陳文奕　陳惠萍

關(guān)鍵詞：GA；蛋白酶體；水稻糊粉層；貯藏蛋白；種子萌發(fā)

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

禾谷類種子的胚乳由淀粉性胚乳及外層的糊粉層構(gòu)成。成熟的糊粉層細(xì)胞仍具有活性，其形態(tài)為規(guī)則的多邊形，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、淀粉和維生素等物質(zhì)[1-2]。水稻糊粉層細(xì)胞內(nèi)的貯藏蛋白以清蛋白及球蛋白為主，大多數(shù)積累在液泡內(nèi)從而形成蛋白質(zhì)貯藏液泡（protein storage vacuoles，PSVs）[3-4]。赤霉素（gibberellic acid， GA）是植物生長和發(fā)育過程中重要的調(diào)節(jié)激素。在禾谷類種子萌發(fā)過程中，胚會(huì)釋放出GA 誘導(dǎo)糊粉層細(xì)胞合成一系列的酸性水解酶（如α-淀粉酶、核酸酶、蛋白酶等）[5-6]，這些酶會(huì)在中央大液泡破裂后釋放，并用于降解淀粉性胚乳中貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)，為種子萌發(fā)提供營養(yǎng)[7]。與此同時(shí)，糊粉層細(xì)胞內(nèi)的貯藏蛋白在水稻種子萌發(fā)過程被胚生長所利用[8]。

26S 蛋白酶體是一種依賴ATP，并能水解泛素化蛋白的蛋白酶復(fù)合物，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)降解，對(duì)于蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[9-10]。26S 蛋白酶體控制著植物體內(nèi)平衡的各種過程，包括植物發(fā)育、光反應(yīng)、細(xì)胞分裂及響應(yīng)植物激素反應(yīng)等[9， 11-12]，并且與植物防御相關(guān)[13]，其功能的喪失會(huì)顯著影響植物的生長[14]。研究表明，26S 蛋白酶體是種子萌發(fā)過程中所必需的，它能降解ABA 信號(hào)傳導(dǎo)及合成的正調(diào)節(jié)因子，從而打破種子休眠并促進(jìn)萌發(fā)[15]；以及維持?jǐn)M南芥地上部分器官的大小及細(xì)胞增殖速率等[16]。

DELLA 蛋白是GA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心，在植物生長調(diào)控中充當(dāng)生長抑制因子[17-18]。外源GA 可通過誘導(dǎo)26S 蛋白酶體降解DELLA 蛋白來促進(jìn)大麥幼苗的生長[19]，而GA 生物合成抑制劑及26S 蛋白酶體抑制劑均能抑制DELLA 蛋白的降解[20]。由此可見，GA 信號(hào)傳導(dǎo)在26S 蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解中起著重要的作用。

26S 蛋白酶體由2 個(gè)不同功能的亞復(fù)合體組成，即20S 蛋白酶體和19S 調(diào)節(jié)顆粒[21]。20S 蛋白酶體是一個(gè)桶形結(jié)構(gòu)，由2 個(gè)相同的外α 環(huán)和2 個(gè)相同的內(nèi)β 環(huán)堆疊組成，使20S 蛋白酶體具有α_1-7β_1-7β_1-7α_1-7的雙重對(duì)稱性結(jié)構(gòu)，14 個(gè)α 亞基和14 個(gè)β 亞基的正確組裝確保了20S 蛋白酶體的完整性[22-24]。20S 蛋白酶體上含有β1、β2 和β5三種蛋白酶活性位點(diǎn)，并形成蛋白水解室，而19S調(diào)節(jié)顆粒的作用是識(shí)別泛素化蛋白，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到20S 蛋白酶體的蛋白水解室內(nèi)進(jìn)行降解[25-26]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，多種蛋白質(zhì)可以被20S 蛋白酶體本身降解，而不需要與19S 調(diào)節(jié)顆粒結(jié)合后發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用[27-28]。20S 蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程不依賴泛素化及ATP，在氧化應(yīng)激后，20S 蛋白酶體活性升高，從而快速降解氧化損傷的蛋白質(zhì)[29-30]。20S 蛋白酶體β 亞基1（20S proteasomeβ subunit1， PBA1）是一種具有催化活性的半胱氨酸蛋白酶，已證實(shí)其參與PCD 的發(fā)生[31]。在銀誘導(dǎo)葡萄懸浮細(xì)胞的PCD 過程中，PBA1 專一性抑制劑AC-APnLD-CHO 可使26S 蛋白酶體功能受損，伴隨著多泛素蛋白的增加[32]。

