茶多酚的提取分離技術(shù)與其體外抗氧化活性研究

徐錦添，張晨曦，張 宇

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2. 黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥研究所，黑龍江 哈爾濱 150036）

0 引言

茶葉，俗稱“茶”。一般指茶樹的芽、葉。茶葉起源于中國，具有悠久的食用歷史，被認(rèn)為是世界三大天然植物飲料之一。從菜食、藥用發(fā)展為飲品。其市場龐大，歷史悠久，大多種植在長江以南各地。

茶葉作為一種傳統(tǒng)的沖泡飲品，種類風(fēng)味豐富多樣，具有一定的保健功能。經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)研究證實，茶葉中含有豐富的有機化學(xué)成分與無機礦物質(zhì)元素。其中，有機化學(xué)物質(zhì)包括茶多酚、咖啡因、維生素、有機酸、氨基酸等。茶多酚（Tea polyphenols，TP）是茶葉中多羥基酚類化合物及其衍生物的總稱，包括酮類、黃酮醇類、酚酸類、兒茶素及花青素等。是茶葉中最重要的組成成分，占茶葉干質(zhì)量的20%～30%[1]，具有諸多活性作用，如抗輻射、抑菌、抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫力、降血脂、抗凝血、抑制心腦血管疾病等功能[2]。同時，茶多酚也憑借其特性被應(yīng)用在食品、日化、印染等行業(yè)，被用作保鮮劑、抗氧化劑、染劑、除臭劑等。因此，茶多酚這種天然活性物質(zhì)具備著良好且廣闊的發(fā)展應(yīng)用前景。

簡略介紹了茶多酚的藥用價值，并對茶多酚的提取分離技術(shù)及其優(yōu)劣進行綜述，包括茶多酚抗氧化活性的研究方法，最后對茶多酚的研究前景進行展望，以期為在相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考。

1 茶多酚的藥用價值

1.1 抗氧化作用

自由基（Free radicals，F(xiàn)R） 是具有強氧化性的機體代謝產(chǎn)物。在正常生理狀態(tài)下，機體會通過過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD） 等發(fā)生一系列反應(yīng)進而達到保護細(xì)胞的目的，使機體內(nèi)自由基保持動態(tài)平衡。但當(dāng)機體受（如超聲、輻射、心理壓力等） 應(yīng)激原刺激影響會使得機體自由基增多，進而影響其平衡狀態(tài)。而茶多酚（TP） 能夠提高抗氧化酶系活力、抑制氧化酶系；亦可與自由基競爭結(jié)合，達到終止自由基鏈反應(yīng)的目的；也能直接作用于自由基，抑制脂自由基生成[3]。茶多酚這一天然活性物質(zhì)以天然抗氧化劑的身份被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。在抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等領(lǐng)域均有茶多酚的研究與應(yīng)用。

1.2 抗腫瘤作用

癌癥作為人們談之色變的疾病之一，威脅著人們的生命安全。其病因諸多，如飲食習(xí)慣的不正確、心情低落抑郁、免疫力低下、生活不規(guī)律等。而癌癥的發(fā)病機制也十分復(fù)雜，關(guān)聯(lián)年齡、基因、性別等因素。已有研究表明，在細(xì)胞、動物試驗中，茶多酚能夠?qū)崿F(xiàn)對諸多腫瘤的抑制作用，包括活化免疫細(xì)胞，促進細(xì)胞因子分泌、調(diào)控細(xì)胞信號通路及阻滯腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期等作用機制，達到抑制腫瘤進展，實現(xiàn)抗腫瘤作用的目的[4-7]。此外，針對茶多酚在腫瘤的治療、影像等方面均有研究，如蔡宇[8]對茶多酚- Fe 配位聚合物的應(yīng)用研究等。因此，茶多酚在腫瘤治療方向具有良好的臨床轉(zhuǎn)化及應(yīng)用潛力。

