我國(guó)未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重?cái)?shù)字PCR精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法建立

摘要：隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在農(nóng)產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易中的比重不斷增加，因混雜少量目的國(guó)未批準(zhǔn)品系而引發(fā)的低水平混雜事件日益凸顯。為了應(yīng)對(duì)低含量轉(zhuǎn)基因成分的精準(zhǔn)定量檢測(cè)需求，針對(duì)我國(guó)未批準(zhǔn)、國(guó)際上已經(jīng)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系，建立了雙重?cái)?shù)字PCR定量檢測(cè)方法。對(duì)5套不同油菜內(nèi)源基因與MS11品系檢測(cè)引物探針組合進(jìn)行篩選，選出相互抑制效應(yīng)低、反應(yīng)效率高、內(nèi)源基因單拷貝、數(shù)字PCR陽(yáng)性微滴單元與陰性微滴單元區(qū)分明顯的引物探針組合。后對(duì)PCR反應(yīng)退火溫度、引物探針濃度等進(jìn)行優(yōu)化。在篩選出適宜的引物探針組合，以及優(yōu)化后的反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，對(duì)反應(yīng)體系的特異性、可重復(fù)性和定量精密度、靈敏度、定量準(zhǔn)確性等進(jìn)行測(cè)試。篩選和優(yōu)化結(jié)果表明，油菜內(nèi)源基因PEP與MS11品系引物探針組合在退火溫度為58 ℃，引物探針比為1.5 ∶1.0時(shí)，反應(yīng)效率最高。方法特異于轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系檢測(cè)，在其他轉(zhuǎn)基因作物品系和非轉(zhuǎn)基因作物中無(wú)顯著擴(kuò)增。從10拷貝/μL到 8 000拷貝/μL 3個(gè)數(shù)量級(jí)的DNA模板各重復(fù)間測(cè)定絕對(duì)拷貝數(shù)和百分比含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在可接受范圍內(nèi)，可重復(fù)性和定量精確度高。方法的檢測(cè)下限低至2拷貝/μL，定量下限為10拷貝/μL基因組DNA。對(duì)10%、2.0%、0.5%和0.1% 4個(gè)MS11品系成分含量樣品定量結(jié)果表明，測(cè)定值與設(shè)定值間的偏差（bias）均在±25%之間，定量準(zhǔn)確性高。結(jié)論表明，建立的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重?cái)?shù)字PCR精準(zhǔn)定量方法適用于對(duì)低含量MS11品系成分的精、準(zhǔn)定量，可以滿足口岸對(duì)低水平混雜問題的應(yīng)對(duì)需求。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因油菜；MS11品系；數(shù)字PCR；定量；低水平混雜

中圖分類號(hào)：TS207 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）16-0045-08

油菜是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是我國(guó)第一大油料作物，其在油脂、蔬菜、花粉、蜂蜜、飼料生產(chǎn)等方面均具有利用價(jià)值，還兼具觀賞價(jià)值，因此在國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中占有重要地位［1］。油脂類產(chǎn)品的穩(wěn)定、有效供給是保障我國(guó)食品安全的重要組成部分［2］。但由于國(guó)內(nèi)油脂類產(chǎn)品需求旺盛，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)需要，因此我國(guó)油菜籽、菜籽油、菜籽粕進(jìn)口量長(zhǎng)期保持在高位，是全球第二大油菜籽進(jìn)口國(guó)，主要來(lái)自加拿大、俄羅斯、澳大利亞、烏克蘭等國(guó)，其中2016—2020年從加拿大進(jìn)口油菜籽占比超過90%，而加拿大、澳大利亞的轉(zhuǎn)基因油菜覆蓋率已超過90%［1-3］。

根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織的數(shù)據(jù)，截至2019年底，全球轉(zhuǎn)基因油菜種植面積達(dá)1 010萬(wàn)hm2，占油菜總種植面積的27%，主要分布在加拿大、美國(guó)、澳大利亞和智利［4］。全球共有15個(gè)國(guó)家/地區(qū)批準(zhǔn)了45個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品系（包括復(fù)合品系）作為食物、飼料、加工和種植用途。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部自2002年起相繼批準(zhǔn)了10個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品系進(jìn)口用作加工原料。MS11品系是拜耳作物科學(xué)公司研發(fā)的賦予草銨膦除草劑耐受性和授粉控制系統(tǒng)（雄性不育和恢復(fù)系）的轉(zhuǎn)基因油菜品系，自2017年起相繼在美國(guó)、加拿大、澳大利亞批準(zhǔn)種植，并在7個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)食用和飼用，但我國(guó)尚未批準(zhǔn)MS11品系的進(jìn)口，是口岸重點(diǎn)監(jiān)控的品系之一［5］。

在轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管上，全球已有數(shù)十個(gè)國(guó)家/地區(qū)實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)管理制度，并設(shè)定標(biāo)識(shí)閾值，因此建立有效的轉(zhuǎn)基因作物定量檢測(cè)方法至關(guān)重要。同時(shí)，隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易中的比重不斷增加，因低水平混雜（LLP）問題導(dǎo)致的貿(mào)易中斷風(fēng)險(xiǎn)不斷提升［6］。國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）、經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）以及美國(guó)、歐盟等國(guó)家和地區(qū)均認(rèn)為L(zhǎng)LP是在進(jìn)出口農(nóng)產(chǎn)品中混雜了在其他國(guó)家/地區(qū)通過安全評(píng)價(jià)的轉(zhuǎn)基因成分，卻無(wú)意、少量地存在于尚未批準(zhǔn)的國(guó)家/地區(qū)的貨物中［7-10］。由于各國(guó)/地區(qū)針對(duì)LLP設(shè)定的閾值一般在0.1%～1.0%之間，對(duì)食用和種用作物采取零容忍政策，因此建立和完善我國(guó)未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因作物品系的精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法，制定相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，從而實(shí)現(xiàn)低轉(zhuǎn)基因成分含量的準(zhǔn)確、有效定量，對(duì)應(yīng)對(duì)國(guó)際貿(mào)易中的LLP現(xiàn)象，保障轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)制度的順利實(shí)施具有重要意義。為此，本研究基于可不依賴于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)曲線而進(jìn)行絕對(duì)定量的微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，建立我國(guó)未批準(zhǔn)進(jìn)境的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法，制定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，以期為保障國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易順暢提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因油菜（Brassica napus）MS11、GT73、MS1、RF2、RF3、Topas19/2、T45和Oxy235品系，轉(zhuǎn)基因大豆（Glycine max L.）MON89788品系標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自美國(guó)油脂化學(xué)家協(xié)會(huì)（American Oil Chemists Society，AOCS）。轉(zhuǎn)基因玉米（Zea mays L.）GA21品系，轉(zhuǎn)基因棉花（Gossypium hirsutum L.）GHB119品系標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自歐盟聯(lián)合研究中心標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所（The JRCs Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）。轉(zhuǎn)基因苜蓿（Medicago sativa）J163品系來(lái)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品庫(kù)（編號(hào)：GSB 11—3645—2019）。轉(zhuǎn)基因水稻（Oryza sativa）TT51品系、非轉(zhuǎn)基因大豆以及非轉(zhuǎn)基因油菜樣品由筆者所在實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取和純化 除部分基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外，其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或樣品干粉采用DNeasy mericon Food Kit（REF：69514，德國(guó)Qiagen GmbH公司）進(jìn)行核酸提取和純化。采用Nanovue Plus微量分光光度計(jì)（美國(guó)通用電氣公司）對(duì)提取的各樣品DNA溶液進(jìn)行濃度測(cè)定，并記錄D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm，以判定提取的基因組DNA質(zhì)量。DNA稀釋至100 ng/μL保存。

1.2.2 不同百分含量樣品制備 為了對(duì)建立的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重?cái)?shù)字PCR定量檢測(cè)方法的定量準(zhǔn)確度和精確度進(jìn)行測(cè)試，采用同等濃度MS11品系DNA與非轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA進(jìn)行混合的方式，制備含有0.1%、0.5%、2.0%和10.0% MS11品系含量的樣品。在配制前，對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系DNA與非轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA進(jìn)行了DNA濃度的多次測(cè)定，取平均值進(jìn)行計(jì)算。后按照比例進(jìn)行DNA混合。10% MS11成分含量的樣品是取20 μL 50% MS11品系標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA，與 80 μL 非轉(zhuǎn)基因油菜DNA溶液進(jìn)行充分混勻；2%含量的樣品則取20 μL 10%含量的樣品DNA與 80 μL 非轉(zhuǎn)基因油菜DNA混合均勻；0.5%含量的樣品是將25 μL 2%含量的樣品DNA加入75 μL非轉(zhuǎn)基因油菜DNA溶液中配制而成；0.1%含量的樣品是通過20 μL 0.5%含量的DNA與80 μL非轉(zhuǎn)基因油菜DNA混合而來(lái)。

