關(guān)鍵詞：香茅草；功能性資源；評價

中圖分類號：S543 文獻標志碼：A

香茅草（Cymbopogon citratus）別名檸檬草，為禾本科香茅屬多年生草本植物。香茅草原產(chǎn)于印度、斯里蘭卡等地[1]，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在馬來西亞、越南、泰國、印度等國家大面積種植。目前，在我國海南、云南、廣西、福建等地區(qū)均有分布和種植[2]。近年來，云南省金平縣引進香茅草優(yōu)質(zhì)種苗和提供種植技術(shù)，大力發(fā)展香茅草產(chǎn)業(yè)，實現(xiàn)了規(guī)模化種植。香茅草作為藥食同源植物，有疏風通絡(luò)、和胃通氣、醒腦等功效[3]。其精油因天然安全性高、抑菌抗氧化特性優(yōu)良、環(huán)境可降解等優(yōu)勢，且生長周期較短、易于栽培，適合發(fā)展大規(guī)模種植[4]。但云南香茅產(chǎn)業(yè)發(fā)展還存在著許多問題，具體表現(xiàn)為資源評價滯后、栽培品種匱乏、病蟲害嚴重和精深加工滯后等問題，嚴重地制約著香茅產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。以功能性成分為導(dǎo)向，開展香茅種質(zhì)資源研究，在此基礎(chǔ)上進行香茅優(yōu)良品種的篩選和新產(chǎn)品研發(fā)，是實現(xiàn)香茅產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根本保證。

目前，對香茅草化學成分的研究主要集中在揮發(fā)性成分方面[5-6]。除了揮發(fā)性成分外，香茅草中還含有非揮發(fā)性萜類、黃酮類、多酚類、生物堿類等多種生物活性成分[7]。黃酮類成分具有抗自由基、抗菌、抗氧化、抗衰老等功效[8]，在醫(yī)藥和營養(yǎng)保健方面具有較大的應(yīng)用前景；生物堿類成分具有抗腫瘤、止咳平喘、鎮(zhèn)痛抗炎等藥理作用[9-10]，具有良好的研究價值；甜菜堿廣泛存在于植物體內(nèi)，在香茅草水提物中也含有甜菜堿，甜菜堿是一種生物堿，具有促進脂質(zhì)代謝和抗脂肪肝作用[11]，可改善小鼠腸道功能[12]，降低母豬的便秘發(fā)生率[13]。肉蓯蓉水溶液具有明顯的通便作用，楊翠平等[14]推測肉蓯蓉潤腸通便的機理可能與甜菜堿有關(guān)。GAO 等[15]通過便秘動物模型試驗表明，香茅草水提物具有通便功效，可通過促進便秘小鼠小腸蠕動，緩解便秘癥狀，而甜菜堿為香茅草水提物中主要的單體成分，因此推測香茅草通便功效與甜菜堿相關(guān)，需對甜菜堿通便功效實驗作進一步驗證。

本研究利用廣靶代謝組學分析香茅草水提物中的主要成分，首次通過洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘小鼠模型驗證甜菜堿的通便作用；采用分光光度法，檢測45 份香茅草資源水提物中的甜菜堿、生物堿類和黃酮類成分，分析不同保存地、不同地區(qū)、不同海拔香茅草資源的甜菜堿、生物堿、黃酮平均含量差異。本研究可為香茅草優(yōu)質(zhì)資源的篩選評價、育種利用提供指導(dǎo)，為香茅草的功能性作用機制研究、功能性產(chǎn)品開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

45份樣本分別收集于海南、福建、貴州及云南，保存在云南農(nóng)業(yè)大學香料資源圃（昆明）。其中，20個材料重復(fù)保存于云南省農(nóng)業(yè)科學院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所（元謀）。樣品來源和信息見表1。樣本鮮葉經(jīng)預(yù)處理，60 ℃烘干，粉碎，過60 目篩后，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 香茅草水提物的制備將香茅草葉粉碎成粉末，取9 L 超純水加熱煮沸，加入1 kg 香茅草粉末進行煎煮沸騰3 min，料液比1∶9，6 層尼龍布（200 目）過濾，殘渣再次加水9 L 煮沸，再次過濾；共煮3 次，留液體，棄殘渣。將得到的水煎液離心后棄沉淀，合并上清液，得到香茅草水提物，于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 廣靶代謝組學檢測樣本預(yù)處理后上機檢測，使用EXION LC System（SCIEX）超高效液相色譜儀，通過Waters UPLC 液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離數(shù)據(jù)采集及目標化合物定量分析，通過SCIEX Analyst Work Station Software（Version 1.6.3）進行數(shù)據(jù)分析。使用自撰寫的R程序包結(jié)合自建數(shù)據(jù)庫完成提峰、注釋等工作，再根據(jù)數(shù)據(jù)庫對化合物進行分類，計算各類別的化合物豐度總和占所有化合物的比例。

