LC-ICP-MS法同時測定富硒大米中有機硒和無機砷

摘要：采用液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（LC-ICP-MS）技術，建立富硒大米中有機硒和無機砷同時檢測的方法，用于檢測湖北省市售富硒大米中有機硒和無機砷的含量。富硒大米前處理方法選用15 mg蛋白酶E和15 mg蛋白酶K混合提取，色譜條件采用Aglient ZORBAX SB-Aq色譜柱，流動相為20 mmol/L檸檬酸溶液+5 mmol/L己烷磺酸鈉溶液+1%甲醇溶液（pH=4.0），1 mL/min流速進樣，質(zhì)譜采用HEHe模式，可在5 min內(nèi)完全分離出3種有機硒和2種無機砷。3種有機硒和2種無機砷在1～50 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）均大于0.999 0，As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2、MeSeCys、SeMet的檢出限分別為0.10、0.12、0.18、0.15、0.15 μg/L，滿足檢測要求。無機砷的回收率為96.2%～101.3%，相對標準偏差為2.5%～3.9%，有機硒的回收率為72.4%～100.6%，相對標準偏差為2.1%～4.1%。該方法操作簡便、快速、靈敏度高，可用于富硒大米中有機硒和無機砷的同時檢測。

關鍵詞：富硒大米；有機硒；無機砷；LC-ICP-MS法

中圖分類號：TS207.3 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）09-0191-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.09.032 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Simultaneous determination of organic selenium and inorganic arsenic in selenium rich rice by LC-ICP-MS method

SU Ying， LIN Jin， FENG Hao， LI Yue， GUO Qing-qing， ZHOU Tao-hong

（Key Laboratory of Detection Technology of Focus Chemical Hazards in Animal Derived Food for State Market Regulation/Hubei Engineering Technology Research Center for Food Quality and Safety Testing/Hubei Shizhen Laboratory， Hubei？Provincial？Institute for Food Supervision and Test，Wuhan 430075， China）

Abstract： Using liquid chromatography inductively coupled plasma mass spectrometry （LC-ICP-MS） technology，a method for simultaneous detection of organic selenium and inorganic arsenic in selenium-rich rice had been established， which was used to detect the content of organic selenium and inorganic arsenic in selenium-rich rice sold in Hubei Province. The pre-treatment method for selenium rich rice involved the mixed extraction by using of 15 mg proteinase E and 15 mg proteinase K，the chromatographic conditions were performed using an AgClient ZORBAX SB Aq column， and the mobile phase consistd of a 20 mmol/L citric acid solution， a 5 mmol/L sodium hexane sulfonate solution， and a 1% methanol solution （pH=4.0）. Sample in jection was conducted at a flow rate of 1 mL/min， mass spectrometry used HEHe mode， and three types of organic selenium and two types of inorganic arsenic were separated completely within 5 minutes. The three types of organic selenium and two types of inorganic arsenic showed a good linear relationship ranging from 1 to 50 μg/L， with correlation coefficients （R2） greater than 0.999 0；the detection limits of As （Ⅴ）， As （Ⅲ）， SeCys2， MeSeCys， and SeMet were 0.10， 0.12， 0.18， 0.15， and 0.15 μg/L， respectively， which met the detection requirements. The recovery rate of inorganic arsenic was 96.2%～101.3%， with a relative standard deviation of 2.5%～3.9%；the recovery rate of organic selenium was 72.4%～100.6%， with a relative standard deviation of 2.1%～4.1%. This method was easy to operate， fast， and highly sensitive， and could be used for simultaneous detection of organic selenium and inorganic arsenic in selenium rich rice.

Key words： selenium rich rice； organic selenium； inorganic arsenic； LC-ICP-MS method

硒（Se）元素存在于自然界中，土壤中的硒會被農(nóng)作物吸收，人類則通過農(nóng)作物吸收硒元素［1］。中國絕大部分土壤含硒量較少，大米是中國主要的食物，但是大米中硒含量較低，為了獲得富硒大米，人們開始將大米種植在天然富硒土壤中或?qū)ν寥朗┘游省Ｎ请p功能元素，在一定范圍內(nèi)具有抗癌、解毒、抗衰老等作用，硒攝入量不足會引起缺硒性疾病，如克山病、大骨節(jié)病、心臟病等［2］，硒攝入量過大則會引起硒中毒［3］，因此對食品中硒元素的監(jiān)測至關重要。