1.2.3 引物和探針篩選 考慮到2對(duì)引物、探針的匹配度、相互干擾、擴(kuò)增效率、熒光信號(hào)和本底信號(hào)強(qiáng)弱等方面均對(duì)雙重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效果影響較大，因此對(duì)引物、探針進(jìn)行系統(tǒng)化的篩選和優(yōu)化。進(jìn)行篩選的引物、探針序列見表1，油菜內(nèi)源基因共5個(gè)，包括CruA、CCF、FatA、HMG和PEP，內(nèi)源基因采用HEX熒光通道，MS11品系特異性序列采用FAM熒光通道。引物及探針由寶生物工程（大連）有限公司合成并純化，并稀釋至10 μmol/L備用。采用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行雙重?cái)U(kuò)增引物探針的初步篩選，對(duì)于相互抑制較低的組合再采用數(shù)字PCR進(jìn)行引物探針的篩選。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增采用賽默飛世爾科技公司AB ViiA7型熒光定量PCR儀完成。反應(yīng)體系為：2×Real-time PCR Mastermix（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）12.5 μL，內(nèi)源基因和MS11品系上下游引物終濃度為400 nmol/L，探針終濃度為200 nmol/L，DNA模板2 μL，無(wú)DNA酶和RNA酶的水補(bǔ)足至總體積25 μL。反應(yīng)條件為 50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 反應(yīng)體系篩選及優(yōu)化 為了提升數(shù)字PCR反應(yīng)陽(yáng)性微滴單元與陰性微滴單元的區(qū)分度，降低介于二者之間的中等信號(hào)強(qiáng)度微滴單元，對(duì)數(shù)字PCR退火和延伸溫度、引物與探針濃度進(jìn)行優(yōu)化和測(cè)試。采用同等濃度的引物、探針以及數(shù)字PCR擴(kuò)增體系，設(shè)置溫度梯度52～62 ℃，8個(gè)孔溫度分別為52.0、52.7、53.9、55.8、58.1、60.0、61.2、 62.0 ℃，共8個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)， 進(jìn)行雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增退火和延伸溫度的篩選。設(shè)置4個(gè)內(nèi)源基因與MS11品系特異性序列引物、探針濃度比，包括 MS11 ∶內(nèi)源=1 ∶0.75，MS11 ∶內(nèi)源=1 ∶1，MS11 ∶內(nèi)源=1 ∶1.2，MS11 ∶內(nèi)源=1 ∶1.5組合，每個(gè)濃度比擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)2次，對(duì)雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增的引物、探針濃度進(jìn)行篩選。

1.2.5 微滴式數(shù)字PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)總體積為20 μL，其中2× ddPCR Supermix for Probes（no dUTP）10 μL（美國(guó)伯樂公司）；MS11品系上下游引物終濃度為500 nmol/L，探針濃度為 250 nmol/L，內(nèi)源基因引物、探針終濃度根據(jù)篩選比例進(jìn)行計(jì)算；DNA模板2 μL；剩余體積用無(wú)DNA酶和RNA酶的水補(bǔ)足。

將所有試劑以及DNA模板充分混勻后使用微滴發(fā)生器將20 μL混合液分散到約 20 000個(gè)微滴中，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)間的物理隔離。反應(yīng)條件設(shè)定為95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，退火溫度1 min，40 個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min。反應(yīng)后在QX200型微滴分析儀（美國(guó)伯樂公司）上進(jìn)行熒光信號(hào)收集、讀取，采用儀器自帶的分析軟件進(jìn)行結(jié)果計(jì)算和分析，獲得每個(gè)反應(yīng)孔微滴生成數(shù)、陽(yáng)性微滴數(shù)，換算得到樣品的絕對(duì)拷貝數(shù)濃度。

