彭莎莎 王喆 沙帥帥 張怡雯 閆成才 王蘭

摘要 ［目的］使用Nit突變體體系，探索來(lái)自新疆香梨種植區(qū)不同地理來(lái)源的腐爛病菌遺傳多樣性。［方法］首次使用Nit突變株技術(shù)（抗氯酸鹽的硝酸鹽利用缺陷突變體）對(duì)來(lái)自南疆3個(gè)不同種植區(qū)的13株庫(kù)爾勒香梨樹(shù)腐爛病菌Cytospora pyri的營(yíng)養(yǎng)體親和性進(jìn)行了研究。［結(jié)果］13個(gè)菌株在含氯酸鹽培養(yǎng)基（KPS）培養(yǎng)出115個(gè)Nit突變體，其中41個(gè)沒(méi)有發(fā)生突變。在突變體穩(wěn)定性鑒定中，鑒定出33個(gè)穩(wěn)定的Nit突變體，82個(gè)不穩(wěn)定的Nit突變體。產(chǎn)生的Nit突變體的表型85%被鑒定為NitD，15%被鑒定為NitB。［結(jié)論］獲得2個(gè)Nit突變體，說(shuō)明C.pyri的氮同化途徑可能發(fā)生了2種突變。所有被檢測(cè)的分離株都能夠利用次黃嘌呤，使用次黃嘌呤的能力排除了鉬輔助因子位點(diǎn)被阻斷的可能性。

關(guān)鍵詞 香梨樹(shù)腐爛病菌；Cytospora pyri；Nit突變體

中圖分類(lèi)號(hào) S 436.612.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2024）12-0136-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.029

Study on Vegetative Compatibility of Cytospora pyri from Korla Fragrant Pear in Different Planting Areas

PENG Sha-sha1，WANG Zhe1，SHA Shuai-shuai2 et al

（1.Agricultural College，Tarim University/Key Laboratory of Southern Xinjiang Agricultural Pest Control Corps/National and Local Joint Engineering Laboratory of High-Efficiency and High-Quality Cultivation and Deep Processing Technology of Characteristic Fruit Trees in Southern Xinjiang， Alar，Xinjiang 843300; 2. College of Modern Agriculture， Kashgar University， Kashgar，Xinjiang 844006）

Abstract ［Objective］ To use Nit mutant system to explore the genetic diversity of fragrant pear from different geographical sources in Xinjiang. ［Method］ In this study， Nit mutant technology （nitrate-resistant defective mutant） was used for the first time to study the nutritional affinity of Cytospora pyri， 13 strains of Korla pear tree rot from three different growing areas in southern Xinjiang. ［Result］ 115 Nit mutants were cultured in chlorate medium （KPS） from 13 strains， and 41 of them did not mutate. In the identification of mutant stability， 33 stable Nit mutants and 82 unstable Nit mutants were identified. The phenotype of the resulting Nit mutants was identified as NitD 85% and NitB 15%. ［Conclusion］ In this study， two Nit mutants were obtained， indicating that there may be two mutations in the nitrogen assimilation pathway of C. pyri. All isolates tested were able to utilize hypoxanthine， and the ability to use hypoxanthine ruled out the possibility that molybdenum cofactor sites were blocked.

Key words Pear Valsa Canker;Cytospora pyri;Nit mutant

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然基金-新疆聯(lián)合基金重點(diǎn)支持項(xiàng)目（U1903206）；旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題項(xiàng)目（CSBAA2020009）；自治區(qū)研究生科研與創(chuàng)新項(xiàng)目（XJ2021G293）。

作者簡(jiǎn)介 彭莎莎（1999—），女，陜西漢中人，碩士研究生，研究方向：植物保護(hù)。*通信作者，教授，博士，從事植物病理學(xué)研究。

收稿日期 2023-10-27

庫(kù)爾勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü）是國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品之一，主要種植區(qū)有巴音郭楞蒙古自治州（簡(jiǎn)稱(chēng)巴州）、 阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)等地，是新疆地區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要產(chǎn)業(yè)。香梨樹(shù)腐爛?。≒ear Valsa Canker）嚴(yán)重危害庫(kù)爾勒香梨樹(shù)，近年來(lái)新疆庫(kù)爾勒香梨樹(shù)腐爛病病株率普遍在50%～100%，在南疆平均病株率高達(dá)85%［1-3］。腐爛?。–ytospora pyri）是由Valsa屬真菌引起。無(wú)性態(tài)為Cytospora屬，相近屬為L(zhǎng)eucostoma，在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致產(chǎn)量損失，特別是對(duì)東亞、中國(guó)、意大利許多地區(qū)的梨果生產(chǎn)構(gòu)成重大威脅，經(jīng)常導(dǎo)致整個(gè)果園的樹(shù)木減產(chǎn)或死亡［4-6］。