1.2.3 小鼠小腸運動試驗將 72 只昆明小鼠分為：空白組（滅菌生理鹽水，CON），模型組（洛哌丁胺8 mg/kg，LOP）、陽性組（酚酞200 mg/kg，POS）、甜菜堿低劑量組（300 mg/kg，LB）、甜菜堿中劑量組（500 mg/kg，MB）、甜菜堿高劑量（750 mg/kg，HB），連續(xù)7 d 灌胃后進行小腸運動試驗，期間小鼠自由攝食飲水，25 ℃，12 hL∶12 h D。記錄每只小鼠小腸長度及墨汁推進距離。墨汁推進率=墨汁推進距離/小腸長度×100%。

1.2.4 小鼠排便試驗禁食不禁水12 h 后（第7天上午）分別給不同組別小鼠正常灌胃。自由飲水，30 min 后，將配制好的10%活性炭懸液按0.1 mL/10g 體質(zhì)量的劑量灌胃并開始計時，記錄每只小鼠排出的首粒黑便時間，記錄6 h 內(nèi)小鼠排出的糞便數(shù)量和重量。觀察結(jié)束后，立即收集糞便樣品并在60 ℃干燥至恒重，計算糞便含水率。糞便含水率=（糞便濕重-糞便干重）/糞便濕重×100%。

1.2.5 黃酮含量檢測分別吸取0、50、200、400、600、800 μL 濃度為0.66 mg/mL 蘆丁對照溶液，定容至1 mL 備用。分別取對照溶液和水提物待測液100 μL，滴加100 μL 5%亞硝酸鈉溶液，放置6 min，加入100 μL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加入1.5 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，放置15 min。于510 nm 波長處測定吸光值，繪制標準曲線， 黃酮線性回歸方程為y=0.5467x+0.0061（R² =0.9992）。

1.2.6 生物堿含量檢測分別吸取 0.15、0.2、0.25、0.35、0.40、0.45 mL 濃度為1.0 mg/mL 鹽酸小檗堿溶液為對照溶液，定容至1 mL。分別取對照溶液和水提物待測液200 μL，加入2 mL 磷酸緩沖液（pH 4），加入2 mL 氯仿，加入1.5 mL溴麝香草酚藍溶液，充分振搖后靜置0.5 h 取氯仿層。于420 nm 波長處測定吸光值，繪制標準曲線，生物堿線性回歸方程為y=3.4706x+0.6339（R²=0.998）。

1.2.7 甜菜堿含量檢測分別吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL 濃度為1.5 mg/mL 的甜菜堿溶液為對照溶液，定容至3 mL 備用。分別取對照溶液和水提物待測液3 mL，在冰箱（4 ℃）中存放15 min 后滴加雷氏鹽溶液（pH 1）5 mL 再置入冰箱中1 h，取出后用10 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入99%乙醚溶液5 mL離心。使乙醚在通風櫥中自然揮發(fā)至干，加入5mL 70%丙酮溶液。于525 nm 處檢測吸光值并繪制甜菜堿的標準曲線。甜菜堿標準曲線為y=0.6314x– 0.0855（R²=0.991）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 GraphPad prism 9.0 軟件進行柱狀圖制作。采用SPSS26 軟件進行主成分分析、差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香茅草水提物的成分分析

2.1.1 組分分析

采用廣泛靶向代謝組學方法對香茅草水提物進行成分檢測，共檢測到1114 種成分，根據(jù)數(shù)據(jù)庫對化合物進行統(tǒng)計分類，得出各類化合物的豐度總和占比，按照相對豐度進行排序，相對豐度超過1%的化合物有8 個，如圖1A所示，8 個化合物的豐度總和為95.62%，其他4.38%的化合物成分含量較低。其中，最高為黃酮類，占24.30%，核苷酸類占19.66%，氨基酸類占15.81%，有機氧化合物及羧酸類占14.85%，生物堿類占13.53%，脂類及芳香類化合物占3.89%，酚類占2.40%，維生素及有機酸類占1.18%。其中，黃酮類和生物堿占比達37.83%。