1.2.6 方法特異性測(cè)試 以15種常見的轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物材料，包括轉(zhuǎn)基因油菜MS11、GT73、MS1、RF2、RF3、Topas19/2、T45、Oxy235品系，轉(zhuǎn)基因大豆MON89788品系，轉(zhuǎn)基因苜蓿J163品系，轉(zhuǎn)基因棉花GHB119品系，轉(zhuǎn)基因玉米GA21品系，轉(zhuǎn)基因水稻TT51品系，非轉(zhuǎn)基因大豆以及非轉(zhuǎn)基因油菜為模板，采用雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法擴(kuò)增，測(cè)試方法的特異性。

1.2.7 可重復(fù)性測(cè)試和定量精密度測(cè)定 對(duì)建立的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重?cái)?shù)字PCR方法的可重復(fù)性、定量精密度進(jìn)行測(cè)試。將含量為50%左右的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA溶液（100 ng/μL），用0.1×TE緩沖液（含Tris-HCl，EDTAoNa，pH值為8.0）稀釋至10、2、1、0.5、0.1、0.05、0.025 ng/μL 7個(gè)濃度。根據(jù)1 ng核酸約相當(dāng)于829拷貝油菜單倍體基因組DNA進(jìn)行換算，上述DNA濃度分別對(duì)應(yīng)8 294、1 659、829、414、82、41、20拷貝/μL油菜基因組DNA。采用上述7個(gè)濃度DNA進(jìn)行雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度重復(fù)4次，然后分別計(jì)算各重復(fù)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），同時(shí)計(jì)算各濃度測(cè)定的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系百分含量。

1.2.8 靈敏度測(cè)試 將轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系DNA稀釋至10、2拷貝/μL，對(duì)建立的雙重?cái)?shù)字PCR方法的檢測(cè)下限（limit of detection，LOD）和定量下限（limit of quantification，LOQ）進(jìn)行測(cè)定。LOD和LOQ是在95%置信水平下，能夠分別準(zhǔn)確檢測(cè)、準(zhǔn)確定量的最低濃度水平［11］。每個(gè)核酸濃度設(shè)置2組平行試驗(yàn)，每組平行試驗(yàn)重復(fù)8次。計(jì)算各重復(fù)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差SD和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%，RSD）。

1.2.9 定量準(zhǔn)確性測(cè)定 采用分別含有0.1%、0.5%、2.0%和10% 轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系含量的樣品測(cè)試雙重?cái)?shù)字PCR方法的定量準(zhǔn)確性。每個(gè)樣品平行重復(fù)擴(kuò)增4次。根據(jù)數(shù)字PCR絕對(duì)定量獲得的PEP基因和MS11品系特異性序列拷貝數(shù)，按照GB/T 19495.5—2018《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法》中的公式分別計(jì)算轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系百分含量［12］。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出各重復(fù)間的SD、RSD，以及測(cè)定值與設(shè)定值間的偏差（bias），分析方法的定量準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)體系篩選和優(yōu)化

為了降低加樣誤差對(duì)數(shù)字PCR定量檢測(cè)結(jié)果的影響，提高定量準(zhǔn)確性，本研究采用雙重?cái)?shù)字PCR方法，使油菜內(nèi)源基因與MS11品系特異性序列在同一反應(yīng)體系中檢測(cè)［13］。雙重?cái)?shù)字PCR需要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化，以保證2對(duì)引物、探針間相互抑制效應(yīng)最低化，保證定量結(jié)果的可靠性。本研究對(duì)引物探針組合及其濃度比、反應(yīng)退火溫度進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。采用5個(gè)油菜內(nèi)源基因分別與MS11品系特異性序列組合進(jìn)行擴(kuò)增，篩選因素包括擴(kuò)增效率、雙重互相抑制情況和匹配度，以及該內(nèi)源基因在油菜單倍體基因組中的拷貝數(shù)等。