1.3 心腦血管疾病的防治

經(jīng)濟的發(fā)展與生活方式的轉(zhuǎn)變，尤其是飲食結(jié)構(gòu)與生活方式的改變，使得心腦血管疾病的發(fā)病率與死亡率逐漸增高。心腦血管疾病嚴(yán)重威脅著中老年群體的健康，且年輕化趨勢顯著。眾多研究表明，茶葉中茶多酚兼具保健功能與藥理活性。飲茶能夠抑制心腦血管疾病，降低心腦血管病風(fēng)險。對預(yù)防心腦血管疾病具有良好的保健作用。茶多酚中主要活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG） 可作用血管平滑肌細(xì)胞（VCMCs） 的外泌體進而改善血管鈣化[9]。Xinyan Wang 等人[10]研究顯示，茶葉的消費與動脈粥樣硬化性心血管疾病和全因死亡率的風(fēng)險降低有關(guān)，特別是在習(xí)慣性飲茶的群體中。劉崗等人[11]研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 可能通過調(diào)節(jié)低密度脂蛋白受體（LDL-R） （調(diào)節(jié)LDL-C 的細(xì)胞跨膜糖蛋白）的表達，進而促進低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C） 的內(nèi)吞作用。茶多酚可以降低血清總膽固醇（TC） 和甘油三酯（TG） 含量，抑制血栓的形成；擴張血管、降低血壓；同時，對心肺復(fù)蘇術(shù)后腦損傷、神經(jīng)退行性病變及創(chuàng)傷性腦損傷等擁有一定的保護作用[12]。

1.4 抗輻射作用

科技的迅速發(fā)展為民眾提供了便利。手機、電腦等現(xiàn)代電子產(chǎn)品易于獲得，使得人們暴露在電子產(chǎn)品、電視塔等的輻射環(huán)境中。長久暴露在輻射中可能會引起生物體細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷，進而引發(fā)基因突變與染色體畸變。李奇惠等人[13]通過60Co γ 射線對中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞（CHL） 和整體動物進行照射，觀察茶多酚對γ 射線損傷細(xì)胞染色體畸變及小鼠骨髓細(xì)胞微核形成的干預(yù)作用，證實了茶多酚具備抗輻射誘變的作用。此外，茶多酚還具備吸收放射性元素并抑制其分散等功能，但針對其抗輻射的詳細(xì)機制尚未明晰，有待研究。研究茶多酚的抗輻射機理，并借此進行防輻射藥品及功能性食品的研發(fā)應(yīng)用前景廣闊。

2 茶多酚的提取

2.1 溶液浸提法

茶多酚的提取方法繁多，其中溶液浸提法較為傳統(tǒng)。溶液浸提法依照浸提液的區(qū)分可分為水浸提法與有機溶劑萃取法2 種，主要基于茶多酚能夠溶于水與有機溶劑（如乙醇、甲醇、乙酸乙酯等） 的特性。這2 種方法優(yōu)劣各有不同，如水浸提法操作簡單快速、安全，且重復(fù)率好。主要操作包括研磨粉碎、沸水多次浸提、冷卻離心等。憑借其優(yōu)點廣泛出現(xiàn)在有關(guān)茶多酚的研究當(dāng)中。唐藝盟等人[14]利用酒石酸亞鐵法對茶多酚含量進行測定，優(yōu)化水浴浸提法中料液比等影響茶多酚浸提率的因素，結(jié)果表明在料液比1∶60，浸提時間10 min 條件下，茶多酚提取率最高為20.71%。但水浸提法存在如雜質(zhì)過多、純度低、易于氧化等缺點。而有機溶劑萃取法相較水浸提法氧化程度低、提取率較高。有機溶劑萃取法的流程包括研磨粉碎、有機溶劑萃取、真空濃縮后用氯仿萃取去雜、干燥等。

陳峰等人[15]采用響應(yīng)面法，采用甲醇對茶多酚進行提取，針對甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)及提取溫度進行優(yōu)化，得出的最優(yōu)提取方案為：采用66%的甲醇進行提取，粉碎后的茶粉與甲醇料液比為1∶25，提取溫度為70 ℃，浸提時間選為10 min，茶多酚的提取量為26.20 mg/g。謝雨尋等人[16]選用乙醇為溶劑，采用單因素試驗探究，將茶酒糟置入干燥箱干燥后粉碎并過篩，加入乙醇密封后進行水浴震蕩，最終得出結(jié)論，茶酒糟中茶多酚的最佳提取參數(shù)為：體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇，料液比1∶30，在提取溫度75 ℃，提取時間12 min 的條件下，茶多酚的提取量最高為41.52 mg/g。

