷中最常用的基因,per和bcsp313也可用于布病檢測。1994年,Bricher B J等[34]首次建立了布魯氏菌的PCR檢測方法(AMOS-PCR)。AMOS-PCR只能鑒別1型豬布魯氏菌,無法對(duì)2、3、4型豬種布魯氏菌進(jìn)行區(qū)分。此外,PCR擴(kuò)增后,需通過凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判讀,在電泳過程中,極易造成氣溶膠污染,產(chǎn)生假陽性。熒光定量PCR (qPCR)通過對(duì)熒光信號(hào)的采集,即可對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行判斷,相比于普通PCR,具有定性定量,簡單快捷,可減少氣溶膠污染的優(yōu)點(diǎn)。Kaden R等[35]開發(fā)了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),可用于特異檢測布魯氏菌的所有生物變種。此外,核酸探針技術(shù)、單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(LAMP)、微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)、基因芯片等分子生物學(xué)技術(shù)均可用于包括豬布病在內(nèi)的布病診斷。如Liu J Y等[36]使用ddPCR對(duì)人血中的布魯氏菌進(jìn)行檢測,檢測靈敏度達(dá)1.87拷貝;Shukla J L等[37]開發(fā)了一種針對(duì)布魯氏菌bcsp31基因的快速、有效、靈敏的LAMP PCR檢測方法,可以在35 min內(nèi)通過目視檢測到低至8 fg的DNA。分子生物學(xué)的檢測原理不同于免疫學(xué)的抗原抗體相互結(jié)合,是從基因水平上對(duì)待測樣本進(jìn)行鑒別,因此不受到耶爾森氏菌O∶9的影響。同時(shí),針對(duì)免疫學(xué)上無法對(duì)野毒感染和疫苗接種進(jìn)行區(qū)分的問題,在分子生物學(xué)上也可得到有效解決。目前,豬群接種的豬布病疫苗多為減毒活疫苗,即細(xì)菌的毒力基因或免疫逃逸基因發(fā)生缺失。使用多重?zé)晒舛縋CR檢測時(shí),可同時(shí)對(duì)豬布魯氏菌的毒力缺失基因和保守基因進(jìn)行檢測,若缺失基因和保守基因均有明顯擴(kuò)增曲線,則為自然感染,只有目標(biāo)基因擴(kuò)增時(shí),為疫苗接種感染。

4 豬布病的預(yù)防

對(duì)布魯氏菌病進(jìn)行預(yù)防的最好方式便是對(duì)牲畜定期接種疫苗.用于牛的S19和RB51疫苗株和用于羊的Rev.1疫苗株是國際上用于布病診斷的主要疫苗株[3]。目前我國所使用布病疫苗多為活疫苗, 分別是A19疫苗株、M5疫苗株、S2疫苗株。A19疫苗株主要用于牛,20世紀(jì)70年代后廣泛用于我國的牛布病預(yù)防。M5株疫苗主要用于羊,近年來中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所以M5-90株為親本株,研制了M5-90? 26株,使用配套的ELISA(bp26)檢測方法可以實(shí)現(xiàn)鑒別診斷。S2株是中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的,分離自流產(chǎn)母豬,在我國廣泛應(yīng)用與羊和牛的疫苗株,也可以用于豬布病的免疫,是世界上唯一一個(gè)可以用于免疫豬的疫苗。S2疫苗株具有給藥途徑多,口服使用安全,不易感染人等優(yōu)點(diǎn)。但S2疫苗株免疫持續(xù)時(shí)間短,需要每年定期接種[38]。

除接種疫苗以外,還可通過以下措施對(duì)豬布病進(jìn)行預(yù)防。(1)對(duì)豬群進(jìn)行定期檢疫,如發(fā)現(xiàn)可疑患病豬,應(yīng)立即進(jìn)行隔離撲殺;(2)對(duì)豬場進(jìn)行定期消毒,尤其是出現(xiàn)過流產(chǎn)胎兒的豬場;(3)培養(yǎng)健康種豬,在2月齡和在4月齡各檢疫1次;(4)對(duì)病豬進(jìn)行嚴(yán)格的無害化處理。