2.1.2 單體成分分析

對香茅草水提物的單體成分相對豐度進行排序，相對豐度超過1%的單體成分有10 個，如圖1B 所示，其中，甜菜堿占10.52%，吡咯烷酮羧酸占7.67%，阿糖腺苷占5.77%，脯氨酸占5.03%，異紅蓼苷占4.58%，矢車菊素-3-蕓香糖苷占3.65%，牡荊素占2.65%，苯佐卡因占1.61%，鳥嘌呤占1.44%，苯丙氨酸占1.40%。

2.2 甜菜堿通便功效研究

2.2.1 甜菜堿對小鼠排便參數(shù)的影響甜菜堿對便秘小鼠排便參數(shù)的影響結(jié)果見圖2。與CON 相比，模型組6 h 內(nèi)糞便總質(zhì)量減少0.31 g（P<0.001），首粒排黑便時間增加98 min（P<0.001），糞便含水率降為48%（P<0.01），6 h 內(nèi)糞便粒數(shù)減少10 粒（P<0.001），表明功能性便秘小鼠模型建立成功。

與 LOP 相比，POS 小鼠的6 h 內(nèi)糞便總質(zhì)量、糞便粒數(shù)、糞便含水率以及首粒排黑便時間均有顯著性差異；甜菜堿中劑量組小鼠的6 h 內(nèi)糞便總質(zhì)量增加0.1 g（P<0.01），糞便含水率增至54%（P<0.01），6 h 內(nèi)糞便粒數(shù)增加4 粒（P<0.05），低、中劑量組首粒排黑便時間分別縮短55 min（P<0.01）、70 min（P<0.01）。結(jié)果表明，中劑量甜菜堿對小鼠功能性便秘有較好的改善作用。

2.2.2 甜菜堿對小鼠腸道蠕動的影響小鼠的小腸墨汁推進率是判斷通便功效的重要指標。甜菜堿對便秘小鼠小腸蠕動的影響結(jié)果見圖3，各組小鼠小腸長度差異性不顯著，與空白組相比，模型組小鼠的小腸墨汁推進率降至54%（P<0.01），與模型對照組相比，陽性組能顯著提升小鼠小腸墨汁推進率（P<0.05）；中劑量甜菜堿能顯著提升小鼠小腸墨汁推進率，提升至71%（P<0.05），高劑量vnMh2UUNX5Fsa5uDKsh0Jo1M6I5bqy0LIv+VPCJNaR0=甜菜堿能提升小鼠小腸墨汁推進率。結(jié)果表明甜菜堿可有效促進便秘小鼠小腸蠕動。

甜菜堿是香茅草水提物中豐度最高的單體成分（10.52%），上述結(jié)果證明甜菜堿具有潤腸通便功效，可根據(jù)香茅草甜菜堿含量對來自不同地區(qū)的香茅草資源進行功能性評價。

2.3 香茅草資源的主要成分差異分析

2.3.1 香茅草資源甜菜堿、生物堿、黃酮成分比較分析利用雷氏鹽濾液法、酸性染料比色法、比色法分別測定保存在昆明的34 份云南樣品和保存在元謀的20 份樣品的香茅草水提物的甜菜堿、生物堿、黃酮含量。昆明的香茅草資源水提物的甜菜堿、生物堿、黃酮成分含量見表2。昆明的34 個樣品中，甜菜堿含量范圍為2.98～5.65 mg/g，含量大于4.00 mg/g 的樣本有12 個，其余22 個樣本含量在2.00～4.00 mg/g 之間，含量最高的樣本為HK-2，為5.65 mg/g，含量最低的樣本為YJ-3，為2.98 mg/g；生物堿含量范圍為3.19～8.66 mg/g，含量大于6.00 mg/g 的樣本有10個，其余24 個樣本含量在3.00～6.00 mg/g 之間，含量最高的樣本為HK-1-1，為8.66 mg/g，含量最低的樣本為XY-1，為3.19 mg/g；黃酮含量差異較大，范圍為2.15～32.15 mg/g，含量大于30.00 mg/g的樣本僅有1 個， 其余33 個樣本含量在2.00～30.00 mg/g 之間，含量最高的樣本為YJ-4，為32.15 mg/g，含量最低的樣本為ML-4，為2.15 mg/g。