溶液浸提法優(yōu)劣并存，重復(fù)度好、易操作的優(yōu)勢難掩其雜質(zhì)多、提取后期精制提純困難、溶劑易殘留、耗費量大且部分溶劑具有毒性等缺點，使得該方法在食品與醫(yī)藥行業(yè)難以采用。因此，更需要探索出一種更加綠色環(huán)保的提取方法。近年來，材料學(xué)的蓬勃發(fā)展使低共熔溶液成為一項熱點研究內(nèi)容。該綠色溶劑由離子型化合物與有機化合物通過氫鍵結(jié)合，無毒易降解[17]。阮懌航等人[18]經(jīng)研究選擇乳酸-甜菜堿構(gòu)建低共熔溶液體系，通過響應(yīng)面法分析優(yōu)化茶多酚提取的提取條件，在溶液含水率32.15%，時間46.79 min，溫度62.48 ℃的條件下，茶多酚提取率為15.42%。同時，對產(chǎn)品的抗氧化活性進行測定表明，低共熔溶液提取的茶多酚具備較強的抗氧化活性。由此可見，低共熔溶液在食品、保健品等領(lǐng)域良好的發(fā)展前景。

2.2 超聲波提取法

超聲波提取法具備成本低、有機溶劑用量較少、提取效率高及操作簡便等優(yōu)點，常用于對酚類、多糖等物質(zhì)的提取研究。超聲波提取法的原理主要是機械效應(yīng)、空化作用、熱效應(yīng)。超聲空化中產(chǎn)生壓力使得細(xì)胞破裂于溶劑中，同時其熱效應(yīng)與振動作用加速了有效物質(zhì)的溶解，進而提高提取率，也減少了物質(zhì)的氧化損失。

李培睿等人[19]通過正交試驗與單因素試驗對陳年綠茶中茶多酚的超聲輔助提取法進行工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，超聲功率40 W，超聲溫度60 ℃，超聲時間40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶25（g∶mL） 的條件下，茶多酚的提取率最佳為27.79%。同時，超聲輔提法能夠進行低溫浸提，減少產(chǎn)物的氧化分解。

王娟等人[20]通過單因素試驗及正交試驗對超聲輔提法提取茶多酚的工藝進行優(yōu)化，通過單因素試驗對料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲功率及超聲時間這5 個因素的范圍進行選擇并進行五因素四水平L16（45）正交試驗，分析得出最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，浸提時間40 min，提取溫度60 ℃，超聲功率350 W，料液比1∶120。此條件下，茶多酚的浸提率為14.53%。此外，與同工藝條件下的水浸提法相比，浸提效率提升了33.92%，效率提升顯著。

2.3 微波輔助提取法

微波輔助提取法是一種新的萃取技術(shù)，通過微波能進行物質(zhì)提取，又稱微波萃取。主要通過微波輻射過程中的高頻電磁波使胞內(nèi)溫度迅速上升，進而導(dǎo)致細(xì)胞破裂，物質(zhì)溶出。微波產(chǎn)生的電磁場將加速被提取物質(zhì)分子的熱運動，進而加速物質(zhì)的擴散速率。此方法易于操作，升溫迅速、節(jié)約能源，減少溶劑用量的同時能實現(xiàn)對不同組分的選擇性加熱，易于分離。即使造成的高溫可能使茶多酚有所損失，但其快速且均勻升溫的優(yōu)勢仍使得其浸提率高于常規(guī)水提。憑借微波輔助提取法的技術(shù)特點，被視作“綠色技術(shù)”常應(yīng)用于天然植物及動物組織等的成分提取，具備廣闊的應(yīng)用前景。

李剛鳳等人[21]通過正交試驗優(yōu)化試驗方案，結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，微波功率360 W，微波時間25 s，料液比1∶6，在此條件下得率27.64%。梁燕妮等人[22]通過正交試驗研究不同因素對茶多酚得率的影響，最終分析確定了最佳工藝，在微波功率900 W，微波時間11 min，微波溫度90 ℃的提取條件下，茶多酚的提取率最高為22.73%。此外，研究表明在微波輔提法中茶多酚得率影響最大的因素為微波溫度，微波功率次之，其原因可能與溫度促使成分的加速溶出有關(guān)。

