王瑋 王景松 郭亞男 高樂(lè) 王玲玲 陳燦 王健霖 王建東 馬科 李繼東

摘 要：旨在調(diào)查寧夏地區(qū)犢牛腹瀉性大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）流行情況及毒力因子流行特點(diǎn)。對(duì)寧夏地區(qū)共采集332份腹瀉犢牛直腸糞便進(jìn)行病原分離，利用PCR方法對(duì)156株大腸桿菌分離株進(jìn)行13種相關(guān)毒力基因檢測(cè)。結(jié)果共分離出156株大腸桿菌（46.99%），共檢出136株含有毒力因子的大腸桿菌，表明目前寧夏地區(qū)腹瀉犢牛大腸桿菌陽(yáng)性率較高，毒力因子組合復(fù)雜，優(yōu)勢(shì)毒力因子為irp2。

關(guān)鍵詞：犢牛；腹瀉性；大腸桿菌；毒力因子

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）07-3261-06

收稿日期：2023-08-30

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022BBF03024）

作者簡(jiǎn)介：王 瑋（1999-），女，河南南陽(yáng)人，碩士生，主要從事動(dòng)物疾病診斷與防控技術(shù)研究，E-mail：wei_wang2022@163.com

*通信作者：李繼東，主要從事動(dòng)物傳染病的診斷與防治研究，E-mail：lijidongi@foxmail.com；郭亞男，主要從事獸醫(yī)臨床診斷技術(shù)研究，E-mail：gyn330@126.com

Toxicity Factor Detection and Analysis of Escherichia coli Isolated Strains from

Calf Diarrhea Samples in Some Areas of Ningxia

WANGWei^1，2，WANGJingsong^1，2，GUOYa’nan^1*，GAOLe²，WANGLingling²，

CHENCan²，WANGJianlin²，WANGJiandong¹，MAKe³，LIJidong^2*

（1.Institute of Animal Science，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry，

Yinchuan750002，China; 2.School of Animal Science and Technology，Ningxia University，

Yinchuan750021，China; 3.Ningxia Tongxin County Science and

Technology Service Center，Tongxin751300，China）

Abstract：The aim of this study was to investigate the prevalence and virulence factors of Escherichia coli（E.coli）in calves in Ningxia region.A total of332samples of diarrhea calf rectal feces were collected in Ningxia region for pathogen isolation，and156strains of E.coli were detected for13related virulence genes using PCR method.The results show that atotal of156strains（46.99%）of E.coli were isolated，and atotal of136strains containing virulence factors were detected.This indicates that the current positive rate of E.coli in diarrhea calves in Ningxia is relatively high，and the combination of virulence factors is complex，with irp2being the dominant virulence factor.

Key words：calves; diarrhea; Escherichia coli; toxicity factor

*Corresponding authors：LI Jidong，E-mail：lijidongi@foxmail.com; GUO Ya’nan，E-mail：gyn330@126.com

在國(guó)內(nèi)，引起犢牛腹瀉的致病性大腸桿菌被廣泛研究，然而，近幾年的研究?jī)H限于少數(shù)畜群，集中在病原的流行病學(xué)調(diào)查、血清型鑒定、耐藥性分析等研究^[1-3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)于牛源性大腸桿菌毒力因子的研究?jī)H限于單一毒力因子或者一類(lèi)毒力因子的研究^[3-9]。目前，尚未見(jiàn)對(duì)寧夏地區(qū)犢牛腹瀉源性大腸桿菌毒力因子的系統(tǒng)性調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 主要材料

2022—2023年，對(duì)寧夏西吉縣、青銅峽市、利通區(qū)、紅寺堡區(qū)、同心縣地區(qū)出現(xiàn)腹瀉的20個(gè)規(guī)模化場(chǎng)和13個(gè)散養(yǎng)戶(hù)，用無(wú)菌棉拭子采集3月齡左右犢牛直腸糞便，將單個(gè)肛拭子置于15mL無(wú)菌離心管中，并記錄采樣犢牛數(shù)量和其腹瀉情況等信息。參考菌株大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922由寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所提供。

1.2 主要試劑

50×TAE緩沖液（20220110），購(gòu)自金克隆（北京）生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Y1127）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DL1000DNA Marker（AM51180A）、DL2000DNA Marker（AM31176A）購(gòu)自TaKaRa公司；豆粉瓊脂（10803）購(gòu)自青島日水生物技術(shù)有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）（20230417）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）（20210311）購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；無(wú)菌脫纖維羊血（HQ60071）購(gòu)自廣州鴻泉生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離與鑒定

