摘 要： 旨在以AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路為切入點(diǎn)，探討白果內(nèi)酯改善白介素1β（IL-1β）誘導(dǎo)的ATDC5軟骨細(xì)胞炎性損傷的作用機(jī)制。采用IL-1β（10 ng·mL-1）誘導(dǎo)ATDC5軟骨細(xì)胞炎性損傷來構(gòu)建體外骨關(guān)節(jié)炎模型，隨機(jī)分為對照組，IL-1β組，IL-1β和白果內(nèi)酯共同處理組，其中，共同處理組按照白果內(nèi)酯的應(yīng)用濃度又分為低、中和高（15、30和60 μmol·L-1）3個不同劑量組。免疫印跡法（Western blot）和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測各組軟骨細(xì)胞中ADAMTS4、PGC-1a、Collagen Type II、MMP-3、NRF-1和Fis1的蛋白與mRNA表達(dá)情況。試劑盒檢測各組ATP含量，并通過免疫熒光方法檢測SIRT3表達(dá)水平。Western blot檢測AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路相關(guān)蛋白p-AMPK、AMPK和SIRT3表達(dá)水平。使用Compound C和3-TYP處理ATDC5軟骨細(xì)胞，構(gòu)建AMPK-SIRT3信號通路阻斷模型，檢測下游PGC-1a、NRF-1和Fis1蛋白變化。結(jié)果顯示，白果內(nèi)酯通過下調(diào)ADAMTS4和MMP-3表達(dá)（Plt;0.05），促進(jìn)Type II collagen表達(dá)（Plt;0.05）來調(diào)節(jié)ECM代謝平衡，并促進(jìn)ATP合成。在機(jī)制上，白果內(nèi)酯干預(yù)軟骨細(xì)胞后p-AMPK、SITR3、PGC-1a和NRF-1水平顯著升高（Plt;0.05），而Fis1蛋白水平顯著降低（Plt;0.05），并且使用Compound C和3-TYP預(yù)處理軟骨細(xì)胞后，PGC-1a、NRF-1和Fis1蛋白水平被不同程度抑制。綜上所述，結(jié)果提示白果內(nèi)酯通過AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路激活PGC-1a，調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生改善ATDC5軟骨細(xì)胞炎性損傷。

關(guān)鍵詞： 軟骨細(xì)胞；炎性損傷；白果內(nèi)酯；AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路；線粒體生物發(fā)生

中圖分類號： S857.16；S859.7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3714-11

收稿日期：2023-10-26

基金項目：中國博士后科學(xué)基金項目（2023TQ0053）；黑龍江省自然科學(xué)基金項目（LH2023C025；YQ2023C015）

作者簡介：李亞楠（1992-），女，黑龍江哈爾濱人，講師，主要從事大動物普通病研究，E-mail：13796685756@163.com；馬天文（1995-），男，滿族，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，博士，主要從事大動物普通病研究，E-mail： dnmatianwen@163.com；李亞楠和馬天文為同等貢獻(xiàn)作者

通信作者：魏成威，主要從事動物疾病診療與研究，E-mail：neauweiwei@126.com

Bilobalide Regulates Mitochondrial Biogenesis Mediated by AMPK-SIRT3 Positive Feedback

Loop and Improves Inflammatory Damage of ATDC5 Chondrocytes

LI" Ya’nan1， MA" Tianwen1， MA" Yuhui2， WEI" Chengwei1*

（1.Heilongjiang Key Laboratory of Animal Disease Pathogenesis and Comparative Medicine， College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural University， Harbin 150030，" China;

2.Animal Husbandry

and Veterinary Development Center， Zhaosu County， Ili Kazakh Autonomous Prefecture， Zhaosu 835500，