本研究通過借助酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)等，探究蛋白酶體及其亞基PBA1 參與GA 對(duì)萌發(fā)水稻種子糊粉層中貯藏蛋白的調(diào)節(jié)過程，為深入研究GA 調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)水稻糊粉層中蛋白質(zhì)降解的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為水稻（Oryza sativa L.）雜交種特優(yōu)128，購自海南省儋州市種子公司。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng) 選取去除穎殼后的水稻種子，用0.1%高錳酸鉀消毒10 min，用純水將其洗干凈后，分別置于添加不同處理液的培養(yǎng)皿中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，萌發(fā)水稻種子分別在浸泡1～9 d 后取出，使用手術(shù)刀片分離水稻種子糊粉層用于檢測相應(yīng)的指標(biāo)。

本研究設(shè)置2 個(gè)處理組。處理1：（1）CK（純水）；（2）GA（50 μmol/L）；（3）GA 合成抑制劑烯效唑（Uniconazole，Uni，75 μmol/L）。處理2：（1）CK（DMSO）；（2）26S 蛋白酶體活性抑制劑MG132（50 μmol/L）。

1.2.2 植物糊粉層總蛋白提取及含量測定 本實(shí)驗(yàn)采用Solarbio 公司的植物蛋白提取試劑盒（BC3720）進(jìn)行水稻糊粉層總蛋白的提取。稱取100 mg 的水稻糊粉層放入液氮中速凍（最好過夜），取出糊粉層于含液氮的研缽中研磨成粉末，加入1 mL 裂解液后，置于4 ℃裂解20 min。4 ℃，14 000 r/min 離心30 min 后收集上清，上清即為水稻糊粉層總蛋白。采用BCA 法測定上清液中總蛋白含量，每組樣品重復(fù)3 次。

1.2.3 26S 蛋白酶體、20S 蛋白酶體和PBA1 活性測定 稱取糊粉層100 mg，使用液氮研磨成粉末，加入900 μL 0.01 mol/L PBS 緩沖液（pH7.2～7.4），在4 ℃下5000 r/min 離心15 min，吸取上清液至預(yù)冷離心管中備用。本試驗(yàn)分別采用江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司的植物26S 蛋白酶體、20S蛋白酶體及20S 蛋白酶體β 亞基1（PBA1）的ELISA 檢測試劑盒進(jìn)行檢測，使用全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（AMR-100）測定其在450 nm 處的吸光度。分別將原倍標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后，制作出26S 蛋白酶體、20S 蛋白酶體及PBA1 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，依照其標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出酶活性。每組樣品重復(fù)3 次。

1.2.4 總RNA 提取及cDNA 合成 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選取水稻糊粉層50 mg，采用天根生化公司產(chǎn)品（DP441）植物總RNA 提取試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，并稍加修改。制取1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳15 min，利用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測所提取的RNA 完整性。使用微量核酸檢測儀檢測RNA 純度及濃度，然后將RNA 定量為100 ng/μL，以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

以定量的水稻總RNA 為模板，使用TaKaRa公司的產(chǎn)品PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser（RR047A）合成cDNA?？偡磻?yīng)體系為20 μL。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 本實(shí)驗(yàn)采用biosharp公司的產(chǎn)品熒光定量試劑盒SYBR Green MasterMix（BL705A）。以cDNA 為模板，OsActin 為內(nèi)參基因，OsPBA1 為目的基因檢測的表達(dá)水平，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。相應(yīng)基因引物序列如表1 所示。

1.2.6 胚根長和胚芽長的測量 在不同處理中隨機(jī)選取培養(yǎng)5 d 的萌發(fā)水稻種子10 粒，使用直尺測量其胚根長度和胚芽長度，并取3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所測量的平均值進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行處理，并用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻種子萌發(fā)過程中糊粉層細(xì)胞總蛋白含量的變化