將采集單個(gè)直腸肛拭子（n=332）接種于5mL NB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12h。然后用接種環(huán)按照常規(guī)細(xì)菌分離方法分別接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24h。挑取典型單個(gè)菌落接種于5mL NB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12h，劃線接種到無(wú)菌脫纖維羊血瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，觀察菌株情況，同時(shí)接種到NB液體培養(yǎng)基中備用。通過(guò)對(duì)寧夏西吉縣、青銅峽市、利通區(qū)、紅寺堡區(qū)、同心縣地區(qū)的腹瀉樣本，進(jìn)行大腸桿菌病原分離；分離菌DNA的提?。?6S rRNA PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定；大腸桿菌毒素的檢測(cè)：采用PCR方法對(duì)K88、K99、987P、fedA、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、LT1、VT1、VT2all、SLT2毒素進(jìn)行特異性檢測(cè)^[10]。引物見(jiàn)表1，PCR體系為50μL：25μL2×Premix Taq，2μL10μmol·L^-1上、下引物，4μL細(xì)菌DNA模板，17μL超純水。PCR程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，退火（H88、F41、K99、987P、fedA、LT1、ST1、ST2、Stxl、VT2all56℃，F(xiàn)1860℃，LEE、HPI58℃）30s，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min；4℃保存。

2 結(jié) 果

糞便樣品經(jīng)分離培養(yǎng)基后結(jié)果顯示，從332份腹瀉糞便樣本中分離出156株大腸桿菌。大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出金屬光澤的黑色單一菌落；血平板上有中等大小、具有溶血圓的灰色圓形單一菌落。16S rRNA擴(kuò)增檢測(cè)到約1500bp目標(biāo)片段，與預(yù)期相符。

對(duì)不同地區(qū)、不同規(guī)模飼養(yǎng)場(chǎng)樣品的分離情況分析結(jié)果見(jiàn)表2。分離情況分析結(jié)果顯示，寧夏西吉縣、青銅峽、紅寺堡、同心縣，大腸桿菌檢出率分別為47.83%（22/46）、46.03%（58/126）、52.78%（38/72）、48.39%（30/62），利通區(qū)為30.77%（8/26）明顯低于其他地區(qū)；采集樣本犢牛腹瀉率紅寺堡為最高（50.00%），利通區(qū)腹瀉率為最低（26.92%）。

不同地區(qū)散養(yǎng)戶(hù)中大腸桿菌總檢出率為57.14%（32/56），規(guī)模場(chǎng)中大腸桿菌總檢出率為44.93%（124/276）。表明散養(yǎng)戶(hù)中更易存在大腸桿菌，這可能與散養(yǎng)戶(hù)飼養(yǎng)環(huán)境較差有關(guān)。

通過(guò)對(duì)156株腹瀉源性大腸桿菌菌株K88、K99、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、VT1、VT2all、SLT2進(jìn)行擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出大小約為841、543、280、425、183、360、664、484、281bp的片段（結(jié)果未展示），與預(yù)期結(jié)果一致。由表3可知，毒力基因K88、K99、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、VT1、VT2all、SLT2的檢出率分別為19.23%、3.85%、52.56%、25.64%、3.85%、1.28%、24.36%、21.79%、12.82%。未擴(kuò)增出987P、fedA、LT1、VT1的預(yù)期片段，這表明合成的引物可以用于K88、K99、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、VT1、VT2all、SLT2毒素特異性檢測(cè)。

對(duì)各菌株毒力基因組合分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表4所示，未檢出毒力因子的菌株有20株（12.82%），含有一個(gè)毒力因子的菌株有80株（51.28%），含有兩個(gè)毒力因子的菌株有20株（12.82%），含有三個(gè)毒力因子的菌株有22株（14.10%），含有三個(gè)以上的毒力因子的菌株有14株（8.97%），在組合類(lèi)別中，含有一個(gè)毒力因子的菌株所占的比例最高，為51.28%。

