摘要：為進(jìn)一步研究臭椿（Ailanthus altissima）canthin-6-one生物堿對禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）的抑菌效果及其作用機(jī)制，采用微量稀釋法、菌絲生長抑制法測定其抑菌活性，并通過測定胞外相對電導(dǎo)率、內(nèi)容物釋放量、丙二醛含量、過氧化氫含量以及保護(hù)酶活性，從細(xì)胞膜角度分析其抑菌作用機(jī)制。結(jié)果顯示，canthin-6-one對禾谷鐮刀菌具有顯著的抑菌作用，其最小抑菌濃度（MIC）為8.0 μg/mL，半數(shù)有效濃度（EC50）為1.85 μg/mL。處理后的菌體胞外相對電導(dǎo)率和內(nèi)容物釋放量顯著增加，同時菌體丙二醛和過氧化氫含量亦有顯著升高。這表明canthin-6-one引起了禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜氧化損傷，導(dǎo)致膜完整性喪失及透性增強(qiáng)，從而抑制菌絲生長。

關(guān)鍵詞：臭椿（Ailanthus altissima）； 禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）； 生物堿； 抑菌作用； 細(xì)胞膜

中圖分類號：S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）09-0084-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.09.015 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Antifungal effec4804a2e9f911061f7c10de1021136242t of canthin-6-one from Ailanthus altissima on Fusarium graminearum

ZHAO Mei-rong， LI Yong-chun， LI Chun-ying

（College of Chemistry and Life Science， Chifeng University， Chifeng 024000， Inner Mongolia， China）

Abstract： To further study the fungicidal effect and mechanism of canthin-6-one alkaloid from Ailanthus altissima on Fusarium graminearum， the inhibitory activity was determined by microdilution and mycelial growth inhibition methods. The antifungal mechanism of canthin-6-one was analyzed from the point of view of cell membrane by detecting the extracellular relative conductivity， content release， malondialdehyde content， hydrogen peroxide content and protective enzyme activity. The results showed that canthin-6-one had a significant inhibitory effect on Fusarium graminearum， with a minimum inhibitory concentration of 8.0 μg/mL and a half-effective concentration of 1.85 μg/mL. The extracellular relative conductivity and the content release amount of the treated mycelia were significantly increased， while malondialdehyde and hydrogen peroxide contents were also significantly elevated. It was indicated that canthin-6-one induced oxidative damage to the cell membrane of Fusarium graminearum， resulting in the loss of membrane integrity and increased permeability， thus inhibiting mycelial growth.

Key words： Ailanthus altissima； Fusarium graminearum； alkaloid； antifungal effect； cell membrane

禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是主要侵染玉米、小麥、大麥等禾本科作物的病原真菌，能對作物產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，危害糧食安全［1，2］。禾谷鐮刀菌引起病害的主要防治手段是施用化學(xué)農(nóng)藥，然而由于化學(xué)農(nóng)藥的殘留、降解周期以及真菌耐藥性等問題，給生態(tài)環(huán)境和生態(tài)安全帶來不利影響。因此，天然植物源抑菌劑成為解決此類問題的有效途徑［3］。臭椿（Ailanthus altissima）作為一種重要的資源植物，其提取物能夠抑制多種植物病原真菌，具有開發(fā)植物源抑菌劑的潛力［4，5］。canthin-6-one是從臭椿中提取的生物堿化合物，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用，其抑菌性能倍受關(guān)注［6，7］。當(dāng)前，國內(nèi)外對臭椿canthin-6-one的研究主要集中于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對其抑制植物病原真菌作用及機(jī)制的研究報道較為鮮見［8-10］。李永春等［11］的研究表明從臭椿莖皮中分離出的canthin-6-one能夠?qū)坦如牭毒ⅫS瓜枯萎病菌、冬瓜枯萎病菌等表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，尤其對禾谷鐮刀菌的抑制效果在幾種供試真菌中最強(qiáng)。為深入研究canthin-6-one的抑菌作用及其開發(fā)價值，本研究以禾谷鐮刀菌為供試菌，分析并評價臭椿canthin-6-one抑菌活性，并從細(xì)胞膜透性、保護(hù)酶活性變化等角度分析其抑制病原菌生長的生理生化機(jī)制，為canthin-6-one在植物真菌病害防治中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 禾谷鐮刀菌由赤峰學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 canthin-6-one（實(shí)驗(yàn)室自制，含量大于98%），PDA培養(yǎng)基、PDB培養(yǎng)基（均購于青島海博生物技術(shù)有限公司），其余試劑均為分析純。