圖1A 為水稻種子萌發(fā)1～9 d 的長勢，與純水培養(yǎng)相比，GA 處理明顯促進(jìn)水稻種子的萌發(fā)，而GA 合成抑制劑Uni 處理后，水稻種子的萌發(fā)受到抑制。如圖1B 所示，純水、GA 和GA 合成抑制劑Uni 處理的水稻糊粉層在種子萌發(fā)過程中，總蛋白含量均隨著時(shí)間的增加而逐漸降低。在2～9 d，與對(duì)照相比，GA 處理的糊粉層中，總蛋白含量顯著降低；而GA 合成抑制劑Uni 處理的糊粉層中總蛋白含量一直維持在較高水平。以上結(jié)果表明，外源GA 可加快糊粉層中蛋白質(zhì)的降解，從而促進(jìn)水稻種子的萌發(fā)，而GA 合成抑制劑Uni 則減緩糊粉層中蛋白質(zhì)的降解，抑制水稻種子的萌發(fā)。

2.2 水稻種子萌發(fā)過程中糊粉層26S 蛋白酶體及20S 蛋白酶體活性的變化

由圖2A 可知，26S 蛋白酶體活性在水稻種子萌發(fā)1～6 d 呈現(xiàn)上升的趨勢，并在6 d 時(shí)達(dá)到最高活性水平；在7～9 d 時(shí)，26S 蛋白酶體活性水平逐漸下降。該結(jié)果表明在水稻種子萌發(fā)過程中糊粉層細(xì)胞中的26S 蛋白酶體活性具有依賴時(shí)間的效應(yīng)。

如圖2B 所示，在水稻種子萌發(fā)1～7 d 時(shí)，糊粉層中20S 蛋白酶體活性逐漸上升，并在第7 天時(shí)達(dá)到峰值，隨后其活性逐漸下降。表明20S 蛋白酶體活性在水稻種子萌發(fā)過程中同樣具有依賴時(shí)間的效應(yīng)。

綜合以上結(jié)果，在水稻種子萌發(fā)過程中，糊粉層細(xì)胞中含有活性的26S 蛋白酶體和20S 蛋白酶體，二者的活性均隨著萌發(fā)時(shí)間的增加而變化，且20S 蛋白酶體活性比26S 蛋白酶體活性遲1 d達(dá)到最高峰。

2.3 水稻種子萌發(fā)過程中OsPBA1 表達(dá)水平及PBA1 活性的變化

OsPBA1 在水稻種子萌發(fā)過程出現(xiàn)2 個(gè)表達(dá)峰值，OsPBA1 的相對(duì)表達(dá)量在1～5 d 隨時(shí)間的增加而上升，并在第5 天達(dá)到第一個(gè)表達(dá)峰值，約為1 d 的6.24 倍；在6～7 d，其相對(duì)表達(dá)量開始下降，而第8 天時(shí)，表達(dá)量明顯升高，出現(xiàn)第二個(gè)表達(dá)峰值，其表達(dá)量約為1 d 的5.4 倍，隨后糊粉層中OsPBA1 的表達(dá)量開始下降（圖3A）。

如圖3B 所示，在水稻種子萌發(fā)過程中，糊粉層細(xì)胞中PBA1 活性的變化趨勢與OsPBA1 轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢類似。在1～5 d，PBA1 活性隨時(shí)間的延長而上升，并在第5 天達(dá)到第一個(gè)峰值；在6～7 d，PBA1 活性下降，第8 天時(shí)出現(xiàn)上升的趨勢，并達(dá)到第二個(gè)峰值，該峰值低于5 d 的活性峰值；隨后，水稻糊粉層細(xì)胞中的PBA1 活性開始下降。

以上結(jié)果表明，OsPBA1 表達(dá)水平和PBA1活性隨著種子萌發(fā)時(shí)間的增加而變化，PBA1 可能以依賴時(shí)間的方式調(diào)控水稻種子的萌發(fā)過程。

2.4 GA 及GA 合成抑制劑對(duì)水稻糊粉層中26S蛋白酶體、20S 蛋白酶體及PBA1 活性的影響

如圖4A 所示，與對(duì)照相比，GA 處理5 d 的水稻糊粉層中26S 蛋白酶體的活性升高了9.97%（P<0.05），而GA 合成抑制劑Uni 處理5 d 則使26S 蛋白酶體的活性降低了8.67%（P<0.05）。同樣，與對(duì)照相比，GA 處理5 d 的水稻糊粉層中20S 蛋白酶體和PBA1 的活性分別提高了17%（P<0.05）和35.09%（P<0.05），而GA 合成抑制劑Uni 處理5 d 后，20S 蛋白酶體和PBA1 的活性則分別降低了22.92%（P<0.05）和24.93%（P<0.05）（圖4B、圖4C）。