2.4 樹脂吸附法

樹脂法是利用樹脂孔隙率高及其孔狀構(gòu)造的吸附優(yōu)勢，通過范德華力與被提取物質(zhì)結(jié)合。選取合適的樹脂與選擇性強的洗脫劑進行目標(biāo)組分的提取能達到較好的提取分離效果。依照不同類型的樹脂，可分為離子交換柱分離法、凝膠柱分離法及吸附柱分離法[23]。樹脂法提取茶多酚的效果取決于樹脂與洗脫劑的選擇。樹脂種類多樣，選擇性能較好的吸附樹脂應(yīng)參考其吸附量與脫附率。曹雪文等人[24]通過對DM-8，DM-16X，DM-130 型等12 種樹脂進行茶多酚吸附、脫附性能的比較分析最終得出結(jié)果，DM-16X 型樹脂（中極性） 是較為優(yōu)異的吸附樹脂。此外，還確定了最佳的脫附工藝條件，即吸附流速6 BV/h，脫附液為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，脫附液體積80 mL 且脫附液流速8 BV/h 條件下，吸附效果最為理想，動態(tài)洗脫率為91.63%，茶多酚純度高達76.57%。但應(yīng)注意茶多酚質(zhì)量濃度為1.51 mg/mL 的茶湯，在吸附過程中控制體積為12.5 BV。

樹脂吸附分離法具備能耗低、無毒無污染、工藝簡單、提取效果優(yōu)異及可反復(fù)利用等優(yōu)點，使得其被廣泛應(yīng)用于環(huán)境治理、醫(yī)藥等領(lǐng)域。但樹脂與吸附質(zhì)的作用力、樹脂壽命與價格及樹脂的重復(fù)利用等因素制約著該工藝投入大規(guī)模連續(xù)性生產(chǎn)。仍需對這些問題進行進一步探究。

2.5 鹽析法

鹽析法不同于其他通過對茶多酚粗提液進行萃取的方法，其原理主要是向溶液中加入無機鹽，進而降低高分子組分的溶解度使其沉淀析出再進行分離的過程。常見的用于鹽析法的無機鹽包括氯化鈉、硫酸銨、硫酸鈉等。目前，鹽析法主要應(yīng)用于中藥水提液、蛋白質(zhì)的分離等。

嚴(yán)明潮等人[25]利用高效液相色譜法探究鹽析法對兒茶素提取的影響并得出結(jié)論，當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%時，增加鹽含量利于兒茶素的分離，但鹽含量過高反而對產(chǎn)品得率產(chǎn)生不利的影響。此外，鹽析除對產(chǎn)品色澤有保護作用外，對產(chǎn)品的防潮性能產(chǎn)生了不利影響。其原理尚不明晰，這一問題有待解決。

2.6 離子沉淀法

離子沉淀法是依據(jù)被提組分茶多酚能夠與某些金屬離子物質(zhì)（如Mg2+，Al3+等） 絡(luò)合并形成沉淀的原理，進而實現(xiàn)分離茶多酚的目的。提取茶多酚通過對茶葉進行多次浸提，合并濾液后加入沉淀劑并調(diào)整pH 值，待沉淀完全后加酸溶解并過濾。使用乙酸乙酯萃取后蒸餾、干燥，得到產(chǎn)品。

易靈紅[26]通過對沉淀劑種類與用量、浸提溫度、浸提時間、溶劑用量這5 個因素進行探究，得出了利用離子沉淀法提取瑤山綠茶中茶多酚的最佳工藝條件，即選用AlCl3作為沉淀劑且茶葉質(zhì)量控制在沉淀劑質(zhì)量的5 倍，溶劑用量m水∶m茶葉= 20∶1，水浴浸提時間45 min，浸提溫度75 ℃的條件下，茶多酚的得率最高為14.12%。但在加入沉淀劑后，考慮沉淀完全導(dǎo)致pH 值變化的影響與Al3+的局限性，康玉瑩等人[27]在對離子沉淀法的工藝優(yōu)化中改為選擇含有Zn2+的溶液作為沉淀劑，通過試驗探究確定在以硫酸鋅溶液作為離子沉淀劑，m茶葉∶m沉淀劑= 50∶1，沉淀溫度控制在80 ℃，浸提時間為60 min、浸取液pH 值為6.0 時，茶多酚的提取率最為理想。王凱博等人[28]通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化工藝條件，研究確定m硫酸鋅∶m硫酸鋁= 4∶1 混合使用作為復(fù)合型沉淀劑效果最佳，產(chǎn)品得率10.9%，純度94.3%。