元謀的香茅草資源水提物的甜菜堿、生物堿、黃酮成分含量見表3。在元謀的20 個樣品中，甜菜堿含量差異較小，范圍為2.96～5.38 mg/g，含量大于4.00 mg/g 的樣本有11 個，其余9 個樣本含量在2.00～4.00 mg/g 之間，含量最高的樣本為YJ-2-1，為5.38 mg/g，含量最低的樣本為MH-4，為2.96 mg/g；生物堿含量差異較小，范圍為4.54～7.79 mg/g，含量大于6.00 mg/g 的樣本有10個，其余10 個樣本含量在4.00～6.00 mg/g 之間，含量最高的樣本為JG-1，為7.79 mg/g，含量最低的樣本為YM-1，為4.54 mg/g；黃酮含量差異較大，范圍為13.54～44.15 mg/g，含量大于30.00 mg/g 的樣本有10 個，其余10 個樣本含量在10.00～30.00 mg/g 之間，含量最高的樣本為YX-1，為44.15 mg/g，含量最低的樣本為ZY-1，為13.54 mg/g。

2.3.2 香茅草資源甜菜堿、生物堿、黃酮成分平均值比較分析 將保存于昆明的34 個材料和元謀的20 個材料甜菜堿（圖4A）、生物堿（圖4B）、黃酮（圖4C）平均含量進行對比。元謀的甜菜堿平均含量為4.14 mg/g ， 顯著大于昆明（3.87 mg/g ）； 元謀的生物堿平均含量為6.06 mg/g，顯著大于昆明（3.87 mg/g）；元謀的黃酮平均含量為30.64 mg/g ， 顯著大于昆明（16.23 mg/g）。

綜上所述，元謀的香茅草資源甜菜堿、生物堿、黃酮平均含量均顯著大于昆明。

2.4 不同生境香茅草資源的主要成分比較分析

2.4.1 不同地區(qū)香茅草資源的主要成分比較 45個材料按照來源13 個地區(qū)。對不同地區(qū)的甜菜堿、生物堿、黃酮成分平均含量進行對比。從圖5A 可以得出，不同地區(qū)香茅草資源甜菜堿成分平均含量差異較小，范圍為3.53～5.01 mg/g，漳州地區(qū)的香茅草資源甜菜堿平均含量最高， 為5.01 mg/g；萬寧、?？诘貐^(qū)次之，西雙版納地區(qū)甜菜堿平均含量最低，為3.53 mg/g；由圖5B 可知，不同地區(qū)香茅草資源生物堿成分平均含量差異較小，范圍為4.54～8.66 mg/g，紅河地區(qū)的香茅草資源生物堿平均含量最高，為8.66 mg/g；海口地區(qū)次之，楚雄地區(qū)甜菜堿平均含量最低，為4.54 mg/g；由圖5C 可知，不同地區(qū)香茅草資源黃酮成分平均含量差異較大，范圍為10.09～32.03 mg/g，臨滄地區(qū)的香茅草資源黃酮平均含量最高，為32.03 mg/g，萬寧、德宏、玉溪、漳州次之，其他地區(qū)的樣本平均含量均較低，?？诘貐^(qū)黃酮平均含量最低，為10.09 mg/g。綜上所述，不同地區(qū)香茅草資源甜菜堿、生物堿、黃酮平均含量有顯著性差異，可根據(jù)甜菜堿、生物堿、黃酮含量的高低優(yōu)先采集相關(guān)地區(qū)的香茅草資源。

2.4.2 不同海拔對香茅草資源主要成分的影響本研究樣品來自不同海拔地區(qū)，最低海拔為30 m，最高為1780 m，根據(jù)海拔的高低將香茅草資源劃分為低海拔（低于1000 m）、高海拔（高于1000 m）2 個地區(qū)。不同海拔甜菜堿、生物堿、黃酮平均含量見圖6。低海拔香茅草資源甜菜堿平均含量為4.16 mg/g，含量顯著高于高海拔（3.78 mg/g）；低海拔香茅草資源生物堿平均含量為6.27 mg/g，含量顯著高于高海拔（5.49 mg/g）；高海拔香茅草資源黃酮平均含量為26.41 mg/g，含量顯著高于低海拔（19.92 mg/g）。

2.5 功能性香茅草資源的鑒定評價

如表 4、表5 所示，對45 份香茅草質(zhì)資源的甜菜堿、生物堿、黃酮3 個指標進行主成分分析。第一主成分的主要決定因子為黃酮含量，第二主成分的主要決定因子為甜菜堿含量，第三主成分的主要決定因子為生物堿含量。以F1、F2、F3表示不同香茅草資源分別在第一、第二、第三個主成分中的得分，根據(jù)各指標測定值，得出每份資源的綜合得分。結(jié)果表明，YX-1、WN-2 綜合得分最高，為0.81，表明其綜合品質(zhì)較好，而HK-4綜合得分最低，為0.12，表明其綜合品質(zhì)較差。

