李廣巖　白興勇　尹傳坤　梁晨　宋雯雯　史倩倩　趙洪海

摘要：近年來，山東省部分地區(qū)谷子線蟲病頻繁發(fā)生、危害嚴(yán)重。為明確山東省谷子線蟲病的病原種類，2021-2022年從山東省收集谷穗樣本9個，采用組織破碎一貝曼漏斗法分離獲得線蟲，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定線蟲種類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從臨沂、濟寧、聊城、濟南和濰坊的6個谷穗樣本中分離到植物線蟲，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為同一物種，并對其為害癥狀和雌、雄蟲主要形態(tài)特征進行了描述。同時結(jié)合基于rDNA-ITS與28SD2/D3區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和貝西滑刃線蟲（Aphelenchoides besseyi）特異性引物PCR擴增等生物學(xué)鑒定方法，最終將為害線蟲鑒定為貝西滑刃線蟲。鑒定結(jié)果為山東省谷子線蟲病的發(fā)生、分布和危害狀況的研究提供數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞：谷子線蟲??；貝西滑刃線蟲；形態(tài)特征；分子鑒定；癥狀

中圖分類號：S435.15 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2024）03-0125-07

谷子（Setaria italica）系一年生草本植物，果實脫皮后俗稱小米，是我國傳統(tǒng)的糧食作物，耐旱、耐瘠、耐儲存，對種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和膳食結(jié)構(gòu)改善具有重要作用。山東省谷子種植面積常年穩(wěn)定在2.6萬hm2以上，主要集中在魯中山脈周邊及魯東等丘陵山區(qū)。谷子線蟲病或谷子不稔線蟲病，又稱紫穗病，俗稱“倒青”，是一種典型的種傳病害。線蟲寄生破壞子房，導(dǎo)致不能開花或花而不實，穎多張開，內(nèi)含表面光滑有光澤的尖形秕粒，病穗瘦小，直立不下垂。受害谷子產(chǎn)量損失很大，發(fā)病嚴(yán)重地塊可減產(chǎn)60%-80%，甚至絕收。由于谷子主要種植品種均為感病品種，種子調(diào)運頻繁加之抗病品種培育困難，造成線蟲病在我國谷子產(chǎn)區(qū)的危害不斷蔓延且存在逐漸加重趨勢。然而，長期以來我國關(guān)于谷子線蟲病發(fā)生、為害的報道數(shù)量有限，且主要集中在河北省，山東省未見報道。

基于生產(chǎn)中臨沂市菖南縣發(fā)生疑似谷子不捻線蟲病，導(dǎo)致數(shù)個谷子田塊出現(xiàn)不結(jié)實的情況，本研究從山東省部分地區(qū)收集谷子線蟲病疑似病穗，并對分離到的線蟲進行系統(tǒng)鑒定，旨在確定山東省谷子線蟲病的發(fā)生、分布和危害狀況，為其識別診斷和有效防控提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

疑似谷子線蟲病病穗來自臨沂市費縣（LF：樣本標(biāo)號，下同）、臨沂市莒南縣（LJ）、聊城市高唐縣（LG）、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濟南農(nóng)場（JN）、濟寧市鄒城市（JZ）、濰坊市昌邑市（WC）、淄博市臨淄區(qū)（ZL）、煙臺市福山區(qū)（YF）、德州市樂陵市（DL），共9個樣本。

1.2 研究方法

1.2.1 線蟲分離

將病穗切成小段并將谷粒研磨破碎，采用改良的貝曼漏斗法進行線蟲的定量分離。

1.2.2 線蟲計數(shù)

定量分離后，用試管接取線蟲懸浮液10mL，充分搖勻后用移液器吸取0.5mL滴于載玻片上，在解剖鏡下計數(shù)液滴中的線蟲數(shù)量，重復(fù)3次，取平均值后折算出10mL線蟲懸浮液中的線蟲數(shù)量，最后計算每克谷穗組織中的線蟲數(shù)量，即病穗線蟲群體密度。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將線蟲溫和熱殺死后，在O-lympus雙目實體解剖鏡下挑取目標(biāo)線蟲，以水作浮載劑制成臨時玻片標(biāo)本，利用Zeiss顯微鏡及配套軟件對線蟲標(biāo)本進行形態(tài)特征觀察、拍照及測量。按照DeMan公式計算比值特征。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