該方法具有操作簡單、成本低廉、選擇性強等優(yōu)勢，但也伴隨著茶多酚易于氧化、pH 值不穩(wěn)定等因素對產(chǎn)品得率及質(zhì)量的影響，且金屬離子的腐蝕性與毒害作用同樣對該方法的產(chǎn)業(yè)規(guī)模化應(yīng)用有所考驗。

2.7 超臨界萃取法

流體的壓力與溫度處于臨界點之上時的狀態(tài)稱之為超臨界流體（Supercritical Fluid，SCF）。其物理性質(zhì)通常介于氣體與液體之間，具備優(yōu)良的傳輸性能、流動性及溶解能力。在臨界點附近，微小的溫度或壓力的變化都將導(dǎo)致流體性質(zhì)的顯著變化[29]。超臨界萃取法是采用改變超臨界流體的溫度與壓力來實現(xiàn)其溶解能力的改變進而將萃取物提取分離的技術(shù)。該技術(shù)一般選用超臨界CO2作為萃取溶劑，因為其無毒、無味、惰性、無殘留、價格低廉等特點，被廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。因此，超臨界萃取法具有良好的潛力與發(fā)展前景。

葉春林等人[30]通過超臨界CO2萃取法對綠茶葉中茶多酚進行脫除。將茶葉樣品置于萃取釜中用CO2進行反復(fù)沖洗并排盡空氣，將超臨界流體調(diào)節(jié)至預(yù)定值后進行全循環(huán)流動萃取。并在后續(xù)進行了正交試驗及單因素試驗對工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明茶多酚的脫除率伴隨樣品含水量增加而增加，且因其溶于水的特性，含水量對其脫除率影響較大。李文婷等人[31]采用同樣的方法設(shè)計試驗，對該工藝進行探究結(jié)果表明，萃取壓力27 MPa，萃取溫度55 ℃，萃取時間50 min， 65%乙醇用量100 mL 條件下，得超臨界CO2提取50 g 炒青綠茶中茶多酚提取率為64.82%。王朝瑾等人[32]通過超臨界CO2對干茶葉樣品進行靜態(tài)、動態(tài)萃取后通過高效液相色譜法對試驗制品進行分析，該試驗制品兒茶素含量可達77.35%。通過設(shè)計正交試驗，得出超臨界CO2萃取綠茶中茶多酚的最佳條件為釜溫50 ℃，夾帶劑65%乙醇，壓力35 MPa，動態(tài)萃取時間1 h、靜態(tài)萃取時間1 h，茶多酚平均得率10.5%。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)分子擴散、流動形態(tài)等因素同樣對萃取率產(chǎn)生影響，并且在實際大規(guī)模連續(xù)化生產(chǎn)中還可能受到反應(yīng)釜容積與物料投入量等因素的制約。這也為該技術(shù)的實際投產(chǎn)應(yīng)用提供了問題引導(dǎo)與優(yōu)化方向。

2.8 酶工程提取法

酶具有高效性、專一性、反應(yīng)條件溫和等特點。近年來，將酶用于提取活性物質(zhì)的研究日漸增多。酶提取法無污染、效率高，而且能較大程度地保證被提組分的生物活性。在現(xiàn)今提倡綠色環(huán)保工業(yè)的背景下，既符合環(huán)保要求，又兼具高效的優(yōu)勢，因而備受關(guān)注。通過選取纖維素酶、果膠酶等對植物細(xì)胞壁進行軟化或者分解，增大被提取物質(zhì)分子與溶劑接觸的機會，有助于加快細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)成分的溶出。

黃德娜等人[33]利用纖維素酶與果膠酶復(fù)合作用對毛尖茶中的茶多酚進行提取。在單因素試驗的基礎(chǔ)上針對提取溫度與時間、pH 值等因素進行響應(yīng)面分析試驗，優(yōu)化后的酶提取工藝為提取溫度60 ℃，提取時間70 min，pH 值5.5 的條件下，茶多酚得率最高為22.39%。羅蘭心等人[34]采用相似的方法進行試驗，得出的優(yōu)化工藝方案：復(fù)合酶添加量1.2%（底物質(zhì)量計），料液比1∶20（mg∶L），酶解溫度48 ℃的條件下，茶多酚提取率為82.26 mg/g。此外，復(fù)合酶中纖維素酶與果膠酶的最佳質(zhì)量比為2∶3，酶解溫度對產(chǎn)品得率的影響最大。