China）

Abstract：" This study takes the AMPK-SIRT3 positive feedback loop as the starting point. The purpose is to explore the mechanism of improvement of bilobalide on inflammatory damage induced interleukin-1β （IL-1β） in ATDC5 chondrocytes. Using IL-1β to induce inflammatory damage of ATDC5 chondrocytes to construct an osteoarthritis model in vitro. Randomly divided into 5 groups （a control group， IL-1β group， IL-1β group cotreated with bilobalide） which cotreatment group is further divided into low， medium， and high dose groups based on the application concentration of bilobalide （15， 30 and 60 μmol·L-1）. Western blot and real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） methods were used to detect the protein and mRNA expression of ADAMTS4， PGC-1a， Collagen Type II， MMP-3， NRF-1， and Fis1 in each group. A reagent kit was used to detect the ATP content in each group. The expression level of SIRT3 was detected by immunofluorescence. Western blot was used to detect the levels of AMPK-SIRT3 positive feedback loop related proteins （p-AMPK， AMPK， and SIRT3）. Construct an AMPK-SIRT3 signaling pathway blockade model by treating ATDC5 chondrocytes with Compound C and 3-TYP. Mainly detecting downstream related protein changes （PGC-1a， NRF-1， and Fis1）. The results showed that bilobalide down-regulated the expression of ADAMTS4 and MMP-3 （Plt;0.05）， promoted the expression of Type II collagen （Plt;0.05）， regulated ECM metabolic balance， and promoted ATP synthesis. Mechanistically， after intervention with bilobalide， p-AMPK， SITR3， PGC-1a and NRF-1 levels （Plt;0.05） significantly increased while Fis1 levels （Plt;0.05） significantly decreased. After pre-treatment with Compound C and 3-TYP in ATDC5 chondrocytes， PGC-1a， NRF-1 and Fis1 protein levels were inhibited to varying degrees. In summary， bilobalide activates the expression of PGC-1a through the AMPK-SIRT3 positive feedback loop and regulates mitochondrial biogenesis to improve inflammatory damage in ATDC5 chondrocytes.

Key words： chondrocytes; inflammatory damage; bilobalide; AMPK-SIRT3 positive feedback loop; mitochondrial biogenesis

*Corresponding author：" WEI Chengwei， E-mail： neauweiwei@126.com

肢蹄病是運(yùn)動系統(tǒng)疾病，主要涉及家畜四肢或蹄部。其是繼奶牛乳房炎和繁殖疾病后，嚴(yán)重影響牛場經(jīng)濟(jì)效益的第三大疾病，同時也是導(dǎo)致賽馬提前退役的主要疾病之一，嚴(yán)重阻礙畜牧業(yè)的健康發(fā)展［1-2］。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）針對肢蹄病發(fā)病率的統(tǒng)計顯示，在發(fā)達(dá)國家約為15%，在發(fā)展中國家為30%～40%。研究表明，因跛行導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失約100～420美元·頭-1，且淘汰的奶牛大多為高產(chǎn)奶牛［3-4］。骨關(guān)節(jié)炎是導(dǎo)致高產(chǎn)奶牛跛行的主要肢蹄病，以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變?yōu)樘卣鞯年P(guān)節(jié)骨系統(tǒng)的一種慢性增生性炎癥疾病，臨床主要表現(xiàn)為跛行、站立姿勢異常、起臥困難、疼痛和消瘦等癥狀［5］。獸醫(yī)臨床在治療該類疾病時沒有特效藥，常使用的糖皮質(zhì)激素和非甾體類抗炎藥物只能夠緩解疼痛并不能改善軟骨退變，且有胃腸道紊亂、心血管風(fēng)險和肝毒性的副作用［6］。因此，亟需研發(fā)安全且副作用小、具有抑制軟骨退變的新型防治藥物，對保護(hù)動物健康，減少肢蹄病造成的經(jīng)濟(jì)損失，提升行業(yè)效益具有重要意義。

