民族藥水河劍水提和醇提取物急性毒性試驗及抗炎鎮(zhèn)痛有效部位篩選

摘要：對水河劍（Diplazium lanceum）藥材水提物及醇提物的急性毒性進行初步研究，并篩選水河劍藥材具有抗炎鎮(zhèn)痛效果的極性部位。使用最大給藥量測定方法對小鼠灌胃給藥，得到水河劍水提物及醇提物的最大耐受量（MTD），考察水河劍用藥的安全性；采用小鼠醋酸扭體及熱板法考察水河劍不同極性部位的鎮(zhèn)痛效果；采用小鼠耳腫脹法考察水河劍藥材不同極性部位的抗炎效果；用ELISA法，測乙酸乙酯提取物（高、中、低）對小鼠耳部二甲苯致炎血清中炎癥因子含量的影響。結(jié)果表明，水河劍水提物及醇提物急性毒性試驗中均未能得到半數(shù)致死量（LD50），水河劍藥材水提物和醇提取物最大耐受量分別為238.0、165.2 g/kg；水河劍藥材不同極性部位提取物對小鼠的舔足時間都有所延長；水河劍藥材不同極性部位均對小鼠扭體有抑制效果，各組鎮(zhèn)痛率為11.14%～40.36%，其中鎮(zhèn)痛效果最好的為乙酸乙酯部位，其次為石油醚部位；水河劍藥材不同部位均對小鼠耳腫脹有抑制效果，各組耳腫脹抑制率為24.71%～48.47%，乙酸乙酯及石油醚部位抗炎效果最好；乙酸乙酯高、中、低劑量組小鼠血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、前列腺素E2（PGE2）炎癥因子含量與模型對照組相比均有所下降，乙酸乙酯低、中劑量組的IL-1β、PGE2含量及乙酸乙酯低劑量組的TNF-α含量與模型對照組相比具有顯著差異。

關(guān)鍵詞：水河劍（Diplazium lanceum）； 最大耐受量； 急性毒性試驗； 抗炎鎮(zhèn)痛； 有效部位

中圖分類號：R284.1；R284.2 文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）09-0119-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.09.020 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Acute toxicity test of water extract and alcohol extract of ethnic medicine Diplazium lanceum and screening of anti-inflammatory and analgesic effective parts

ZHOU Chu-hui， DENG Qing-mei， CHEN Yong， YANG Wen-ling， WEI Pei， QIN Xue-mei

（Guangxi Scientific Research Center of Traditional Chinese Medicine， Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China）

Abstract： The acute toxicity of water and alcohol extracts of Diplazium lanceum was preliminarily studied and the polar sites with anti-inflammatory and analgesic effects were screened. The maximum tolerable dose （MTD） of the water and alcohol extracts of Diplazium lanceum was obtained by gavage administration to mice using the maximum dosage measurement method， and the safety of Diplazium lanceum was investigated； the analgesic effect of different polar parts of Diplazium lanceum was investigated using mouse acetic acid twisting and hot plate method； the anti-inflammatory effects of different polar parts were investigated using the mouse ear swelling method； the effect of ethyl acetate extract （high， medium， low） on the levels of inflammatory factors in the serum of mice with xylene- induced ear inflammation was measured using ELISA method. The results showed that LD50 was not obtained in the acute toxicity experiment of water extract and alcohol extract of Diplazium lanceum. The MTD of water extract and alcohol extract were 238.0 g/kg and 165.2 g/kg， respectively； the extracts of different polar parts of Diplazium lanceum prolonged the mice’s licking time of feet； the different polar parts of Diplazium lanceum had inhibitory effects on mouse torsion， with analgesic rates ranging from 11.14% to 40.36% in each group. Among them， the ethyl acetate part had the best analgesic effect， followed by the petroleum ether part； different parts of Diplazium lanceum had inhibitory effects on mouse ear swelling， with inhibition rates ranging from 24.71% to 48.47% in each group， and ethyl acetate and petroleum ether parts had the best anti-inflammatory effects； the levels of tumor necrosis factor （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and prostaglandin E2（PGE2） inflammatory factors in the serum of mice in the high， medium， and low dose groups of ethyl acetate decreased compared to the model control group. The levels of IL-1β and PGE2 in the low and medium dose groups of ethyl acetate， as well as the level of TNF-α in the low dose group of ethyl acetate， showed significant differences compared to the model control group.