3 討 論

盡管腹瀉源性大腸桿菌通常集中于某些特定的血清型，但大腸桿菌的致病性并不完全與血清型有關(guān)，而主要是取決于其特定的毒力因子，如毒素、菌毛以及毒力島等。控制這些毒力因子的基因位于染色體上某些特殊的位點(diǎn)或染色體以外的基因（如質(zhì)粒）。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是直接處理病料，分離鑒定病原，檢測(cè)毒力因子，其費(fèi)時(shí)費(fèi)力，檢出率低，特異性差，PCR方法用于大腸桿菌毒力因子的檢測(cè)具有敏感、特異、快速等優(yōu)點(diǎn)。大腸桿菌致病性與其所攜帶的毒力基因密切相關(guān)，本研究對(duì)犢牛腹瀉大腸桿菌的毒力因子進(jìn)行檢測(cè)，在156株大腸桿菌分離株中，菌毛基因K88檢出率為19.23%，在37℃時(shí)表達(dá)良好，能凝集多種動(dòng)物的紅細(xì)胞。腸毒素VT1（stx1特異性片段）、VT2all（stx2/stx2e特異性片段）、SLT2（stx2特異性片段）檢出率偏高，含有stx1⁺和stx2⁺兩種毒素的大腸桿菌屬于EHEC，在本次分離的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)是50株（32.05%），含有stx1⁺和stx2⁺兩種毒素的大腸桿菌人感染的重要病原體，部分是由于細(xì)菌與宿主細(xì)胞的緊密附著，由緊密蛋白介導(dǎo)，所述的緊密蛋白由eae基因以及至少一種志賀毒素基因（stx1/stx2）編碼，兩種毒素導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉，且攜帶毒素?cái)?shù)量與菌株的毒力呈正比，stx1檢出率均高于stx2。

HPI毒力島、LEE毒力島檢出率較高，毒力島并不是先天的，是后天在進(jìn)化過(guò)程中獲得的，并且可以在不同菌株之間水平傳播，HPI（irp2）作為鐵調(diào)節(jié)基因，僅存在于強(qiáng)致病株中，與毒力密切相關(guān)，是判斷和檢測(cè)其它病源菌是否存在HPI（irp2）的標(biāo)志基因。本研究中毒力基因irp2的檢出率為52.56%。本試驗(yàn)中LEE（eae）檢出率為25.64%，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的檢出率相似^[12]。VT1、VT2all、SLT2檢出率分別為24.36%、21.79%、12.82%，高于國(guó)內(nèi)外報(bào)道的檢出率^[13-14]。

本試驗(yàn)中共檢測(cè)出26種陽(yáng)性毒力譜，高于國(guó)內(nèi)外報(bào)道的檢出率^[13-14]。毒力因子組合復(fù)雜，各個(gè)組合檢出率較低，要研究犢牛的毒力譜與腹瀉率的關(guān)系需要進(jìn)行更深入的探索。由于K88、HPI、LEE、VT1、VT2all、SLT2檢測(cè)率較高，針對(duì)五種毒力因子對(duì)犢牛進(jìn)行大腸桿菌病針對(duì)性治療，并對(duì)發(fā)生該病的牛場(chǎng)和養(yǎng)殖戶(hù)采取積極的防制措施。上述檢測(cè)出的毒力因子與EHEC菌株高檢出率提示應(yīng)重視牛源大腸桿菌的監(jiān)測(cè)及其對(duì)公共衛(wèi)生的威脅。并且認(rèn)為寧夏地區(qū)牛場(chǎng)存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，需要加強(qiáng)管理。菌株間毒力基因的差異是導(dǎo)致大腸桿菌致病力差異的重要原因，有必要對(duì)毒力因子進(jìn)行定期檢測(cè)，以便有效地防治大腸桿菌引起的犢牛腹瀉，為其防治提供參考依據(jù)。本試驗(yàn)對(duì)寧夏地區(qū)犢牛腹瀉源性大腸桿菌毒力因子組合類(lèi)型研究進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)調(diào)查，對(duì)該疾病的診斷和有效預(yù)防提供一定的科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)寧夏部分地區(qū)犢牛源腹瀉源性大腸桿菌進(jìn)行細(xì)菌病原分離、16S rRNA PCR和相關(guān)毒力因子PCR的分子生物學(xué)試驗(yàn)等一系列研究方法，表明大腸桿菌在寧夏部分地區(qū)發(fā)生腹瀉牛群中具有很高的流行率，分離株毒力因子組合復(fù)雜。K88、HPI、LEE、VT1、VT2all、SLT2是從腹瀉犢牛分離的大腸桿菌中檢出率較高的毒力因子，發(fā)現(xiàn)26種不同的毒力譜，毒力基因種類(lèi)多樣。有必要對(duì)犢牛源腹瀉性大腸桿菌的流行情況進(jìn)行持續(xù)的調(diào)查研究，為犢牛源大腸桿菌病的防治提供依據(jù)和參考。

參考文獻(xiàn)（References）：

[1]韓和祥.四川省部分規(guī)?；馀ｐB(yǎng)殖場(chǎng)致?tīng)倥８篂a大腸桿菌的血清型鑒定與耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2019（4）：107-109.