目前，天然產(chǎn)物因其安全、多樣的生物活性而備受關(guān)注，成為開發(fā)骨關(guān)節(jié)炎防治藥物的研究熱點(diǎn)。來自不同類型的天然產(chǎn)物被廣泛用于防治骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)研究，如多酚［7］、黃酮類化合物［8］、生物堿［9］、萜類化合物［10］和類固醇［11］。其中，銀杏葉（Ginkgo biloba L. extract，EGb）具有活血化濕、止痛和促進(jìn)血液循環(huán)等功能［12］。銀杏葉來源的白果內(nèi)酯（bilobalide，BB），因其具有抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等藥理作用而備受關(guān)注［13］。近期研究認(rèn)為BB具有抗軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解的藥理作用，不少學(xué)者對BB的軟骨保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了初步探索，有學(xué)者認(rèn)為BB通過AMPK/SIRT1通路來改善人軟骨退變和軟骨下骨硬化［14］。也有學(xué)者認(rèn)為，BB通過JNK和NF-κB通路下調(diào)microRNA-125a，抑制IL-17誘導(dǎo)的ATDC5軟骨細(xì)胞炎性損傷［15］，這些都說明BB具有保護(hù)軟骨退變的作用。此外，在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，BB具有促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)ATDC5軟骨細(xì)胞自噬并且抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)軟骨細(xì)胞的作用［16］，但是系統(tǒng)全面的調(diào)控機(jī)制尚需拓展。

線粒體是軟骨細(xì)胞的重要能量代謝中心，其功能障礙被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制［17］。線粒體生物發(fā)生是線粒體生長或新生的復(fù)雜過程，該過程涉及線粒體內(nèi)、外膜和線粒體編碼蛋白質(zhì)的合成，核編碼蛋白質(zhì)的合成以及線粒體DNA的復(fù)制［18］。線粒體生物發(fā)生是維持線粒體正常數(shù)量和功能的關(guān)鍵生物過程之一，其中，過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1a（peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1a，PGC-1a）是該過程的重要調(diào)控因子［19］。AMPK（adenosine monophosphate-activated protein kinase， AMPK）通過調(diào)控PGC-1a抑制軟骨細(xì)胞分解代謝反應(yīng)和氧化應(yīng)激［20］。SIRT3（Sirtuin 3）在人軟骨細(xì)胞中被AMPK激活，并在減少線粒體DNA中發(fā)揮作用，提示SIRT3參與了線粒體的生物發(fā)生［19］。因此，PGC-1a是AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路的關(guān)鍵下游分子，參與軟骨細(xì)胞線粒體生物發(fā)生的調(diào)控［21］?；诖耍驹囼炌ㄟ^構(gòu)建體外骨關(guān)節(jié)炎模型，探究AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路介導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生在BB干預(yù)軟骨細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，為全面解析BB的軟骨保護(hù)機(jī)制提供新思路，為動物骨關(guān)節(jié)炎藥物的研發(fā)提供新方向，為今后臨床實踐中BB的研究和應(yīng)用以及新靶點(diǎn)藥物的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料來源

ATDC5小鼠成軟骨細(xì)胞系購買于自上海中喬新舟生物科技有限公司（貨號：ZQ0938）；BB（純度≥98%，CAS：33570-04-6）購自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco，美國）；10%胎牛血清（BI，以色列）；1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基補(bǔ)充劑（ITS）（Sigma，美國）和RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白分析試劑盒（Sigma，美國）；胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher，美國）；1%青霉素-鏈霉素，5%牛血清白蛋白（BSA）和SDS-PAGE凝膠超快速配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；PBS（北京索萊寶科技有限公司，中國）；均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國）；重組小鼠IL-1β、3-TYP、Compound C（HY-P7073、HY-108331、HY-13418、MedChemExpress，美國）；總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）試劑盒（R312-01/02）和AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒（Q511-02/03）購自（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；AMPK、SIRT3、ADAMTS4、PGC-1a抗體購自（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；p-AMPK抗體（Affinity Biosciences，中國）；Collagen Type II、MMP-3、NRF-1、Fis1、GAPDH抗體購自（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；山羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗和山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器