Key words： Diplazium lanceum； maximum tolerance； acute toxicity test； anti-inflammatory and analgesic； effective parts

水河劍為蹄蓋蕨科植物單葉雙蓋蕨［Diplazium lanceum （Thunb.） Presl.］的全草，又名小石劍、飛刀劍、金星草等［1］，其味甘、微苦，澀，性寒，具有涼血、止血、利尿通淋、清熱解毒等功效，用于治療尿路結(jié)石、熱淋尿血、目赤腫痛、肺結(jié)核等癥［2］，在廣西壯族［3］、瑤族等地作為民間習(xí)用藥材使用，也是廣西玉林制藥廠消石片的原料藥材。對于該科植物的研究主要集中于猴腿蹄蓋蕨、雙生短腸蕨［4］、菜蕨等植物，對單葉蹄蓋蕨的研究較少，因此對單葉蹄蓋蕨的研究很有必要，蹄蓋蕨科植物的主要成分有黃酮類、多酚類、有機酸類和甾體化合物［5］，這些成分往往具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用。黃酮類化合物具有抗炎鎮(zhèn)痛的效果，咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸等多酚類化合物均具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等藥理活性，中藥中的這些生物活性成分均為近期中藥研究的熱點。鮮見對水河劍藥材水提物、醇提物的急性毒性試驗研究，也沒有對水河劍抗炎鎮(zhèn)痛有效部位進行篩選的報道。本研究對水河劍藥材的水提物及醇提物進行急性毒性試驗并得出最大耐受量，為臨床用藥提供參考。并對水河劍藥材有效的抗炎鎮(zhèn)痛部位進行篩選，為下一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 76電子天平（EL204型），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S2型），金壇市醫(yī)療儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA 型），上海亞榮生化儀器廠；智能熱板鎮(zhèn)痛儀，成都泰盟軟件有限公司；冷凍干燥機（TF-FD-1型），上海田風(fēng)實業(yè)有限公司；離心機（TGL-16G型），上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.1.2 藥材與試劑 水河劍藥材采于廣西壯族自治區(qū)及貴州省各縣鎮(zhèn)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)郭敏教授鑒定為蹄蓋蕨科植物單葉雙蓋蕨；冰醋酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20160606；醋酸地塞米松片，辰欣藥業(yè)股份有限公司，批號221040205；羅通定片，四川迪菲特藥業(yè)有限公司，批號220302；試劑盒，江蘇晶美生物科技有限公司，批號202210。

1.1.3 實驗動物 清潔級昆明種（KM）小鼠，體重18～23 g，雌雄兼用，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于清潔級實驗室，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水飲食，照明時間為12 h光亮，12 h黑暗，試驗前進行適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d。

1.2 方法

1.2.1 水河劍藥材不同提取部位的制備 將水河劍藥材全草切割成拇指大小碎塊，稱取水河劍藥材10 kg，加10倍質(zhì)量的50%乙醇，回流提取3次，每次2 h，過濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無醇。真空干燥得水河劍藥材醇提取物1 718 g，醇提物得膏率為17.18%，放置冰箱備用。取醇提取物浸膏 1 518 g，用溫水溶解并依次用不同極性的溶劑進行萃取，得石油醚（60～90 ℃）部位提取物共154.39 g，得膏率為1.86%；得乙酸乙酯部位提取物95.71 g，得膏率為1.08%；得正丁醇部位提取物185.52 g，得膏率為2.10%；得水部位提取物574.34 g，得膏率為6.5%。均放置冰箱備用，使用時配制相應(yīng)濃度的溶液。