canthin-6-one抑菌劑的配制：將25 mg的canthin-6-one以1%的DMSO溶液結(jié)合超聲波溶解定容于25 mL的容量瓶中，4 ℃冷藏，備用。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 參考畢亞琪等［12］的方法。在培養(yǎng)6 d（25 ℃，PDA培養(yǎng)基）的禾谷鐮刀菌菌落邊緣打取菌餅（直徑為6 mm），接種于羧甲基纖維素（CMC）培養(yǎng)基中，于25 ℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)10 d，得孢子懸浮液，孢子濃度為106個/ mL。

1.2.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用微量稀釋法［13］測定MIC。配制含有不同濃度canthin-6-one抑菌劑（0.125～64.000 μg/mL，共10個梯度）的帶藥PDB培養(yǎng)基，各吸取100 μL加入至96孔板中，以不含抑菌劑的PDB培養(yǎng)基為對照。吸取孢子懸浮液10 μL接種于各PDB培養(yǎng)基中，置于25 ℃條件下培養(yǎng)。觀察，待對照PDB中有菌絲生長時，將完全無菌絲生長的最低抑菌劑濃度確定為最小抑菌濃度。

1.2.3 canthin-6-one抑菌效果測定 采用生長速率法［11］測定canthin-6-one的抑菌效果。配制含有系列濃度（0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL）canthin-6-one的帶藥PDA培養(yǎng)基，倒入90 mm培養(yǎng)皿，以無藥劑PDA為對照。按“1.2.1”的方法挑取菌餅接種于上述PDA培養(yǎng)基，每個濃度梯度重復(fù)3次，于25 ℃培養(yǎng)72 h，測定菌落直徑（十字交叉法）。菌絲生長抑制率計(jì)算方法參照李永春等［11］的方法。將抑制率換算成幾率值（Y）、藥劑濃度（μg/mL）換算成對數(shù)值（X），求出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)，計(jì)算canthin-6-one對病菌的半數(shù)有效濃度（EC50）。

1.2.4 供試菌細(xì)胞外電導(dǎo)率測定 參考李永春［14］的方法測定電導(dǎo)率。將在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h（25 ℃、150 r/min）的菌絲過濾、沖洗、瀝干，稱取0.3 g菌絲置于錐形瓶中，然后加入canthin-6-one溶液30 mL進(jìn)行處理，2個處理canthin-6-one的濃度分別為1/2 MIC、MIC，以不含canthin-6-one的無菌水處理為對照（CK），25 ℃振蕩培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次。取0、2、4、8、12、24 h的上清液，測定其電導(dǎo)率（S1），以未加菌絲的溶液為空白對照（S0），最終樣品經(jīng)沸水浴10 min后測定終電導(dǎo)率（S2），用相對電導(dǎo)率表示細(xì)胞膜透性的變化。

[相對電導(dǎo)率=S1-S0S2-S0×100%] （1）

1.2.5 供試菌細(xì)胞內(nèi)容物外滲測定 參考Zhou等［15］的細(xì)胞內(nèi)容物測定方法并稍作修改。菌絲培養(yǎng)及處理按照“1.2.4”的方法，分別在0、2、4、8、12、24 h取100 μL培養(yǎng)液，于12 000 r/min離心5 min，取上清液，以未加菌絲的溶液作空白對照，在260 nm處測定吸光度，計(jì)算內(nèi)容物釋放量。

1.2.6 供試菌丙二醛、過氧化氫含量及相關(guān)酶活性測定 菌絲培養(yǎng)及處理按照“1.2.4”的方法，分別在菌絲處理0、3、6、12、24 h取供試菌絲0.5 g，液氮研磨至粉末狀。分別按照相應(yīng)的測試試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書測定過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 利用Excel 2019軟件和DPS 15.10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Duncan’s新復(fù)極差法和one-way ANOVA進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 canthin-6-one對禾谷鐮刀菌的最小抑菌濃度

采用微量稀釋法對禾谷鐮刀菌進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至48 h時，對照PDB培養(yǎng)基中已有明顯菌絲生長，在含有0.125～64.000 μg/mL系列濃度canthin-6-one的PDB培養(yǎng)基中，無菌絲生長的最低濃度為8.0 μg/mL，因此，canthin-6-one對禾谷鐮刀菌的MIC為8.0 μg/mL。