土壤中重金屬對農(nóng)作物的毒害主要表現(xiàn)為抑制植物生長、降低作物產(chǎn)量，甚至增加可食部位重金屬含量，污染土壤中的重金屬砷（As）較易向農(nóng)作物子實遷移［4］，這將會直接危害人類健康。研究表明，適量Se可提高農(nóng)作物抗As能力，并調(diào)控農(nóng)作物對As的吸收累積，其主要機理為Se、As因具有相同的轉(zhuǎn)運蛋白和吸收通道而競爭吸收，而且高Se處理能顯著提高谷胱甘肽過氧化物酶活性、增加根中非蛋白巰基物質(zhì)和絡合素含量，從而緩解As的毒害［5，6］。砷可分為無機砷和有機砷，無機砷毒性強于有機砷，而土壤中砷的形態(tài)主要以三價砷［As（Ⅲ）］和五價砷［As（Ⅴ）］的形式存在。人類可能通過多元化的途徑暴露于無機砷及其化合物，而近年來，食物成為無機砷暴露的重要來源，其對人體健康構(gòu)成的潛在威脅已經(jīng)成為研究者關注的焦點［7］。因此，控制大米中無機砷的含量使其符合GB/T 2762—2022《食品安全國家標準 食品中污染物限量》的標準，同時關注富硒大米中有機硒的含量，對于富硒食品質(zhì)量安全有著重要的意義，也是地方硒產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的基石。

硒和砷元素形態(tài)分析通常采用液相色譜-原子熒光光譜法（LC-AFS）、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（LC-ICP-MS）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）、高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）及其他聯(lián)用技術。液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法具有分離效率高、靈敏度高等優(yōu)點。姜偉等［8］采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定富硒大米中硒代胱氨酸、L-硒-甲基硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸3種有機硒形態(tài)。Ma等［9］采用酶輔助萃取和離子對反相色譜- ICP-MS/MS聯(lián)用技術測定水稻中Se（Ⅳ）、Se（Ⅵ）、硒代胱氨酸、L-硒-甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）和硒代蛋氨酸，水稻中的硒代蛋氨酸是主要的硒形態(tài)。Da rose等［10］建立了液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定米漿中As（Ⅲ）、二甲基亞砷酸（DMA）、甲基亞砷酸（MMA）和As（Ⅴ）的方法，其中米漿中As（Ⅴ）是主要的砷形態(tài)。

同時檢測富硒大米中有機硒和無機砷的研究罕有報道，本研究采用液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法，對富硒大米中硒、砷提取條件和色譜分離條件進行優(yōu)化，建立同時檢測富硒大米中3種有機硒和2種無機砷的方法，以期為富硒大米中有機硒和無機砷的形態(tài)分布規(guī)律及含量監(jiān)測提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

富硒大米為湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗研究院抽檢的市售大米；硝酸（優(yōu)級純）、甲醇（色譜純）均購于賽默飛世爾科技公司；檸檬酸（分析純）、乙酸銨（分析純）、四丁基溴化銨（分析純）、Tris-HCl緩沖液、氨水（優(yōu)級純）、鹽酸（優(yōu)級純）均購于國藥集團化學試劑有限公司；蛋白酶E購于百靈威公司；蛋白酶XIV購于Sigma公司；蛋白酶K購于Merck公司；L-硒-甲基硒代半胱氨酸（MeSeCys）標準溶液、硒代蛋氨酸（SeMet）標準溶液、硒代胱氨酸（SeCys2）標準溶液、亞砷酸鹽［As（Ⅲ）］標準溶液、砷酸鹽［As（Ⅴ）］標準溶液均購于中國計量科學研究院；去離子水電阻率>18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設備

ME403型電子天平，美國METTLER TOLEDO公司；Multiwave 7000型超級微波消解儀：奧地利Anton paar公司；8800電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Aglient公司；1260高效液相色譜儀，美國Aglient公司；827 pH lab pH計，瑞士Metrohm公司；5810離心機，德國Eppendorf公司；SB25-12DTS型超聲波雙頻清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；WNE29型恒溫振蕩水浴鍋，德國Memmert公司。所有玻璃儀器均用硝酸溶液（20%）浸泡24 h以上，用去離子水沖洗干凈，烘干備用。

1.3 方法

1.3.1 儀器工作條件 采用調(diào)諧溶液對ICP-MS進行優(yōu)化，液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法的工作參數(shù)如表1所示。