1.2.2 水河劍水提物及醇提物急性毒性預(yù)試驗 選取體重在21 g左右的KM清潔級小鼠80只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d，按照體重進行隨機分組。首先隨機選取16只KM小鼠，分別以水提與醇提可溶解的最大混懸濃度經(jīng)口灌胃。水提組最大混懸濃度為13.28 g/mL（每毫升含有13.28 g生藥量），醇提組最大混懸濃度為5.50 g/mL（每毫升含有5.50 g生藥量），其他給藥組每組設(shè)置6只KM小鼠，雌雄各半，以水提組及醇提組的最大混懸濃度為初始濃度進行等比級數(shù)設(shè)置（r1=1.306 6，r2=1.160 0），根據(jù)死亡情況設(shè)置組別，逐步探索零致死量（Dm）。上述各給藥組按小鼠最大給藥體積40 mL/kg進行灌胃，空白組以等體積的等離子水灌胃。給藥前12 h禁食。給藥4 h后正常喂養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d。如果預(yù)試驗無法得出水河劍藥材水提取物和醇提取物的半數(shù)致死量，則進行最大給藥量試驗。

1.2.3 最大給藥量試驗 選取體重在21 g左右的KM清潔級小鼠30只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d，按照體重隨機分為水提組、醇提組及空白組（去離子水）。水提組的灌胃生藥濃度為5.95 g/mL，醇提組的灌胃生藥濃度為4.13 g/mL，均以最大給藥體積40 mL/kg進行灌胃，空白組使用相同灌胃方法以等體積等離子水進行灌胃。各組小鼠1 d灌胃給藥1次，給藥4 h后常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d。期間觀察并記錄小鼠飲食、活動、精神狀態(tài)、皮毛膚色和大小便等，觀察有無中毒癥狀及死亡現(xiàn)象出現(xiàn)。14 d時，處死全部小鼠，對小鼠眼球取血，測全血血常規(guī)，并解離出心、肝、脾、肺、腎，觀察有無病變情況，并對其稱重，計算其臟器系數(shù)（mg/g）。

臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體重 （1）

小鼠的最大給藥量倍數(shù)=（每只小鼠最大給藥量/小鼠平均體重）×（成人平均體重/成人每日用量）

（2）

1.2.4 水河劍藥材鎮(zhèn)痛活性部位的篩選

1）熱板法。取用清潔級KM小鼠，雌性，體重18～23 g，進行熱板試驗，將小鼠置于熱板儀上（55±0.5）℃，記錄從小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后足現(xiàn)象（潛伏期）作為小鼠痛閾，挑選痛閾為5～30 s的小鼠進行熱板試驗。將痛閾合格的170只KM小鼠隨機分為模型對照組（吐溫-80），陽性組（羅通定0.2 g/kg），水河劍石油醚部位高、中、低劑量組，水河劍乙酸乙酯部位高、中、低劑量組，水河劍正丁醇部位高、中、低劑量組，水河劍醇部位高、中、低劑量組，水河劍水部位高、中、低劑量組，共17個組，每組10只，其中低、中、高劑量組為成人（60 kg）每日劑量的2、4、6倍。灌胃（ig）給藥，每天1次，連續(xù)7 d，末次灌胃給藥后記錄30、60、90、120 min的小鼠舔足潛伏期。并比較給藥前后小鼠痛閾的變化，計算痛閾提高率［6，7］。

痛閾值提高率=［（給藥后平均痛閾-給藥前平均痛閾）/給藥前平均痛閾值］×100% （3）

2）小鼠醋酸扭體試驗。將170只清潔級KM小鼠，雌雄各半，按照“1.2.4”熱板法進行隨機分組，每組10只，灌胃（ig）給藥，給藥與喂養(yǎng)方法同“1.2.4”熱板法。第7天灌胃給藥1 h后，腹腔注射0.6%冰醋酸溶液，注射劑量為10 mL/kg，記錄每只小鼠20 min內(nèi)的扭體次數(shù)，并計算給藥組小鼠鎮(zhèn)痛抑制率［8-11］。