根據(jù)綜合得分，可建立香茅草資源的評價指標，分為3 類（表5），各類指標為：綜合得分≥0.70 的為一級香茅草資源，為YX-1、WN-2、GM-1 等6 個；0.50≦綜合得分<0.70 的為二級香茅草資源，為YJ-1-1、YJ-1、YJ-2-1 等16 個；綜合得分<0.50 的為三級香茅草資源，為MH-4、YJ-2、HK-1 等23 個。

本研究結(jié)果篩選出6 個優(yōu)良種質(zhì)資源，可為香茅草的育種利用和功能性資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù)，也為優(yōu)質(zhì)香茅草資源的考察收集奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

不同海拔環(huán)境往往具有不同的光照強度、紫外輻射、大氣溫度、土壤溫度、降水量、大氣壓等環(huán)境因素，因此不同海拔會影響植物的成分含量[16]。受海拔高度的影響，冷蒿的黃酮含量與海拔呈顯著正相關(guān)[17]，高海拔地區(qū)黃連總生物堿含量較低[18]，隨海拔升高，鉤藤莖中生物堿含量顯著下降[19]，這與本研究結(jié)果一致。本研究根據(jù)海拔的高低將香茅草資源劃分為低海拔、高海拔2個地區(qū)，結(jié)果表明高海拔可能有助于香茅草資源黃酮含量的積累，低海拔可能有助于香茅草資源甜菜堿、生物堿含量的積累，該結(jié)果對今后香茅草優(yōu)良種質(zhì)資源的收集及育種利用奠定基礎(chǔ)，但不同海拔的香茅草黃酮、甜菜堿、生物堿的含量還需進一步研究。

不同地點種植的香茅草甜菜堿、生物堿、黃酮平均含量有顯著性差異，元謀的香茅草資源甜菜堿、生物堿、黃酮平均含量顯著大于昆明的香茅草資源。不同的氣候環(huán)境會影響植物的含量和組分，這可能是因為其影響了次生代謝物的合成與積累。曲志華等[20]研究我國5 個地點種植的13個甜菜品種中黃酮含量的差異，結(jié)果表明不同地點種植的甜蕎黃酮含量具有顯著性差異，這與本研究結(jié)果一致。昆明與元謀兩地的溫度、海拔、土壤等大有不同，元謀是典型干熱河谷地區(qū)，海拔為1120 m，年均氣溫為為21.9 ℃，極端最高氣溫為42 ℃。多年平均降雨量為613.8 mm，降雨集中在5—9 月，其他月份少雨；年均相對濕度為53%，干燥度4.4，試驗地的土壤大多是燥紅土，呈微酸性， 土壤較為貧瘠[21-23]。而昆明平均海拔為1891 m，年均氣溫為15 ℃，極端最高氣溫為33 ℃，全年降水量約103l mm；試驗地土壤為紅土和基質(zhì)土，還有一部分珍珠巖。后續(xù)將研究不同氣候環(huán)境下香茅草成分的變化規(guī)律以及在不同環(huán)境下的適應(yīng)性，對現(xiàn)有香茅草合理布局、適宜種植區(qū)域劃分以及提高今后我國香茅草的育種水平、調(diào)整育種策略都具有參考借鑒意義。

種質(zhì)資源是農(nóng)作物品種改良的基礎(chǔ)，功能性資源研究評價是育種利用和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的核心[24]，不但可以指導(dǎo)資源的考察和收集，而且可為香茅草育種研究和新產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。本研究探明了香茅草水提物的組分及其構(gòu)成，且黃酮類、生物堿類為其中主要成分，甜菜堿是最高的單體成分；在香茅草水提物具有通便功效的基礎(chǔ)上，首次通過便秘動物實驗證明甜菜堿具有通便功效；同時，研究證明了元謀的香茅草資源甜菜堿、生物堿、黃酮平均含量均顯著大于昆明；不同區(qū)域香茅草資源的甜菜堿、生物堿、黃酮平均含量有顯著性差異；高海拔可能有助于香茅草資源黃酮含量的積累，低海拔可能有助于香茅草資源甜菜堿、生物堿含量的積累；不同香茅草資源的甜菜堿、生物堿、黃酮含量具有明顯差異，利用這3個指標進行主成分分析，篩選優(yōu)良香茅草種質(zhì)資源，將45 份香茅草資源分為3個等級，并篩選得到一級香茅草資源YX-1、WN-2、GM-1、ZZ-1、RL-1、YJ-4。本研究結(jié)果不但為香茅草資源鑒定評價、育種利用和功能性資源的開發(fā)利用提供科學依據(jù)，也為香茅草的考察收集奠定基礎(chǔ)。