自1976 年Cove［7］首次發(fā)現(xiàn)不能利用硝酸鹽的突變體［Nitrate Non-utilizing Mutants］而獲得構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后在多種真菌中使用誘導(dǎo) Nit 突變體的方法進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì)半知菌亞門(mén)、子囊菌門(mén)等真菌的研究證實(shí)，硝酸鹽利用缺陷型突變體（簡(jiǎn)稱(chēng)Nit 突變體）的方法常用于研究真菌營(yíng)養(yǎng)體親和性等方面［8-9］。1985 年 Puhalla［10］在進(jìn)行互補(bǔ)試驗(yàn)測(cè)定營(yíng)養(yǎng)體親和性時(shí)，開(kāi)辟了利用硝酸鹽營(yíng)養(yǎng)缺陷型（Nit）突變體的方法，為分析病原菌的遺傳分析、親和群與轉(zhuǎn)化性、生理小種的相關(guān)性，以及病害生物防治等方面的研究提供了新的方向［11］。

筆者首次對(duì)庫(kù)爾勒香梨樹(shù)不同種植區(qū)的13株腐爛病菌C.pyri進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)體親和性測(cè)定，建立并使用Nit突變體體系，以探索來(lái)自新疆香梨種植區(qū)不同地理來(lái)源的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

13個(gè)香梨樹(shù)腐爛病菌株（Cytospora pyri）于2019年分別采自新疆的巴州、阿克蘇和喀什等庫(kù)爾勒香梨主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)單孢分離鑒定后獲得（表1）。

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g；含氯酸鹽培養(yǎng)基（KPS）：去皮馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，氯酸鉀粉末50 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 mL；基本培養(yǎng)基（BM）：瓊脂20.00 g，KH2PO4 1.00 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，KCl 0.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，蔗糖30.00 g，微量元素液0.2 mL，蒸餾水1 000 mL。微量元素液（TES）：蒸餾水95 mL，硫酸銅250 mg，硫酸錳50 mg，檸檬酸5 g，硫酸亞鐵銨1 g。含硝酸鈉培養(yǎng)基（MM）：在1 000 mL的基本培養(yǎng)基中加入2.0 g 硝酸鈉。含亞硝酸鈉培養(yǎng)基（NM）：在1 000 mL的基本培養(yǎng)基中加入0.5 g 亞硝酸鈉。含次黃嘌呤培養(yǎng)基（HM）：在1 000 mL的基本培養(yǎng)基中加入0.2 g次黃嘌呤［12］。

1.2 Nit突變體誘導(dǎo)與分離

先將供試菌株接種在PDA上于27 ℃黑暗培養(yǎng)4 d，之后接種于含5%的氯酸鹽（KPS）培養(yǎng)基中誘導(dǎo)突變。菌株生長(zhǎng)后在不規(guī)則突變區(qū)邊緣挑取菌絲，接種于MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在MM培養(yǎng)基中，出現(xiàn)菌絲稀薄、匍匐生長(zhǎng)或不產(chǎn)生氣生菌絲的菌落，則說(shuō)明其形成抗硝酸鹽利用缺陷型突變體，即Nit突變體，用甘油保存于-80 ℃冰箱中［13］。

1.3 Nit突變體穩(wěn)定性鑒定

初次篩選的突變體可能因突變不穩(wěn)定導(dǎo)致其返回原生狀態(tài)，即回復(fù)突變，需要鑒定其穩(wěn)定性。將篩選的Nit突變體接種至PDA中27 ℃黑暗培養(yǎng)4 d，再接種到MM培養(yǎng)基中。若產(chǎn)生氣生菌絲或呈野生型生長(zhǎng)，則說(shuō)明突變體可能因突變不穩(wěn)定返回原生狀態(tài)，應(yīng)丟棄；若菌落很稀薄或仍不產(chǎn)生氣生菌絲，則說(shuō)明形成穩(wěn)定的Nit突變體，用甘油保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 突變體表型鑒定

將篩選出的 Nit突變體接種于唯一氮源分別是硝酸鹽、亞硝酸鹽和次黃嘌呤的基本培養(yǎng)基（BM）上進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)突變體在3種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，判斷突變體對(duì)2種氮源的利用情況，確定Nit突變體的生理表現(xiàn)類(lèi)型（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nit突變體的誘導(dǎo)與分離