1.3.2 樣品前處理

1）酸浸提法。準確稱取粉碎過篩的富硒大米樣品0.3 g于超級微波消解管中，加入3 mL硝酸溶液，200 ℃、30 min微波消解。待消解程序結(jié)束后置于趕酸板上趕酸20 min。取出消解管，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至離心管，用去離子水定容至25 mL，使用ICP-MS進行測定。每個樣品做3次平行，并做空白試驗［11］。

2）酶提取法。準確稱取粉碎過篩的富硒大米樣品1.0 g于離心管中，加入15 mg蛋白酶K、15 mg蛋白酶E和20 mL Tris-HCl提取液，于37 ℃恒溫振蕩箱中浸提過夜。提取后離心，取上清液過0.22 μm水性濾膜后待測，每個樣品做3個平行，并做空白試驗［12］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2019軟件分析，Origin 2022軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜峰的定性與定量

硒有6種同位素，分別為74Se、76Se、77Se、78Se、80Se、82Se。其中，80Se的自然豐度最高，占比為49.61%，但是在質(zhì)譜檢測中，會使用氬氣作為載氣，但80Se會對檢測結(jié)果造成干擾［13］。因此本研究選擇78Se和75As的積分面積作為定量依據(jù)，將3種有機硒和2種無機砷的標準溶液單獨進樣，根據(jù)單標的保留時間確定本試驗目標物質(zhì)的出峰順序。由圖1可知，5種目標物質(zhì)的出峰順序為As（Ⅴ）、SeCys2、As（Ⅲ）、 MeSeCys、SeMet，并且在5 min內(nèi)可將5種目標物質(zhì)完全分離。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動相的選擇 由于目標物質(zhì)中存在有機硒和無機砷2類化合物，根據(jù)前人研究的結(jié)果［14-16］，選擇5種流動相同時測定有機硒和無機砷（表2）。流動相1能將3種有機硒分離，無機砷中僅As（Ⅴ）出峰；流動相2可在5 min內(nèi)將5種目標物質(zhì)完全分離，且峰分離完好；流動相3可在5 min內(nèi)將5種目標物質(zhì)分離，但是各峰的分離度較小，不是最優(yōu)選擇；流動相4僅分離出2種有機硒，2種無機砷無法完全分離；流動相5與流動相3目標物質(zhì)的出峰時間相似，2種無機砷的分離度較小，無法完全分離。綜上，選擇20 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L己烷磺酸鈉溶液+1%甲醇溶液作為后續(xù)試驗的流動相。

2.2.2 流動相pH的選擇 目標物質(zhì)的分離效果會受到流動相pH的影響。本試驗以20 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L己烷磺酸鈉溶液+1%甲醇溶液為流動相，選擇不同的pH（3、4、5、6、7），探究有機硒和無機砷的分離效果。結(jié)果表明，當pH=3時，3種硒和2種砷出峰的時間為6 min，且SeMet拖尾嚴重。隨著pH的升高，5種目標物質(zhì)的保留時間逐漸減小，各峰的峰型得到改善，pH在4～6時5種目標物質(zhì)均能實現(xiàn)基線分離。當pH=7時，As（Ⅴ）和As（Ⅲ）無法完全分離。綜合分離度及工作效率，流動相的pH取4。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取條件的選擇 當用0.1 mol/L的鹽酸溶液協(xié)同超聲波提取時，色譜圖僅出現(xiàn)As（Ⅴ）和As（Ⅲ）的色譜峰，未分離出3種有機硒；當提高鹽酸溶液的濃度或者增加超聲波的時間后，仍然無法提取分離出3種有機硒。酶水解法的色譜圖出現(xiàn)As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2和SeMet的色譜峰，未見MeSeCys的峰。Zhao等［17］的研究表明，富硒大米中有機硒以SeMet為主，同時可能存在少量的SeCys2，與本研究的結(jié)果基本一致。因此本研究采用酶水解法進行試驗。