以上結(jié)果表明GA 對(duì)水稻糊粉層中26S 蛋白酶體、20S 蛋白酶體和PBA1 的活性均具有促進(jìn)作用，而GA 合成抑制劑Uni 則起著抑制作用。

2.5 MG132 對(duì)水稻生長狀態(tài)及糊粉層中26S蛋白酶體、20S 蛋白酶體和PBA1 活性的影響

使用MG132 處理5 d 后，水稻種子的生長明顯受到抑制，其胚根和胚芽的長度短于對(duì)照的長度（圖5A、圖5B、圖5C）。由圖5D 可知，與對(duì)照相比，MG132 處理的水稻糊粉層26S 蛋白酶體活性降低了31.75%（P<0.05），該結(jié)果表明MG132 能夠有效抑制26S 蛋白酶體的活性，且在種子萌發(fā)過程中，26S 蛋白酶體的活性與其萌發(fā)表型相關(guān)。

從圖5E 可知，與對(duì)照相比，MG132 處理的糊粉層中20S 蛋白酶體活性升高了25.63%（P<0.05），表明MG132 處理可以推進(jìn)26S 蛋白酶體的解離，導(dǎo)致游離20S 蛋白酶體的活性上升。通過進(jìn)一步檢測MG132 對(duì)PBA1 活性的影響發(fā)現(xiàn)，在相同處理下，PBA1 活性的變化與20S 蛋白酶體活性的變化一致。與對(duì)照相比，MG132 處理的水稻糊粉層中，PBA1 活性升高71.37%（P<0.05），表明26S 蛋白酶體的正常組裝受到抑制后，亞基PBA1 的活性會(huì)上調(diào)（圖5F）。

以上結(jié)果表明，MG132 可抑制萌發(fā)水稻種子的生長，且對(duì)水稻糊粉層26S 蛋白酶體的組裝亦具抑制作用，從而導(dǎo)致20S 蛋白酶體活性及其亞基PBA1 活性的上升。

3 討論

通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasomesystem， UPS）調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平是真核生物中最復(fù)雜和最普遍的途徑之一，UPS 可通過降解受損蛋白質(zhì)、錯(cuò)誤折疊蛋白或短壽命的調(diào)節(jié)蛋白，從而保證功能蛋白的正常工作[33-35]。UPS 對(duì)蛋白質(zhì)的降解是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程，底物蛋白質(zhì)首先通過泛素激活酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素結(jié)合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）和泛素連接酶（ubiquitin-protein ligase， E3）的協(xié)同作用被多泛素化，隨后泛素化蛋白質(zhì)被UPS 的核心26S 蛋白酶體識(shí)別并降解為小肽或氨基酸[36-37]。26S 蛋白酶體在植物生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，可通過選擇性降解蛋白質(zhì)，從而高效控制許多細(xì)胞過程[38-39]。

研究表明，GA 可在種子萌發(fā)過程中促進(jìn)水解酶的分泌，加速了貯藏物質(zhì)的分解，為種子萌發(fā)提供營養(yǎng)[40]。在本研究中，通過觀察萌發(fā)水稻種子的長勢及檢測總蛋白的含量發(fā)現(xiàn)，使用GA 處理水稻種子時(shí)，促進(jìn)糊粉層中貯藏蛋白的降解，從而加快水稻種子的萌發(fā)進(jìn)程；而在GA 合成受到抑制時(shí)，糊粉層中貯藏蛋白的降解受到阻礙，水稻種子的萌發(fā)則受到抑制。26S 蛋白酶體在激素信號(hào)傳導(dǎo)方面是保守的，GA 可誘導(dǎo)26S 蛋白酶體靶向降解蛋白質(zhì)，從而促進(jìn)種子萌發(fā)及果實(shí)發(fā)育等[18， 41]，但對(duì)于其中機(jī)制還待進(jìn)一步研究。