鎮(zhèn)痛能力=［（對照組扭體次數(shù)-用藥組扭體次數(shù)）/對照組扭體次數(shù)］×100% （4）

3）耳腫脹試驗。將102只雄性清潔級KM小鼠按照“1.2.4”熱板法進行隨機分組，每組6只，灌胃（ig）給藥，給藥與喂養(yǎng)方法同“1.2.4”熱板法，其中陽性組給抗炎藥物醋酸地塞米松（0.000 6 g/kg）。第7天灌胃給藥1 h后，左耳不做處理，右耳采用50 μL二甲苯均勻涂抹在耳朵兩面致炎，致炎1 h后將小鼠脫頸處死，沿耳緣基線剪下左右兩耳，采用 6 mm 打孔器對兩耳同一部位打下圓耳片，于分析天平上稱重，以同一小鼠兩耳片之間的重量差異表示腫脹度，并計算腫脹抑制率比較抗炎效果［12-15］。

抑制率=［（對照組腫脹度-用藥組腫脹度）/對照組腫脹度］×100%

4）乙酸乙酯提取物對小鼠耳部二甲苯致炎血清中炎癥因子含量的影響 將60只清潔級KM小鼠，雌雄各半，體重18～23 g，按照體重隨機分組，每組12只共分為5組，為模型對照組（吐溫-80），陽性組（羅通定0.2 g/kg），乙酸乙酯高、中、低劑量組。給藥及喂養(yǎng)方式參考“1.2.4”熱板法。第7天灌胃給藥1 h后，左耳不做處理，右耳采用50 μL二甲苯均勻涂抹在耳朵兩面致炎，致炎1 h后取小鼠眼球血，并用冷凍離心機以轉(zhuǎn)速3 000 r/min在4 ℃條件下離心15 min，分離出血清。采用ELISA法用試劑盒與酶標(biāo)儀檢測血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、前列腺素E2（PGE2）炎癥因子的含量，按照試劑盒說明書進行操作［16-20］。

2 結(jié)果與分析

2.1 水河劍水提物及醇提物急性毒性預(yù)試驗

由表1可知，水提組與醇提組小鼠灌胃給藥后觀察14 d，死亡率未能達80%以上，無法測得絕對致死量（LD100）及半數(shù)致死量（LD50），因此改測小鼠最大耐受量（MTD）來判斷水河劍藥材水提物及醇提物對小鼠的急性毒性作用。小鼠以最大混懸濃度灌胃4 h，個別小鼠出現(xiàn)四肢無力、活動減少、間歇性抽搐、呼吸急促、發(fā)抖等中毒癥狀，后續(xù)觀察中毒癥狀可隨時間延長逐漸緩解，也有小鼠染毒后24 h內(nèi)死亡，解剖死亡小鼠，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟有質(zhì)異性改變。可說明水河劍藥材水提物及醇提物對小鼠有毒性。

2.2 最大耐受量試驗

經(jīng)毒性癥狀觀察可知，進行試驗的30只小鼠全部存活，絕大部分小鼠解剖所見：胸腔、腹腔未見異常液體，腸道未見脹氣，心、肝、脾、肺、腎等主要器官形態(tài)質(zhì)地正常、未見顏色改變及其他病理改變，胃黏膜顏色正常，無出血點。根據(jù)《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》記載水河劍藥材成人每日服用生藥量為9～15 g，故取15 g作為成人（60 kg）每日服用生藥量。水河劍藥材水提取物最大耐受量為238.0 g/ kg，醇提取物最大耐受量為165.2 g/kg（表2）。解剖兩組小鼠，心、肝、脾、肺、腎的體重比值及體重增長與空白組小鼠相比均無顯著差異（表3、表4）。兩組小鼠血常規(guī)與空白小鼠相比，白細(xì)胞（WBC）數(shù)目、中性粒細(xì)胞（Neu）數(shù)目、淋巴細(xì)胞（Lym）數(shù)目、紅細(xì)胞（RBC）數(shù)目、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、血小板數(shù)目（PLT）、血小板壓積（PCT）都有所上升，其中水提組小鼠的WBC、Neu、RBC與空白組相比具有顯著性差異，PLT、PCT與空白組相比具有極顯著差異。醇提組小鼠的Neu、RBC與空白組相比具有顯著差異，WBC、PLT、PCT與空白組相比具有極顯著差異（表5）。