2.2 canthin-6-one對禾谷鐮刀菌菌絲生長的影響

菌絲生長抑制法測定結(jié)果（圖1）顯示，canthin-6-one對禾谷鐮刀菌菌絲生長抑制作用與其濃度呈正相關(guān)，隨著濃度的增加，canthin-6-one的抑菌效果越明顯。當(dāng)canthin-6-one濃度為6.0 μg/mL時，對菌絲生長的抑制率達(dá)97.16%（表1），得毒力回歸方程：Y=1.550 9X+4.042 7，R2=0.992 2，計(jì)算得EC50為1.85 μg/mL。

2.3 canthin-6-one對禾谷鐮刀菌胞外電導(dǎo)率的影響

細(xì)胞外相對電導(dǎo)率測定結(jié)果如圖2所示，與對照相比，經(jīng)canthin-6-one處理后，禾谷鐮刀菌菌絲膜外電導(dǎo)率增加，12 h內(nèi)，處理時間越長，電導(dǎo)率增加幅度越大，在12 h時，1/2 MIC和MIC的相對電導(dǎo)率分別達(dá)31.61%±1.52%和40.01%±0.73%，與對照（28.45%±1.52%）差異極顯著（P<0.01）。24 h時，MIC和1/2 MIC與對照相比，相對電導(dǎo)率分別提高了29.55、17.95個百分點(diǎn)。這一結(jié)果說明，canthin-6-one處理使禾谷鐮刀菌組織內(nèi)電解質(zhì)外滲量增加，可能是菌絲細(xì)胞膜的完整性被破壞，增加了細(xì)胞膜的透性。

2.4 canthin-6-one對禾谷鐮刀菌細(xì)胞內(nèi)容物外滲的影響

通過測量260 nm處的吸光值來檢測細(xì)胞內(nèi)容物的釋放量，結(jié)果如圖3所示，在0～6 h，內(nèi)容物釋放量隨著處理時間的延長而增加，4 h之前，處理與對照差異不顯著，4 h后，處理菌絲內(nèi)容物的外滲顯著增加，在6 h時，1/2 MIC和MIC的內(nèi)容物釋放量分別為（0.27±0.01） ng/μL和（0.34±0.04） ng/μL，分別比對照［（0.18±0.03） ng/μL］提高了54.86%和94.48%，且差異顯著（P<0.05）。這一結(jié)果說明canthin-6-one能破壞菌體細(xì)胞膜的完整性，細(xì)胞膜透性增加。

2.5 canthin-6-one對丙二醛和過氧化氫含量的影響

細(xì)胞膜氧化損傷程度可通過MDA含量高低來反映，H2O2濃度變化則又可以影響細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化過程［16，17］。由圖4可知，0～3 h，canthin-6-one處理使MDA含量沒有明顯變化，6 h時，1/2 MIC、MIC濃度的canthin-6-one處理使菌絲MDA含量分別比對照增加了37.80%和67.07%，且差異顯著（P<0.05）。菌絲H2O2含量變化與MDA含量變化表現(xiàn)出相類似的趨勢（圖5），短時間處理，H2O2含量變化不明顯，在6 h時，處理H2O2含量與對照相比，明顯增加，差異顯著，在12 h和24 h時，兩個處理之間差別不大，但都顯著高于對照。以上結(jié)果表明，canthin-6-one處理可能使禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜受到了氧化損傷，發(fā)生脂質(zhì)過氧化。

2.6 canthin-6-one對保護(hù)性酶活性的影響

真菌受到氧化損傷時，一些保護(hù)性酶如過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等通常產(chǎn)生應(yīng)激變化［18］。本試驗(yàn)對菌絲POD、SOD活性進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖6、圖7。由圖6可見，POD活性隨著canthin-6-one的處理先升高后降低，12 h內(nèi)，處理后菌體POD活性升高，經(jīng)1/2 MIC和MIC濃度的canthin-6-one處理3 h時，POD活性較對照分別增加了19.00%和38.49%，24 h時，處理POD活性降低，低于對照。SOD活性的變化如圖7所示，經(jīng)1/2 MIC和MIC濃度的canthin-6-one處理6 h時，菌絲SOD活性高于對照，且差異顯著，24 h時，處理SOD活性降低。