2.3.2 提取條件的優(yōu)化 提取有機硒、無機砷的酶主要有蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶XIV、脂肪酶等［18］。Zhang等［12］使用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶提取扇貝中的硒，Zhao等［17］使用40 mg蛋白酶、20 mg脂肪酶和5.0 mL水提取富硒大米中的硒。無機砷采用1%的硝酸溶液提?。?9］。本研究選擇Tris-HCl溶液（pH=7.5）作為緩沖液，蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶XIV 3種蛋白酶作為提取劑，對富硒大米中無機砷和有機硒進行提取，單獨使用時，酶的加入量為30 mg，2種酶混合使用時每種酶加入量為15 mg，3種酶混合使用時每種酶加入量為10 mg，結(jié)果如圖2所示。當?shù)鞍酌竼为毷褂脮r，有機硒提取率為45.8%～63.4%，其中蛋白酶K的提取率最低，其次為蛋白酶XIV，蛋白酶E的提取率最高；無機砷提取率為69.5%～74.0%，其中蛋白酶XIV的提取率最低，其次為蛋白酶K，蛋白酶E的提取率最高。當?shù)鞍酌富旌鲜褂脮r，有機硒、無機砷的提取率均明顯上升。蛋白酶E和蛋白酶K混合使用時有機硒提取效果最好，提取率為89.9%；蛋白酶K、蛋白酶E、蛋白酶XIV混合使用時無機砷提取效果最好，提取率為96.2%。綜上，本研究選擇15 mg蛋白酶E和15 mg蛋白酶K的混合酶。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線與檢出限 分別配制濃度為1、5、10、20、50 μg/L的As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2、SeMet和MeSeCys混合標準溶液，按“1.3.1”的條件進行上機測定。以目標物質(zhì)色譜峰的峰面積為縱坐標，硒、砷的濃度為橫坐標進行線性回歸分析，結(jié)果如表3所示。3種有機硒和2種無機砷在1～50 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）均大于0.999 0，As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2、MeSeCys、SeMet的檢出限分別為0.10、0.12、0.18、0.15、0.15 μg/L，滿足檢測要求。

2.4.2 精密度與準確度考察 對富硒大米樣品進行3個梯度水平的加標回收試驗，3種有機硒和2種無機砷的回收率和相對標準偏差（RSD）如表4所示。無機砷的回收率為96.2%～101.3%，相對標準偏差為2.5%～3.9%，有機硒的回收率為72.4%～100.6%，相對標準偏差為2.1%～4.1%。

2.4.3 富硒大米樣品的測定 選取20個富硒大米樣品進行硒含量測定，選取硒含量排前10的富硒大米樣品，按照液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法進行無機砷和有機硒的測定，結(jié)果如圖3和表5所示。富硒大米樣品中有機硒主要是以硒代蛋氨酸的形式存在，其余有機硒未檢出，無機砷均有檢出。富硒大米的有機硒含量為0.059～0.204 mg/kg，符合GB/T 22499—2008《富硒稻谷》標準。邵鵬威等［20］同樣使用液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定恩施富硒地區(qū)大米的硒形態(tài)，富硒大米中硒的形態(tài)主要是硒代蛋氨酸，與本研究的結(jié)果一致。同時，富硒大米無機砷含量為0.049～0.146 mg/kg，所有樣品的無機砷含量均符合GB/T 2762—2022《食品安全國家標準 食品中污染物限量》的限量。

3 小結(jié)

本研究建立的液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法將富硒大米樣品中的3種有機硒和2種無機砷進行有效分離。使用20 mL Tris-HCl緩沖溶液添加15 mg蛋白酶K和15 mg蛋白酶E對富硒大米進行前處理提取，并選擇用20 mmol/L檸檬酸+5 mmol/L己烷磺酸鈉溶液+1%甲醇溶液（pH=4）作為流動相，在5 min內(nèi)將As（Ⅴ）、As（Ⅲ）、SeCys2、SeMet和MeSeCys分離。采用該方法對湖北省市售的富硒大米進行檢測，發(fā)現(xiàn)富硒大米的有機硒主要成分為硒代蛋氨酸，富硒大米樣品的有機硒含量均符合國家標準，無機砷的含量也均低于國家標準的限量。本方法能夠快速有效地對市售富硒大米中有機硒和無機砷含量進行檢測，為后續(xù)更多食品中有機硒和無機砷含量檢測提供參考。

參考文獻：

［1］ BROWN K M，ARTHUR J R. Selenium， selenoproteins and human health：A review［J］. Public health nutrition，2001，4（2B）：593-599.

［2］ 馮洪燕， 楊從發(fā).市售富硒食品中硒形態(tài)及含量的分析［J］.食品安全質(zhì)量檢測學報， 2021， 12（12）：5059-5065.

［3］ HADRUP N， RAVN-HAREN G. Acute human toxicity and mortality after selenium ingestion： A review［J］. Journal of trace elements in medicine and biology，2020， 58：1-5.