自動凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，中國）；羅氏480定量PCR儀（Roche，美國）；尼康A(chǔ)1熒光倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；電泳儀（BIO-RAD公司，美國）；恒溫培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；和微量核酸蛋白濃度測定儀（Thermo，美國）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用含有10% 胎牛血清，1% 青霉素-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)ATDC5細(xì)胞，將其置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5% CO2，95%相對濕度）。在80%融合時，用胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞傳代。添加1% ITS來誘導(dǎo)ATDC5細(xì)胞分化為表達(dá)軟骨表型標(biāo)記基因［22］的軟骨樣細(xì)胞，在細(xì)胞誘導(dǎo)14 d后［23］，進(jìn)行后續(xù)的實驗研究。

試驗分為對照組（Control group），IL-1β組（IL-1β group，10 ng·mL-1），IL-1β和BB共同處理組（IL-1β+BB group），其中，共同處理組按照BB的應(yīng)用濃度又分為低、中和高（15、30和60 μmol·L-1）3個不同劑量組，BB劑量的選擇參考之前的研究［24］。

1.5 Western blot檢測目的蛋白

用含有PMSF的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞來提取總蛋白后，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。每份樣品（蛋白等量，25 μg）經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳處理后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5% BSA封閉PVDF膜（37 ℃，1 h）后，進(jìn)行抗體孵育（4 ℃，過夜）。不同的PVDF膜孵育不同的抗體：AMPK（1∶2 000）、SIRT3（1∶1 000）、ADAMTS4（1∶1 000）、PGC-1a（1∶1 000）、p-AMPK（1∶1 000）、Collagen Type II（1∶1 000）、MMP-3（1∶1 000）、NRF-1（1∶2 000）、Fis1（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）。然后，不同的PVDF膜與相應(yīng)的二抗孵育1 h。滴加ECL緩沖液后，應(yīng)用自動凝膠圖像分析系統(tǒng)呈像。最后，使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析蛋白質(zhì)含量。

1.6 qRT-PCR檢測軟骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)

使用總RNA提取試劑盒提取各組軟骨細(xì)胞的總RNA后，測定濃度。應(yīng)用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）試劑盒將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量采用2-ΔΔCt 方法進(jìn)行計算。引物序列見表1。

1.7 ATP含量檢測

嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。收集各組軟骨細(xì)胞于離心管內(nèi)，棄上清液后得到細(xì)胞沉淀（數(shù)量達(dá)到106個）。加入冷的雙蒸水（300～500 μL）后，進(jìn)行勻漿破碎（需置于冰水浴中）。測定蛋白濃度后，置于沸水浴中加熱（10 min），混勻抽提后用于ATP含量檢測（按順序加入配制的各種工作液，室溫靜置5 min，在636 nm，0.5 cm光徑，測吸光度）。

1.8 免疫熒光試驗

將各組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板中，用PBS緩沖液清洗（2 min，3次）。滴加4%多聚甲醛進(jìn)行固定（室溫，10 min），隨后再用PBS緩沖液清洗（2 min，3次）。滴加0.5% Triton X-100溶液進(jìn)行透化（室溫，13 min），隨后再用PBS緩沖液清洗（2 min，3次）。滴加2% BSA溶液進(jìn)行封閉（室溫，1 h）。滴加SIRT3抗體（1∶200），4℃過夜孵育后，再用PBS緩沖液清洗（2 min，3次）。滴加相對應(yīng)的熒光二抗Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗兔IgG（H+L）（室溫，1 h），再用PBS緩沖液清洗（2 min，3次）。滴加DAPI溶液（室溫，7 min），再用PBS緩沖液清洗（2 min，3次）。進(jìn)行封片后，置于共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察，拍照。

1.9 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)相關(guān)結(jié)果以“x-±s”表示。至少進(jìn)行3個獨(dú)立試驗來確認(rèn)結(jié)果，并通過單因素方差分析（one-way ANOVA）來檢測組之間的差異性。使用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。Plt;0.05 被認(rèn)為表示具有顯著性，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BB調(diào)節(jié)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞ECM代謝平衡

如圖1所示，在10 ng·mL-1" IL-1β單獨(dú)處理軟骨細(xì)胞24 h后，ECM分解酶ADAMTS4和MMP-3蛋白（圖1A和B）和mRNA（圖1C）含量極顯著增加（Plt;0.01）；ECM合成酶Type II collagen蛋白（圖1A和B）和mRNA（圖1C）含量顯著減少（Plt;0.05）。BB和IL-1β共同處理軟骨細(xì)胞后可以拮抗這些作用。上述結(jié)果表明，BB可以通過下調(diào)ADAMTS4和MMP-3的表達(dá)，促進(jìn)Type II collagen表達(dá)來調(diào)節(jié)ECM代謝平衡，保護(hù)ATDC5軟骨細(xì)胞免受IL-1β誘導(dǎo)的炎性損傷。

2.2 BB對軟骨細(xì)胞線粒體ATP合成的影響

如圖2所示，與對照組比較，IL-1β單獨(dú)處理軟骨細(xì)胞組的線粒體ATP含量極顯著下降（Plt;0.01）。與IL-1β組比較，IL-1β和BB共同處理軟骨細(xì)胞后，IL-1β+30 μmol·L-1 BB組和IL-1β+60 μmol·L-1 BB組的ATP含量極顯著升高（Plt;0.01）。上述結(jié)果表明，BB可以促進(jìn)ATP的合成過程，增加ATDC5軟骨細(xì)胞的ATP含量。

2.3 BB對軟骨細(xì)胞線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因和蛋白的影響

如圖3所示，與對照組比較，IL-1β單獨(dú)處理軟骨細(xì)胞中PGC-1a蛋白和mRNA水平極顯著降低（Plt;0.01），NRF-1蛋白（圖3A和B）和mRNA（圖3C）水平顯著降低（Plt;0.05）。此外，線粒體分裂相關(guān)蛋白Fis1蛋白（圖3A和B）和mRNA（圖3C）水平極顯著增高（Plt;0.01）。與IL-1β組比較，IL-1β和BB共同處理軟骨細(xì)胞后PGC-1a和NRF-1的蛋白（圖3A和B）和mRNA（圖3C）水平顯著升高（Plt;0.05或Plt;0.01），F(xiàn)is1的蛋白（圖3A和B）和mRNA（圖3C）水平顯著降低（Plt;0.05或Plt;0.01）。上述結(jié)果表明，BB可能通過促進(jìn)ATDC5軟骨細(xì)胞的線粒體生物合成過程，并減少線粒體分裂，來發(fā)揮保護(hù)作用。

2.4 BB促進(jìn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞SIRT3蛋白表達(dá)

免疫熒光法檢測SIRT3蛋白的表達(dá)（圖4）。與對照組比較，IL-1β單獨(dú)處理后，SIRT3蛋白在細(xì)胞內(nèi)紅色熒光減弱。與IL-1β組相比，IL-1β和60 μmol·L-1 BB共同處理ATDC5軟骨細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)紅色熒光增多，說明BB能夠促進(jìn)SIRT3表達(dá)。

2.5 BB對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路的影響

如圖5所示，與對照組比較，IL-1β單獨(dú)處理軟骨細(xì)胞中p-AMPK蛋白水平顯著降低（Plt;0.05），SIRT3蛋白水平極顯著降低（Plt;0.01）。與IL-1β組比較，IL-1β和BB共同處理軟骨細(xì)胞后p-AMPK和SIRT3蛋白水平呈劑量依賴性升高（Plt;0.05）。這些結(jié)果說明，BB能夠激活A(yù)TDC5軟骨細(xì)胞ATP的表達(dá)水平AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路。