利用酶法進行協(xié)同提取的研究并不少見，韓偉等人[35]采用酶法與β -環(huán)糊精協(xié)同超聲對茶多酚進行提取。在單因素方差試驗確定主要影響因素后，通過設(shè)計中心組合試驗對工藝參數(shù)進行優(yōu)化。最佳方案為β -環(huán)糊精0.69 g，纖維素酶0.57 mL，料液比1∶37，超聲溫度60 ℃，超聲時間60 min。此方案下茶多酚提取率可達13.87%，較傳統(tǒng)方法有明顯提高。因此，酶法的利用及協(xié)同提取技術(shù)的研究不僅實現(xiàn)了工藝上的綠色環(huán)保，也在效率上實現(xiàn)了提高。對天然活性成分提取工藝的研究開發(fā)與實際應(yīng)用具有重要的意義。

2.9 其他提取方法

除以上的提取方法外，針對茶多酚的提取還有其他方法。李石敬敏等人[36]以綠茶為原料，采用超聲—離子沉淀法對茶多酚的提取工藝進行研究。試驗以沉淀劑與原料質(zhì)量比、提取溫度、提取時間等因素為變量，通過紫外可見分光光度計對產(chǎn)品進行分析，設(shè)計出了最佳工藝方案為mZnCl2∶m原料= 1∶2，原料與乙醇料液比1∶12，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲時間40 min，超聲溫度40 ℃時，產(chǎn)品得率和純度較為理想。此外，還有采用離子液體輔助雙水相系統(tǒng)進行茶多酚的提取[37]、雙水相體系協(xié)同超聲法提取樣品中茶多酚[38]、固相絡(luò)合反應(yīng)法對茶葉中茶多酚進行提取[39]、生石灰水沉淀法[40]等對茶多酚提取工藝的研究。

綜上，茶多酚得率的影響因素有很多。原料與提取工藝的差異都能導(dǎo)致最終提取率的變化。同時，各種提取方法都具有優(yōu)勢與缺點。例如，溶液浸提法成本低、操作簡單、對設(shè)備要求較低等，但產(chǎn)品含雜多、耗費溶劑較多；超聲波提取法有機溶劑用量較少、提取效率高、產(chǎn)品氧化損失大大降低；樹脂法環(huán)保、效率高，但樹脂使用壽命與價格等影響其實際的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用；離子沉淀法操作簡單、產(chǎn)品得率高、選擇性強，卻受pH 值變化對產(chǎn)品質(zhì)量的影響及腐蝕性等因素制約；生物酶法與超臨界萃取法無毒、環(huán)保、高效等優(yōu)勢更加契合當(dāng)今綠色環(huán)保的時代要求。

3 茶多酚的分離

經(jīng)一系列提取工藝得出的茶多酚往往伴有色素、咖啡因、茶蛋白甚至有機溶劑等雜質(zhì)。既不利于對茶多酚的深入研究，也對其實際應(yīng)用造成了影響。因此，對茶多酚進行進一步的純化尤為重要。迄今常用的純化方法為柱層析法、膜過濾法、高速逆流色譜法等。

3.1 柱層析法

柱層析法又稱色譜法、色層法，包含固相與流動相，將固相固定于柱內(nèi)，使兩相相向運動進而達到分離的目的，利用洗脫液洗脫后即得到成品。該方法分離填料與洗脫劑的選擇對純化的結(jié)果最為重要，相關(guān)研究常選用硅膠及氧化鋁作為固定相。

袁華等人[41]通過試驗對柱填料的吸附率進行對比，結(jié)果表明硅膠的吸附性最好、聚酰胺略弱、纖維素效果一般、氧化鋁吸附性最差，并選取硅膠作為吸附劑，乙酸乙酯為洗脫劑對茶多酚進行富集。洗脫后茶多酚中兒茶素含量達90%，且咖啡因含量低至不再檢出。

柱層析法操作簡單易行、成本低，且硅膠再生后可重復(fù)使用，但該方法精制程度較其他方法效果不明顯，且時間較長，因而對此方法的應(yīng)用研究并不多見。

3.2 膜過濾法

膜過濾法是一種應(yīng)用十分廣泛的分離技術(shù)，包括正滲透、反滲透、超濾、膜蒸餾等。其原理是利用物質(zhì)分子量的不同，選擇不同孔徑的膜在某些驅(qū)動力的作用，實現(xiàn)大分子與與小分子的選擇性通過進而達到分離并純化的目的。驅(qū)動力包括滲透壓、濃度差、壓力差等。