參考容萬韜等的方法提取單條線蟲的DNA，以引物D2A/D3B擴增線蟲28S rRNA D2/D3區(qū)片段，以引物TW81/AB28擴增線蟲rDNA ITS區(qū)片段。PCR反應(yīng)體系為25μL：線蟲DNA模板2μL，10xPCR Buff-er（Mg2+）2.5μL，dNTP MIX 2μL，上、下游引物各2μL，ddH2O 14μL，rTaq酶0.5μL。PCR擴增程序參照文獻[13]。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收克隆后交由上海生工青島分公司測序。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序后的結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析，下載序列。運用MECA 7.0軟件中的ClustalW進行序列比對，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 特異性引物檢測

參照林宇等的方法，用貝西滑刃線蟲28S rRNA D2/D3區(qū)特異性引物GU-F（5'-GACACTGCAATCGCTTCGAC-3）與GU-R（5-ATCCGCAACCACAACTCACA-3'）對供試線蟲群體的DNA進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系同1.2.4，其中GU-F和GU-R各2μL。PCRkuo增程序：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min，35個循環(huán)：72℃7min；4℃保存。以貝西滑刃線蟲DNA為陽性對照，燕麥真滑刃線蟲（Aphelenchus avenae）DNA為陰性對照，ddH2O為空白對照。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2003對數(shù)據(jù)進行整理，利用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲分離

從LJ、LF、LC、JN、JZ和WC共6個樣本中分離出植物線蟲，初步觀察發(fā)現(xiàn)均屬于滑刃線蟲屬（Aphelenchoides），其他樣本中未分離出植物線蟲。6個樣本問線蟲群體密度存在很大差異，從大到小依次為JN、LG、WC、LF、IJJ和JZ（表1）。

2.2 癥狀觀察

受害較輕的谷穗，部分穎殼松裂，局部呈紫紅色，穗部頂端瘦小、蓬松，部分籽粒癟秕，成熟期在田間一般下垂。受害較重的谷穗，整體短小、蓬松，頂部蓬松尤其嚴(yán)重：大部分谷粒癟秕，秕粒尖形、光滑、有光澤：穎殼開張，呈紫紅色：與健康谷穗相比重量明顯較輕，成熟期在田間常常直立（圖1）。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

通過系統(tǒng)的形學(xué)觀察和測量，發(fā)現(xiàn)6個線蟲群體的形態(tài)特征基本一致，初步鑒定為貝西滑刃線蟲（A.besseyi Christie，1942）。雌蟲和雄蟲的測量數(shù)據(jù)及其與原始文獻數(shù)據(jù)和國內(nèi)學(xué)者測量數(shù)據(jù)的比較分別見表2和表3。

雌蟲形態(tài)特征（圖2）：經(jīng)溫和熱殺死后蟲體略向腹面彎曲，蟲體細(xì)長，平均長度約為720μm（圖2A），側(cè)區(qū)約占蟲體寬度的1/4，具有4條側(cè)線（圖2C）。唇區(qū)嘲，稍有縊縮，口針稍細(xì)弱，長度約為12μm，基部球小。中食道球大而明顯，近長方形，長約14μm，寬約9μm，瓣門明顯，位于中食道球中部偏后。食道腺長葉狀，從背面覆蓋腸（圖2B）。陰門橫裂且陰門唇稍凸起。單卵巢，受精囊長卵圖形。后陰子宮囊窄而長，長度約為陰門處體寬的2.5-3.5倍（圖2E）。尾長約為40μm，尾呈圓錐形，末端腹突具有3-4個細(xì)小的星狀尖突（圖2D）。

雄蟲形態(tài)特征（圖3）：經(jīng)熱殺死后蟲體略向腹面彎曲，體長較雌蟲短，平均約550μm（圖3A）。蟲體前部特征與雌蟲基本相似（圖3B）。交合刺呈玫瑰刺狀，長約16μm，基部無頂尖，喙突中等發(fā)達，尾末端具有2-3個星狀尾尖突，尾部具3對尾乳突（圖3D）。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

采用線蟲ITS區(qū)通用引物TW81/AB28雙向測序后進行序列拼接，比對后得到序列長度約為825bp，上傳至CenBank獲得登錄號OQ476763、OQ711739。采用28S D2/D3區(qū)引物雙向測序后進行序列拼接，比對后得到序列長度為787bp，上傳至GenBank獲得登錄號OQ476877、OQ723791。基于ITS和28S D2/D3序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）表明，山東谷子滑刃線蟲群體與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的5個貝西滑刃線蟲的序列聚于同一個大的分支，相似度均為100%。