2.6 Compound C和3-TYP預(yù)處理軟骨細(xì)胞后AMPK-SIRT3介導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白和ECM代謝蛋白變化

為驗證BB對AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路介導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白的影響，使用AMPK蛋白抑制劑Compound C和SIRT3蛋白抑制劑3-TYP預(yù)處理ATDC5軟骨細(xì)胞，構(gòu)建AMPK-SIRT3信號通路阻斷模型。試驗分為5組：對照組、IL-1β組、IL-1β+60 μmol·L-1 BB組、IL-1β+60 μmol·L-1 BB+Compound C組和IL-1β+60 μmol·L-1 BB+3-TYP組。結(jié)果顯示（圖6），PGC-1a和NRF-1蛋白表達(dá)量極顯著降低（Plt;0.01），而Fis1蛋白表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01），說明抑制AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路后，PGC-1a、NRF-1和Fis1蛋白水平較BB干預(yù)組被不同程度的抑制。同時，ECM合成酶Type II collagen蛋白表達(dá)量極顯著降低（Plt;0.01），而ECM分解酶ADAMTS4和MMP-3蛋白表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01），說明抑制AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路后，Type II collagen、ADAMTS4和MMP-3蛋白水平較BB干預(yù)組被不同程度的抑制。綜上，AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路在BB干預(yù)過程中起到關(guān)鍵作用。

3 討 論

動物骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病早期并沒有明顯的臨床癥狀，確診時往往已經(jīng)錯過治療的黃金期，臨床獸醫(yī)師對很多頑固性骨關(guān)節(jié)炎疾病依然束手無策。天然產(chǎn)物因其安全性高、生物活性多樣性等優(yōu)點(diǎn)吸引了廣大科學(xué)家的興趣。其中，BB作為銀杏葉提取物的唯一倍半萜內(nèi)酯化合物，因其具有抗炎特性的特點(diǎn)［25］，故而本課題組探究其作為潛在的骨關(guān)節(jié)炎的防治藥物的可行性。為了探討B(tài)B在骨關(guān)節(jié)炎中是否具有保護(hù)作用，本研究通過構(gòu)建軟骨細(xì)胞炎性損傷模型來進(jìn)行驗證，以期為動物骨關(guān)節(jié)炎防治藥物的開發(fā)提供前期基礎(chǔ)。有研究表明，促炎因子IL-1β在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮關(guān)鍵作用［26］，以時間和濃度依賴方式誘導(dǎo)不同程度的軟骨炎性損傷，其中 IL-1β（10 ng·mL -1）干預(yù)軟骨細(xì)胞24 h可誘導(dǎo)細(xì)胞炎性損傷，加速軟骨細(xì)胞ECM降解［27］。所以，在本研究中，選取IL-1β（10 ng·mL -1）作為骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)劑，構(gòu)建ATDC5軟骨細(xì)胞炎性損傷模型。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β刺激ATDC5軟骨細(xì)胞24 h后，ADAMTS4和MMP-3蛋白表達(dá)顯著增加，Type II collagen蛋白表達(dá)顯著降低，說明軟骨細(xì)胞炎性損傷模型構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)研究。此外，值得注意的是，BB能夠抑制ADAMTS4和MMP-3的表達(dá)，增加Type II collagen蛋白表達(dá)。這表明BB具有抗炎和平衡ECM代謝的作用。