菌絲接種于KPS培養(yǎng)基后的 2～3 d，菌落幾乎不生長(zhǎng)，整體生長(zhǎng)狀態(tài)受到嚴(yán)重抑制。在7～11 d 后，部分菌落一側(cè)開(kāi)始出現(xiàn)氣生菌絲，后逐漸發(fā)展成茂盛的扇形菌落（角變區(qū)），此為抗氯酸鹽突變體。突變體在含有硝酸鈉的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較緩慢，菌絲呈無(wú)色透明膠質(zhì)狀，無(wú)氣生菌絲產(chǎn)生，且只有很稀疏的菌絲匍匐于培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，初步確定其為可選用的Nit突變體（圖1A）。

單個(gè)菌株取12個(gè)重復(fù)于KPS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)突變，共156個(gè)突變點(diǎn)位，在KPS培養(yǎng)基上均有不規(guī)則菌落（扇形菌落）生長(zhǎng)，取邊緣菌絲接種于MM培養(yǎng)基中進(jìn)行穩(wěn)定性篩選，有115個(gè)位點(diǎn)未產(chǎn)生氣生菌絲或菌落很稀薄，說(shuō)明形成了硝酸鹽利用缺陷型突變體，即Nit突變體。

2.2 Nit突變體穩(wěn)定性鑒定

將篩選的115個(gè)Nit突變體接種于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再接種到MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察記錄其生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，有33個(gè)菌株不產(chǎn)生氣生菌絲或菌落很稀?。▓D1B），說(shuō)明形成了穩(wěn)定的Nit突變體，保留其菌株。

2.3 Nit突變體的篩選與鑒定

在含硝酸鈉、亞硝酸鈉、次黃嘌呤3種不同氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，鑒定Nit突變體表型。結(jié)果表明，所有在不同氮源差異培養(yǎng)基上的培養(yǎng)突變體在含次黃嘌呤和硝酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)無(wú)氣生菌絲，在亞硝酸鹽上生長(zhǎng)較差，部分有氣生菌絲。從13個(gè)菌株中獲得的33個(gè)突變體，根據(jù)突變體在不同氮源培養(yǎng)基的生長(zhǎng)特征鑒別出NitB（圖1C）與NitD（圖1D）2種類(lèi)型，不同菌株產(chǎn)生的各種突變類(lèi)型差異較小。根據(jù)含有不同氮源的差異培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)，未檢測(cè)到其他類(lèi)型的Nit突變體，NitA、NitB、NitC和NitD表型頻率分別為0、15%、0和85%（表3）。

3 討論

硝酸鹽利用缺陷型Nit突變體已被廣泛用于區(qū)分VCGs和研究許多絲狀真菌種內(nèi)及種間的種群遺傳多樣性［14］。該研究首次利用Nit突變體研究C.pyri的營(yíng)養(yǎng)親和性。結(jié)果表明，通過(guò)在不同氮源培養(yǎng)基上進(jìn)行Nit突變體表型鑒定，Nit突變體在含次黃嘌呤和硝酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)無(wú)氣生菌絲，在亞硝酸鹽上抑制生長(zhǎng)，僅有少數(shù)有氣生菌絲產(chǎn)生，被鑒定為NitB、NitD突變體，說(shuō)明C.pyri的氮同化途徑可能發(fā)生了2種突變。C.pyri在亞硝酸鹽上抑制生長(zhǎng)，可能是一種無(wú)功能的硝酸鹽還原酶起作用，而這是氮同化途徑的必需酶。所有被檢測(cè)的分離株都能夠利用次黃嘌呤，使用次黃嘌呤的能力排除了鉬輔助因子位點(diǎn)被阻斷的可能性［15］。

研究表明，對(duì)不同種類(lèi)的菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生Nit突變體的條件不同［16］。盡管所研究的菌株具有地理多樣性，但該試驗(yàn)只獲得2種類(lèi)型的Nit突變體。原因可能在于C.pyri的繁殖階段中無(wú)性繁殖占主導(dǎo)地位，這直接導(dǎo)致了占據(jù)特定寄主或特定生態(tài)區(qū)域的C.pyri種內(nèi)的基因流動(dòng)，在氮同化方面，基因流導(dǎo)致了不同種植區(qū)香梨樹(shù)腐爛病菌C.pyri的同質(zhì)化，因此，推測(cè)大多數(shù)C.pyri菌株對(duì)氮的利用具有相同的模式。

利用Nit突變體的方法能夠使研究者對(duì)殼囊孢屬真菌在世界范圍內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)體親和性進(jìn)行比較，為這種普遍發(fā)生的植物病害的遺傳多樣性提供有價(jià)值的信息。后期可以在不同氯酸鹽改良培養(yǎng)基上篩選更多的分離株，甚至在硒酸鈉改良的培養(yǎng)基上產(chǎn)生其他種類(lèi)的硫酸鹽突變體，如硫酸鹽非利用突變體（sul），可能有助于更好地了解C.pyri分離株的營(yíng)養(yǎng)親和性。

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