3 討論與小結(jié)

臭椿生物堿的抑菌活性使其具有開發(fā)成植物源抑菌劑的潛力。本研究抑菌活性表明，從臭椿中分離的生物堿canthin-6-one對禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑制作用，且抑制效果與抑菌劑濃度呈正相關(guān)，當(dāng)濃度為6.0 μg/mL時，canthin-6-one對菌絲生長的抑制率達(dá)97.16%，EC50為1.85 μg/mL。

細(xì)胞膜作為真菌的基本結(jié)構(gòu)，具有維持真菌正常形態(tài)、調(diào)節(jié)體內(nèi)環(huán)境平衡等作用，常作為抗真菌藥物的作用靶點(diǎn)［19］。許多研究表明生物堿可通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)抑制菌絲生長。Luo等［20］研究發(fā)現(xiàn)木蘭花堿破壞紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum）細(xì)胞膜，引起核酸泄露。Zhao等［21］研究發(fā)現(xiàn)血根堿破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而抑制稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的生長。細(xì)胞膜是否受到損傷的主要標(biāo)志之一是MDA含量的變化，其含量大小可反映膜損傷的程度［17］。生物體內(nèi)的一些氧化代謝的產(chǎn)物，如過氧化氫、超氧自由基等活性氧通常會引起膜脂、蛋白質(zhì)、DNA及其他細(xì)胞成分的氧化損傷，活性氧濃度變化可反映出對膜脂質(zhì)氧化的影響［22］。本研究測定了canthin-6-one處理后供試菌的胞外相對電導(dǎo)率、內(nèi)容物外滲以及菌體MDA和H2O2含量變化，結(jié)果表明，canthin-6-one使菌體細(xì)胞膜的透性增加，造成內(nèi)容物泄漏。MDA含量在canthin-6-one處理后顯著增加，且與藥液濃度呈正相關(guān)，說明canthin-6-one可能引起禾谷鐮刀菌的細(xì)胞膜氧化損傷，從而造成膜透性增加。H2O2含量與MDA含量變化趨勢一致，表明canthin-6-one增加了活性氧含量，進(jìn)而引起細(xì)胞膜氧化損傷。

真菌受到損傷后，通常會激活相關(guān)保護(hù)性酶來防御。魏立強(qiáng)等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，旱芹粗提物能夠引起棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）MDA含量增加，破壞膜系統(tǒng)完整性，SOD、POD等保護(hù)性酶被激活，其活性先升后降。王欣等［24］發(fā)現(xiàn)川芎石油醚萃取物能干擾和破壞藍(lán)莓葉斑病菌（Pestalotiopsis clavispora）菌絲體內(nèi)的防御酶系統(tǒng)。本研究結(jié)果與之相似，供試真菌經(jīng)canthin-6-one處理后，細(xì)胞膜受到氧化損傷，菌體的SOD、POD等保護(hù)酶被激活，其活性在初期增加，處理后期真菌受損傷程度加劇，酶的活性下降。

綜上所述，臭椿canthin-6-one生物堿對禾谷鐮刀菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用，其作用機(jī)制初步研究表明，canthin-6-one通過誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)生活性氧，擾亂菌體內(nèi)防御酶系統(tǒng)原有的動態(tài)平衡，進(jìn)而損傷細(xì)胞膜，破壞其完整性，菌絲生長因而受到抑制。本研究主要從細(xì)胞膜角度對canthin-6-one抑制禾谷鐮刀菌作用進(jìn)行了初步分析，然而，抑菌機(jī)制往往是一系列生化反應(yīng)綜合作用的結(jié)果，因此，還需要從多個角度進(jìn)一步探索canthin-6-one的抑菌機(jī)制。

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收稿日期：2023-04-20

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZY21137；NJZZ22150）；赤峰學(xué)院一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（CFXYYLXKB202102）；蒙東地區(qū)生物資源開發(fā)利用創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（FXYKYCXTD202008）

作者簡介：趙美榮（1981-），女，山東嘉祥人，副教授，博士，主要從事植物次生代謝物質(zhì)開發(fā)利用研究，（電話）15047639680（電子信箱）

738532543@qq.com。

趙美榮，李永春，李春穎. 臭椿canthin-6-one對禾谷鐮刀菌的抑菌作用［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（9）：84-88．