HAN HX.Serotype identification and antibiotic resistance analysis of Escherichia coli causing calf diarrhea in some large-scale beef cattle farms in Sichuan Province[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2019（4）：107-109.（in Chinese）

[2]劉英玉，張 妍，夏利寧，等.伊犁地區(qū)肉牛源產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的血清型和ERIC-PCR基因型研究[J].食品工業(yè)科技，2017，38（22）：140-144，162.

LIU YY，ZHANG Y，XIA LN，et al.Study on serotype and ERIC-PCR typing of Shiga toxin-producing Escherichia coli in Yili area[J].Science and Technology of Food Industr，2017，38（22）：140-144，162.（in Chinese）

[3]劉 源，李紅麗，閆益波，等.山西省犢牛腹瀉致病性大腸桿菌毒力因子篩查[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2021，41（8）：1552-1557.

LIU Y，LI HL，YAN YB，et al.Screening of virulence associated factors of pathogenic Escherichia coli in calves from Shanxi Province[J].Chinese Journal of Veterinary Science，2021，41（8）：1552-1557.（in Chinese）

[4]孫 月，王 琪，毛 偉，等.內(nèi)蒙古地區(qū)犢牛腹瀉大腸桿菌耐藥性分析及毒力基因檢測(cè)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2023，50（9）：3811-3822.

SUN Y，WANG Q，MAO W，et al.Drug resistance analysis and virulence gene detection of Escherichia coli causing calf diarrhea in Inner Mongolia[J].China Animal Husbandryamp;Veterinary Medicine，2023，50（9）：3811-3822.（in Chinese）

[5]ALGAMMAL AM，EL-KHOLY AW，RIAD EM，et al.Genes encoding the virulence and the antimicrobial resistance in enterotoxigenic and Shiga-toxigenic E.coli Isolated from Diarrheic Calves[J].Toxins（Basel），2020，12（6）：383.

[6]賈 垌.京津冀地區(qū)犢牛源大腸桿菌的毒力因子鑒定和耐藥性分析[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

JIA D.Virulence factor identification and drug resistance analysis of calf-derived Escherichia coli in Beijing-Tianjin-Hebei region[D].Baoding：Hebei Agricultural University，2022.（in Chinese）

[7]張 震，宋美英，只 勇，等.黑龍江省部分牛場(chǎng)致病性大腸桿菌毒力因子的調(diào)查與分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017（3）：160-162，166.

ZHANG Z，SONG MY，ZHI Y，et al.Investigation and analysis of the virulence factors of pathogenic Escherichia coli from some cattle ranches in Heilongjiang Province[J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2017（3）：160-162，166.（in Chinese）

[8]BONINO MP，CRIVELLI XB，PETRINA JF，et al.Detection and analysis of Shiga toxin producing and enteropathogenic Escherichia coli in cattle from Tierra del Fuego，Argentina[J].Braz JMicrobiol，2023，54（2）：1257-1266.

[9]AUVRAY F，BIèCHE-TERRIER C，UM MM，et al.Prevalence and characterization of the seven major serotypes of Shiga toxin-producing Escherichia coli（STEC）in veal calves slaughtered in France[J].Vet Microbiol，2023，282：109754.

[10]GREEN BA，NEILL RJ，RUYECHAN WT，et al.Evidence that anew enterotoxin of Escherichia coli which activates adenylate cyclase in eucaryotic target cells is not plasmid mediated[J].Infect Immun，1983，41（1）：383-390.

[11]WIRIYAPROM R，NGASAMAN R，KAEWNOI D，et al.Prevalence and virulent gene profiles of sorbitol non-fermenting Shiga toxin-producing Escherichia coli isolated from goats in Southern Thailand[J].Trop Med Infect Dis，2022，7（11）：357.

[12]鄭曉風(fēng)，張 妍，劉英玉，等.新疆部分地區(qū)牛羊源產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌菌株檢測(cè)與分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2020，51（10）：2518-2527.

ZHENG XF，ZHANG Y，LIU YY，et al.Detection and analysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates from cattle and sheep sources in some regions of Xinjiang，China[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2020，51（10）：2518-2527.（in Chinese）

[13]王 曉，王 新，郝 丹，等.奶牛乳源大腸桿菌耐藥性、毒素基因鑒定及PFGE分型研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，45（03）：463-470.

WANG X，WANG X，HAO D，et al.Study on antibiotic resistance，virulence toxin genes and PFGE patterns of Escherichia coli strains isolated from dairy cattle milk[J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2014，45（3）：463-470.（in Chinese）

[14]SHINDE DB，SINGHVI S，KORATKAR SS，et al.Isolation and characterization of Escherichia coli serotype O157：H7and other verotoxin-producing E.coli in healthy Indian cattle[J].Vet World，2020，13（10）：2269-2274.

（編輯 白永平）