徐龍生[42]采用經(jīng)預(yù)處理的茶料液分別對超濾、納濾及正滲透的純化工藝進行細(xì)致的研究。不僅通過大量試驗對3 種膜過濾純化茶多酚的工藝進行優(yōu)化，也對其工藝流程中膜的阻力誘因、污染情況、恢復(fù)膜通量的處理方式等進行了進一步的剖析，對今后采用膜分離技術(shù)進行目標(biāo)組分純化的研究提供了參考。

膜過濾法無需升溫，可兼具分離與純化兩相工藝，效率較高、節(jié)約能源，憑借其獨特優(yōu)勢在食品、醫(yī)藥、化工、生物等多個領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。但膜過濾法耗時較長，膜的污染問題也有待解決，仍需對該工藝進行進一步的研究與優(yōu)化。

3.3 高速逆流色譜法

高速逆流色譜法（HSCCC） 是一種區(qū)別于傳統(tǒng)固-液分配色譜的液-液分配色譜分離技術(shù)。無需固相載體且高效連續(xù)。其原理主要是根據(jù)樣品中目的組分在兩相溶劑中的分配系數(shù)差異實現(xiàn)樣本組分的分離。該技術(shù)擺脫了固態(tài)載體與支撐，進而減少了組分失活和不可逆吸附形成的損耗問題。目前，憑借其分離效果理想、進樣量大、成本低、綠色環(huán)保、操作簡單，且能夠依據(jù)目標(biāo)組分的特點選擇溶劑體系的適用范圍廣等優(yōu)勢在食品、醫(yī)藥、日化等領(lǐng)域均有研究和應(yīng)用，常見于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域中天然活性成分的提取分離。王尉等人[43]采用HSCCC 對綠茶中成分進行分離，選用乙酸乙酯-水的溶劑體系，依照目標(biāo)組分的極性差異對溶液體系中正己烷的比例進行調(diào)節(jié)。各目標(biāo)組分的純度均高于98.2%，尤其綠茶中含量較低的EGC，C，EC 通過二次HSCCC 分離皆得到高純度單體。侯善欣等人[44]利用薄層色譜（TLC） 法對構(gòu)建HSCCC 提取目標(biāo)組分的溶液體系進行篩選，二次HSCCC 分離純化后實現(xiàn)富集與分離，結(jié)果較為理想。此類研究對該方法的實際擴大化應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。

高速逆流色譜法制備條件溫和、可大量制備，其溶液體系的靈活選擇保證了其廣泛的應(yīng)用。但對于溶液體系的選擇構(gòu)建缺乏嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的理論指導(dǎo)和經(jīng)驗積累，仍需深入研究。且傳統(tǒng)溶劑的種類、毒性也給該技術(shù)帶來了限制，研制新型可替代的溶劑將會給HSCCC 帶來更多可能。

4 茶多酚的體外抗氧化活性研究

4.1 DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基清除能力是較為經(jīng)典的實驗室評價物質(zhì)抗氧化能力的方法。余芳等人[45]將制備不同質(zhì)量濃度的樣品溶液并過濾，采用相同質(zhì)量濃度的維C溶液做陽性對照。依照公式（1） 計算不同溶液對DPPH 自由基清除率并繪制圖像。將茶多酚與維C 的DPPH 自由基清除能力做對比，驗證其強弱。

式中：A0——2 mL DPPH+2 mL 70%乙醇溶液于波長517 nm 處測得的吸光度；

Ai——2 mL DPPH+2 mL 茶溶液于波長517 nm處測得的吸光度；

Ai0——2 mL 70%乙醇溶液+2 mL 茶溶液于波長517 nm 處測得的吸光度。

4.2 超氧陰離子（·O2-） 清除能力

超氧陰離子（·O2-） 與羥基（-OH） 結(jié)合生成的產(chǎn)物能夠破壞細(xì)胞的DNA，故對茶多酚清除超氧陰離子（·O2-） 的能力可反映其抗氧化能力。