2.5 特異性引物檢測

采用貝西滑刃線蟲特異性引物GU-F/GU-R對山東谷子滑刃線蟲群體與貝西滑刃線蟲群體進行PCR擴增（圖5），結(jié)果顯示，山東谷子滑刃線蟲群體擴增條帶為279bp，符合貝西滑刃線蟲特異性引物擴增條帶長度，而陰性對照燕麥真滑刃線蟲與空白對照（ddH2O）則無條帶出現(xiàn)。最終將山東谷子線蟲群體鑒定為貝西滑刃線蟲。

3 討論與結(jié)論

貝西滑刃線蟲是一種葉芽線蟲，以外寄生的方式取食植物地上部分，是對水稻最具破壞性的植物線蟲之一，常被稱為水稻干尖線蟲。其寄主范圍廣，包括水稻、谷子、草莓、大豆等200多種植物，被認(rèn)為是世界十大最重要的植物寄生線蟲之一，是非常重要的植物檢疫病蟲，被世界70個國家列為限定性有害生物20。20世紀(jì)50年代到60年代，陳善銘等對北京市和河北省定縣、安國縣谷子線蟲病的病原線蟲種類、寄生方式、生活史等進行了較為系統(tǒng)的研究，指出我國谷子線蟲病的最早記載可追溯到1916年。20世紀(jì)70年代，谷子線蟲病在京津冀地區(qū)有零星發(fā)生，由于長期種植感病品種，又逢發(fā)病適宜氣候條件，1982年，河北青縣和天津武青縣谷子線蟲病大發(fā)生，造成嚴(yán)重產(chǎn)量損失。王金成等對從河北省谷子中分離的滑刃線蟲種群進行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，提供了河北谷子中貝西滑刃線蟲的分子數(shù)據(jù)。Chen等首次對分離白河南省谷子的貝西滑刃線蟲進行了報道。目前，對山東省谷子線蟲病較為系統(tǒng)的調(diào)查研究和報道近乎空白。

貝西滑刃線蟲在谷子播種后主要在種殼和秕粒內(nèi)活動，少量進入胚根和幼芽，拔節(jié)期后轉(zhuǎn)移到葉鞘進行繁殖，待幼穗形成后轉(zhuǎn)移至穗部為害并進行大量繁殖。目前認(rèn)為，寄生谷子和水稻的貝西滑刃線蟲是同種線蟲的2個不同的生理型。高丙利研究表明，寄生水稻的貝西滑刃線蟲可在田間的谷殼內(nèi)存活4個月，但不能在土壤中長時間存活。白峰、劉維志和張麗英等認(rèn)為寄生谷子的貝西滑刃線蟲可以在土壤中存活。根據(jù)Christie的研究，在美國北卡羅來納州貝西滑刃線蟲的草莓型也可以在土壤中存活。陳善銘等用兩種線蟲在谷子和水稻上進行交互接種試驗，發(fā)現(xiàn)原寄生于谷子上的貝西滑刃線蟲對水稻侵染較少，原寄生于水稻上的貝西滑刃線蟲對谷子的侵染也較少。因此關(guān)于貝西滑刃線蟲不同生理型之間的關(guān)系、土壤存活性以及葉穗寄生偏好性的差異等問題尚需進一步研究。

本研究對從山東部分地區(qū)谷子病穗中分離得到的線蟲群體通過形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進行了鑒定，明確了山東省谷子線蟲病的基本發(fā)生狀況和病原種類，屬首次針對山東省谷子線蟲病的調(diào)查研究和報道。山東省是我國重要的谷子產(chǎn)區(qū)，本研究結(jié)果為山東省谷子線蟲病的鑒定診斷提供了較為詳細(xì)的數(shù)據(jù)信息，可為谷子線蟲病的科學(xué)認(rèn)識和防控提供指導(dǎo)。

基金項目：山東省重點研發(fā)計劃（重大科技創(chuàng)新工程）項目專題（2022CXGC020710-6）；黃三角國家農(nóng)高區(qū)省級科技創(chuàng)新發(fā)展專 項資金項目（2022SZX23）