［4］ 朱丹尼，鄒勝章，周長松，等.不同耕作類型下土壤-農(nóng)作物系統(tǒng)中汞、砷含量與生態(tài)健康風險評價［J］. 中國地質(zhì)， 2021， 48（3）： 708-720.

［5］ 耿安靜，王 旭，李秋劍，等.砷在土壤-農(nóng)作物系統(tǒng)遷移的影響因素研究進展［J］.產(chǎn)品質(zhì)量與安全， 2020（3）：24-30，62.

［6］ ZHENG X， HONG J， ZHANG J， et al. Arsenic contents， speciation and toxicity in germinated rice alleviated by selenium［J］. Foods，2023， 12（14）：1-10.

［7］ MAWIA A M， HUI S， ZHOU L，et al. Inorganic arsenic toxicity and alleviation strategies in rice［J］. Journal of hazardous materials. 2021 ， 408：1-21.

［8］ 姜 偉，張 璐，劉志斌，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定富硒大米中有機硒的形態(tài)［J］.廣東化工，2020，47（2）：158-159，173.

［9］ MA Q， ZHANG Q， LI X，et al. The compound-independent calibration of five selenium species in rice using ion-pairing reversed phase chromatography coupled to inductively coupled plasma tandem mass spectrometry［J］.Journal of chromatography A， 2022， 1674：1-13.

［10］ DA ROSA F C，NUNES M A G， DUARTE F A， et al. Arsenic speciation analysis in rice milk using LC-ICP-MS［J］. Food chemistry： X， 2019， 2：1-22.

［11］ KOLACHI N F， KAZI T G， BAIG J A， et al. Microwave-assisted acid extraction of selenium from medicinal plants followed by electrothermal atomic absorption spectrometric determination［J］. Jounal of AOAC international，2010，93（2）：694-702.

［12］ ZHANG Q， YANG G. Selenium speciation in bay scallops by high performance liquid chromatography separation and inductively coupled plasma mass spectrometry detection after complete enzymatic extraction［J］. Journal of chromatography A， 2014， 1325：83-91.

［13］ 王賢波，劉 超，葉生月，等.超聲-微波協(xié)同提取-高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定莓茶中的硒形態(tài)［J］.食品科技， 2023， 48（5）：272-277.

［14］ KARA？ K， ZIO？A-FRANKOWSKA A， FRANKOWSKI M. New method for simultaneous arsenic and selenium speciation analysis in seafood and onion samples ［J］. Molecules，2021， 26：1-6.

［15］ PARK M K， CHOI M， KIM L，et al. An improved rapid analytical method for the arsenic speciation analysis of marine environmental samples using high-performance liquid chromatography/inductively coupled plasma mass spectrometry［J］. Environmental monitoring and assessment， 2019， 191： 1-14.

［16］ 陸秋艷，張文婷，林秋蓮，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用快速同時分析水中5種砷和7種硒［J］.環(huán)境化學，2018，37（7）：1671-1674.

［17］ ZHAO Y， ZHENG J， YANG M， et al. Speciation analysis of selenium in rice samples by using capillary electrophoresis-inductively coupled plasma mass spectrometry［J］. Talanta，2011， 84（3）：983-988.

［18］ VěRA K， ANTONíN K， GABRIELA K， et al. Effect of protease XXIII on selenium species interconversion during their extraction from biological samples［J］.Journal of food composition and analysis， 2022， 105， 1-6.

［19］ MATSUMOTO E， MATSUMOTO M. Determination of arsenic species in edible insects by LC-ICP-MS ［J］. Jounal of AOAC international， 2023，106（6）：1525-1531.

［20］ 邵鵬威，路國慧，鄭 宇，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜測定大米粉中的硒形態(tài)［J］. 環(huán)境化學，2020，39（5）：1434-1441.

收稿日期：2023-10-13

基金項目：湖北省重點研發(fā)計劃項目（2022BBA0077）；湖北省市場監(jiān)督管理局科技計劃專項（Hbscjg-KJ2023005）

作者簡介：蘇 瑩（1997-），女，湖北荊門人，助理工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量與安全研究，（電話）13774067369（電子信箱）513278616@qq.com；通信作者，林 津（1988-），女，湖北武漢人，高級工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量與安全研究，（電子信箱）524153439@qq.com。

蘇 瑩，林 津，馮 灝，等. LC-ICP-MS法同時測定富硒大米中有機硒和無機砷［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2024，63（9）：191-195．