為了探究BB改善軟骨細(xì)胞炎性損傷的機(jī)制，進(jìn)行一系列分子試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與IL-1β組比較，IL-1β和BB共同處理軟骨細(xì)胞后，ATP含量呈劑量依賴性升高，這提示其作用機(jī)制可能與能量代謝中心——線粒體存在密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物可以通過PGC-1a來調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮抗炎作用［28］。例如，巴戟天多糖通過抑制PGC-1a/PPARγ通路增強(qiáng)抗氧化能力，來減輕大鼠骨質(zhì)疏松癥（通過切除雙側(cè)卵巢建立）［29］。人參皂苷Rg3通過調(diào)控SIRT1/PGC-1a/SIRT3/p38 MAPK/NF-κB信號通路減少TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中IL-8和MMP-9的產(chǎn)生，發(fā)揮改善軟骨炎性損傷的作用［30］。槲皮素通過調(diào)節(jié)SIRT1/PGC-1a/NRF1/TFAM通路改善受損的線粒體生物合成和線粒體功能，并通過HMGB1/TLR4/p38/ERK1/2/NF-κB p65通路來抑制炎癥［31］。這些都能證明天然產(chǎn)物和PGC-1a在抗炎作用中，是有一定聯(lián)系的。有研究表明，在線粒體生物發(fā)生過程中，PGC-1a被激活并與核轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，包括核呼吸因子-1和-2（NRF-1和NRF-2），隨后，NRF-1和NRF-2上調(diào)核編碼線粒體蛋白（NEMPs）和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）的表達(dá)，使它們易位到線粒體中，促進(jìn)線粒體基因的表達(dá)［32］。裂變蛋白1（Fis1）是線粒體分裂蛋白，線粒體的過度分裂，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時，機(jī)體可通過線粒體自噬機(jī)制來徹底清除受損的線粒體［33］。在本研究中，BB干預(yù)軟骨細(xì)胞后PGC-1a和NRF-1表達(dá)顯著升高，而Fis蛋白表達(dá)顯著降低。這說明BB通過調(diào)控PGC-1a/NRF-1/Fis1途徑維持線粒體穩(wěn)態(tài)，來緩解IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞線粒體功能障礙。

研究表明AMPK和SIRT3能夠相互調(diào)節(jié)，其在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)和活性是一致的，這表明軟骨細(xì)胞中，存在AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展的可能性［21］。本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中AMPK和SIRT3蛋白表達(dá)顯著降低，而BB干預(yù)后其表達(dá)均顯著增多，這也證明了上述觀點(diǎn)。有研究認(rèn)為，AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路參與機(jī)體許多疾病的調(diào)節(jié)。例如，溫肺化纖湯可通過AMPK/SIRT3途徑減輕H2O2誘導(dǎo)的肺間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體功能障礙和代謝失衡［34］。延髓頭端腹外側(cè)中小膠質(zhì)細(xì)胞來源的TNF-α可能通過抑制AMPK-SIRT3通路損害應(yīng)激性高血壓中的神經(jīng)元線粒體功能［35］。Metrn1通過調(diào)控AMPK-SIRT3通路維持線粒體穩(wěn)態(tài)，并通過SIRT3促進(jìn)產(chǎn)熱，從而減輕脂質(zhì)積累［36］。在本研究中，BB處理軟骨細(xì)胞后，PGC-1a和NRF-1蛋白顯著升高，但使用Compound C或3-TYP預(yù)處理細(xì)胞后，PGC-1a和NRF-1表達(dá)被不同程度的抑制，這說明BB是通過激活A(yù)MPK-SIRT3環(huán)路來介導(dǎo)線粒體生物發(fā)生；此外，應(yīng)用Compound C或3-TYP預(yù)處理細(xì)胞后，F(xiàn)is1的表達(dá)升高，說明BB是通過激活A(yù)MPK-SIRT3環(huán)路來抑制線粒體分裂。這些都說明BB通過APMK-SIRT3正反饋環(huán)路，介導(dǎo)線粒體生物發(fā)生且抑制線粒體分裂，參與軟骨細(xì)胞線粒體動態(tài)調(diào)節(jié)。然而，BB通過AMPK-SIRT3環(huán)路介導(dǎo)的下游交互作用機(jī)制還有待深入研究。本研究通過ATDC5軟骨細(xì)胞構(gòu)建體外炎性損傷模型，探究AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路介導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生在BB干預(yù)軟骨細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。然而，BB作為天然產(chǎn)物在動物體內(nèi)的應(yīng)用和效果還有待進(jìn)一步研究。同時，在研究其臨床應(yīng)用的可能性之前，需要廣泛的BB藥理學(xué)和毒性學(xué)研究。盡管如此，本研究結(jié)果仍然可為BB對骨關(guān)節(jié)炎的改善機(jī)制提供新的見解。

4 結(jié) 論

BB通過AMPK-SIRT3正反饋環(huán)路激活PGC-1a，調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生，從而改善ATDC5軟骨細(xì)胞炎性損傷。

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（編輯 白永平）