在水稻種子萌發(fā)1～9 d，20S 蛋白酶體亞基PBA1 的活性及其編碼基因OsPBA1 的表達(dá)水平出現(xiàn)2 個(gè)峰值，在5 d 達(dá)到第一個(gè)峰值，而26S蛋白酶體在其達(dá)到峰值的后1 d，26S 蛋白酶體的活性才隨之達(dá)到峰值，由此可知，PBA1 水平的升高可促使26S 蛋白酶體活性升高。NGUYEN 等[42]研究證實(shí)，PBA1 的基因表達(dá)能以特異性方式調(diào)節(jié)26S 蛋白酶體活性。在本研究中，20S 蛋白酶體活性在7 d 達(dá)到峰值，該峰值在26S 蛋白酶體活性下降期間，可見，26S 蛋白酶體在解離為20S蛋白酶體及19S 調(diào)節(jié)顆粒后，游離20S 蛋白酶體水平增加并達(dá)到峰值。有研究表明，在植物發(fā)育和脅迫反應(yīng)過程中，調(diào)節(jié)26S 蛋白酶體和20S 蛋白酶體之間的比例具有重要意義。在植物衰老過程，26S 蛋白酶體活性的下降通常伴隨著20S 蛋白酶體活性的上升，以增加植物細(xì)胞降解氧化蛋白的能力[14， 43-44]。本研究中PBA1 的活性及OsPBA1 的表達(dá)水平在8 d 達(dá)到第二個(gè)峰值，該峰值出現(xiàn)在20S 蛋白酶體活性下降期間，即20S 蛋白酶體活性的降低推動(dòng)PBA1 的活性及OsPBA1的表達(dá)水平達(dá)到第二個(gè)峰值。

在本研究中，使用GA 及GA 合成抑制劑Uni處理水稻種子，發(fā)現(xiàn)GA 能夠誘導(dǎo)PBA1 活性升高，進(jìn)而上調(diào)20S 蛋白酶體及26S 蛋白酶體活性，而Uni 對(duì)該過程起著抑制作用。有研究證實(shí)，RPX是植物體內(nèi)的蛋白酶體基因表達(dá)調(diào)控因子，它與26S 蛋白酶體亞基的編碼基因啟動(dòng)子結(jié)合后，能誘導(dǎo)PBA1 的蛋白質(zhì)水平升高，并調(diào)節(jié)蛋白酶體的活性增加[42]。而敲除20S 蛋白酶體亞基PBE1會(huì)影響26S 蛋白酶體的組裝，致使其活性下降[45]。

為了進(jìn)一步研究在藥物抑制26S 蛋白酶體活性時(shí)，水稻種子生長及20S 蛋白酶體和PBA1 的活性所受到的影響，本研究使用了26S 蛋白酶體活性抑制劑MG132 處理水稻種子。當(dāng)抑制26S蛋白酶體活性后，萌發(fā)水稻種子的生長也受到抑制，表明26S 蛋白酶體在植物生長過程起著重要作用。CHIU 等[15]研究證實(shí)，使用MG132 處理抑制了擬南芥種子的萌發(fā)，直接處理擬南芥胚胎則完全抑制胚胎的生長。當(dāng)26S 蛋白酶體活性受到抑制時(shí)，20S 蛋白酶體亞基PBA1 反饋上調(diào)，從而出現(xiàn)了20S 蛋白酶體活性的增加，這點(diǎn)得到了他人實(shí)驗(yàn)的支持。在19S 調(diào)節(jié)顆粒亞基基因突變或MG132 處理導(dǎo)致26S 蛋白酶體活性降低的植株中，出現(xiàn)其他亞基基因的反饋上調(diào)，伴隨著20S蛋白酶體活性的增加[29， 46-47]。在哺乳動(dòng)物中同樣觀察到26S 蛋白酶體活性受抑制后，其亞基基因反饋上調(diào)的情況[48]。

綜合以上結(jié)果可知，在水稻種子萌發(fā)過程中，GA 通過誘導(dǎo)PBA1 的活性升高，調(diào)節(jié)20S 蛋白酶體的活性，進(jìn)而介導(dǎo)26S 蛋白酶體的組裝，并以此介導(dǎo)26S 蛋白酶體依賴性降解貯藏蛋白，加快種子萌發(fā)的進(jìn)程。