2.3 水河劍不同極性部位抗炎鎮(zhèn)痛結(jié)果

2.3.1 水河劍不同極性部位對熱板致痛閾值的影響 由表6可知，水河劍藥材不同極性部位提取物組小鼠的舔足時間與模型對照組相比都有所延長，其中，水河劍藥材的各部位提取物在給藥后的30、60、90、120 min的其中1個或幾個給藥時間點，痛閾有顯著提高（P<0.05或P<0.01或P<0.001）。

2.3.2 水河劍不同極性部位對小鼠醋酸扭體的影響 由表7可以看出，水河劍藥材不同部位均對小鼠醋酸扭體有抑制效果，與模型對照組相比，醇提高劑量組、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位均有顯著抑制效果（P<0.05或P<0.01或P<0.001），各提取部位不同劑量組鎮(zhèn)痛率范圍為11.14%～40.36%。

2.3.3 水河劍不同極性部位對小鼠耳腫脹的影響 由表8可以看出，水河劍藥材不同部位均對小鼠耳腫脹有抑制效果，與模型對照組相比，除醇提中劑量組外，水河劍藥材水提部位，醇提低、高劑量組，石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位均有顯著抑制效果（P<0.05或P<0.01），各提取部位不同劑量組耳腫脹抑制率為24.71%～48.47%。

2.3.4 乙酸乙酯提取物對小鼠耳部二甲苯致炎血清中炎癥因子含量的影響 由表9可以看出，與模型對照組相比，乙酸乙酯高、中、低劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、PGE2炎癥因子含量均有所下降，其中乙酸乙酯低、中劑量組的IL-1β、PGE2含量及乙酸乙酯低劑量組的TNF-α含量具有顯著下降（P<0.05或P<0.01），與陽性組相比，乙酸乙酯低劑量組的IL-1β、乙酸乙酯中劑量組的TNF-α、PGE2及乙酸乙酯高劑量組的TNF-α、IL-1β、PGE2均有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）。

3 小結(jié)

本研究測得小鼠一次性口服水河劍水提物及醇提物最大耐受量（生藥量）分別為238.0、165.2 g/ kg，相當(dāng)于成人（60 kg）日常用量的952.0倍和660.8倍，表明水河劍水提物及醇提物臨床用量服用安全。血常規(guī)檢測顯示水提物與醇提物經(jīng)口急性毒性可能導(dǎo)致小鼠炎癥反應(yīng)及凝血能力增強。通過小鼠熱板法試驗及小鼠醋酸扭體試驗，發(fā)現(xiàn)水河劍藥材不同極性部位均有一定鎮(zhèn)痛效果，其中鎮(zhèn)痛效果最好的為乙酸乙酯部位，其次為石油醚部位。通過小鼠耳腫脹試驗，發(fā)現(xiàn)水河劍藥材不同部位均對小鼠耳腫脹有一定的抑制效果，其中乙酸乙酯及石油醚部位抗炎效果最好。試劑盒結(jié)果顯示，乙酸乙酯高、中、低劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、PGE2炎癥因子含量與模型對照組相比均有所下降。本試驗為水河劍藥材的臨床安全使用提供了參考，填補了水河劍抗炎鎮(zhèn)痛藥理作用的空白，但對水河劍藥理藥效研究仍不夠深入，其抗炎鎮(zhèn)痛機制還有待進一步研究。

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收稿日期：2023-09-18

基金項目：廣西一流學(xué)科建設(shè)立項課題（2018xk060；2019xk105）；廣西壯瑤藥重點實驗室開放課題（GXZYKF2022-11）；廣西中藥藥效研究重點實驗室研究課題（19-050-39-A6）；廣西高校中藥提取純化與質(zhì)量分析重點實驗室項目（桂教科研［2014］6號）

作者簡介：周楚惠（1998-），女，山東濟寧人，在讀碩士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量分析，（電話）17860632091（電子信箱）545061701@qq.com；通信作者，陳 勇（1961-），男，江西南昌人，教授，主要從事中藥民族藥質(zhì)量分析研究，（電子信箱）cy6381@163.com。

周楚惠，鄧青梅，陳 勇，等. 民族藥水河劍水提和醇提取物急性毒性試驗及抗炎鎮(zhèn)痛有效部位篩選［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（9）：119-124．