林玲等人[46]將pH 值為8.2，濃度為0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液3 mL 水浴預(yù)熱至25 ℃后，分別將經(jīng)蒸餾水稀釋過的不同體積濃度干茶浸出液與濃度為30 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.6 mL 混勻并加熱至25 ℃，加入1 mol/L 的HCl 溶液0.5 mL 會使其反應(yīng)終止。按照公式（2） 計算超氧陰離子（·O2-） 清除率。所得結(jié)果繪制圖表對各樣本進行對比。超氧陰離子自由基屬鄰三苯酚自氧化過程中的中間產(chǎn)物，且能夠加速鄰三苯酚的自氧化進程。因此，超氧陰離子自由基的清除率可由茶多酚對鄰三苯酚的自氧化抑制程度來體現(xiàn)。

式中：A0——不加樣品于波長420 nm 處的吸光度；

A1——加樣品后于波長420 nm 處的吸光度；

A2——不加鄰苯三酚時于波長420 nm 處的吸光度。

考慮待測液于波長420 nm 處本身的吸收影響，故而選擇以等體積蒸餾水代替。

4.3 羥自由基清除能力

水楊酸法通過加入水楊酸捕捉過氧化氫與亞鐵離子產(chǎn)生的·OH 并生成產(chǎn)物。該產(chǎn)物于波長510 nm處有較大吸收峰。因而其吸光度的大小與·OH 的量呈正比。憑借其吸光度可對其抗氧化能力進行評價。

張倜培等人[47]采用Fenton 體系對測定，以蒸餾水作為空白對照、維C 作為陽性對照按照公式（3）計算。

式中：A0——未加樣品于波長510 nm 的吸光度；

A1——添加樣品后于波長510 nm 的吸光度。

4.4 ABTS+自由基清除能力

作為測定自由基清除能力使用最為廣泛的間接檢測方法，其可用于親脂性與親水性物質(zhì)抗氧化能力的測定。于波長405 nm 或734 nm 處有特殊峰值，在一定范圍內(nèi)其吸光度與自由基的清除程度呈正比，可依據(jù)吸光度的變化程度來反映其對ABTS+自由基的清除能力。

喻銘佳等人[48]在避光條件下對巫山茶多酚的ABTS+自由基清除能力進行測定。按照公式（4） 進行計算。

式中：A0——加入樣品溶液和ABTS 反應(yīng)溶液測得的吸光度；

Ai——加入無水乙醇和樣品溶液測得的吸光度；

Aj——加入ABTS 反應(yīng)溶液和70%乙醇溶液測得的吸光度。

4.5 抑制豬油氧化能力

在加工臘肉時使用茶多酚可抑制酸價、降低脂肪氧化。

胡蓉[49]采用純豬油、維E 甲醇溶液進行對照。按照式（5） 進行測試并證實茶多酚在抑制油脂氧化方面的優(yōu)良效果。

式中：V1——試驗測定的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

V0——滴定空白的硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；

C——硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；

m——試樣質(zhì)量，g。

5 結(jié)語

茶多酚是取自茶葉中多酚物質(zhì)的統(tǒng)稱。隨著近年來相關(guān)學(xué)者對茶多酚的大量研究，其生物活性與功能得到了深入開發(fā)。尤以其復(fù)雜成分分析、提取與純化工藝、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、心血管病防治等方面進行了深入的研究，現(xiàn)有的研究成果為茶多酚在食品保健、醫(yī)藥衛(wèi)生、紡織印染等行業(yè)的應(yīng)用提供了諸多可能。但在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域尚且以輔助治療為應(yīng)用主體，利用茶多酚進行藥物治療仍需摸索。

多年來，有關(guān)茶多酚的提取純化工藝雖然眾多，但諸多方法中或因純度不高、消耗過大而不適宜大量投產(chǎn)，如溶液浸提法、金屬離子沉淀法等；或因腐蝕裝置等，如鹽析法；其他，如超臨界萃取法、超聲波提取法、低共熔溶液體系等尚處于實驗室階段，并不能實現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)性投產(chǎn)。但其中不乏HLPC、酶法、HSCCC 等高效、環(huán)保的操作工藝。

作為茶葉種植與消費大國，對茶多酚的深入研究有助于提升其附加值，對經(jīng)濟發(fā)展等方面均有助益。因而，實現(xiàn)茶多酚提取工藝的優(yōu)化更新將推動其在各項領(lǐng)域研究與應(yīng)用開發(fā)的良好態(tài)勢。