雙重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。5組擴(kuò)增圖相比，MS11品系的擴(kuò)增曲線差別不大，但內(nèi)源基因擴(kuò)增曲線差別較大。FatA基因的擴(kuò)增曲線明顯滯后于MS11，相差4個(gè)CT值左右，說(shuō)明雙重?cái)U(kuò)增有相互抑制（圖1-D），其他4個(gè)內(nèi)源基因的擴(kuò)增曲線與MS11基本重合。進(jìn)一步對(duì)4個(gè)內(nèi)源基因進(jìn)行雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，擴(kuò)增的總微滴數(shù)在 12 336～14 975之間，可以進(jìn)一步進(jìn)行分析。CruA、PEP、HMG和CCF 4個(gè)內(nèi)源基因測(cè)定拷貝數(shù)分別為11 880、6 260、6 000、12 490，測(cè)定的MS11品系拷貝數(shù)分別為2 690、2 930、2 860、2 870。因MS11品系標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的百分含量約為50%左右，而MS11品系特異性序列拷貝數(shù)與CruA、CCF基因拷貝數(shù)比為0.20～0.25之間，表明CruA、CCF基因在油菜單倍體基因組中為多拷貝基因。從熒光值來(lái)看，PEP基因陰性微滴單元熒光值在2 000附近，陽(yáng)性微滴單元熒光值在6 000～7 000附近；HMG基因陰性微滴單元熒光值在1 000和2 000各有1簇，陽(yáng)性微滴單元熒光值在5 000～6 000附近。MS11品系特異性序列在與PEP進(jìn)行組合時(shí)熒光值最高，表明受抑制最低。因此，PEP與MS11組合反應(yīng)效率更高，陽(yáng)性微滴與陰性微滴單元差值最大，更加容易進(jìn)行區(qū)分，絕對(duì)定量值更加準(zhǔn)確。因此，采用PEP與MS11組合進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化。

對(duì)ddPCR反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖2。在58 ℃退火和延伸溫度條件下，PEP基因和MS11品系特異性序列的陽(yáng)性微滴更加集中、熒光值更高，陽(yáng)性微滴與陰性微滴區(qū)分更加明顯，擴(kuò)增效率更好。比較PEP基因與MS11品系引物探針4種濃度比組合的擴(kuò)增結(jié)果，當(dāng)引物探針濃度比為 MS11 ∶PEP=1 ∶1.5時(shí)，2個(gè)目標(biāo)的反應(yīng)效率、陰陽(yáng)性微滴區(qū)分度等最優(yōu)。因此，MS11品系引物探針MS11-F/R/P與油菜內(nèi)源基因PEP引物探針Q-PEP-1F/2R/P1匹配，且引物探針濃度比MS11 ∶PEP在 1 ∶1.5，退火溫度在58 ℃時(shí)進(jìn)行雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增效率最高，微滴“下雨”現(xiàn)象不明顯。

2.2 方法特異性測(cè)試

采用15種轉(zhuǎn)基因油菜、大豆 、玉米、棉花、苜蓿、水稻等常見轉(zhuǎn)基因作物品系，以及非轉(zhuǎn)基因大豆、油菜樣品為模板，進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖3）表明，以轉(zhuǎn)基因油菜 MS11、GT73、MS1、RF2、RF3、Topas19/2、T45和Oxy235品系陽(yáng)性品，非轉(zhuǎn)基因油菜DNA為模板，可以擴(kuò)增出油菜內(nèi)源PEP基因；以其他轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性品和非轉(zhuǎn)基因大豆DNA為模板，無(wú)顯著擴(kuò)增。僅當(dāng)采用轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA為模板時(shí)，MS11-F/R/P引物探針可以得到擴(kuò)增，而采用其他轉(zhuǎn)基因油菜品系和其他轉(zhuǎn)基因作物為模板時(shí)均無(wú)擴(kuò)增。表明雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增體系特異于轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系檢測(cè)。

2.3 可重復(fù)性和定量精密度測(cè)試

數(shù)字PCR反應(yīng)的可重復(fù)性和定量精密度是衡量檢測(cè)體系穩(wěn)健性的指標(biāo)［14］。采用10、2、1、0.5、0.1、0.05、0.025 ng/μL 7個(gè)濃度轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DNA（含量為50%左右）進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示，隨著模板濃度的降低，RSD有逐漸增大的趨勢(shì)。7個(gè)濃度模板對(duì)MS11品系特異性序列測(cè)定的SD介于1.04～138.19之間，RSD介于1.60%～16.83%之間； 對(duì)PEP基因測(cè)定的RSD介于2.51%～15.81%之間（表2），均在可接受范圍內(nèi)［15-16］。

雙重?cái)?shù)字PCR定量方法精密度采用上述數(shù)字PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和評(píng)估。當(dāng)采用7個(gè)濃度DNA樣品進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，測(cè)定的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系成分百分含量分別為44.59%、44.62%、45.18%、45.13%、47.95%、43.38%和47.34%，SD在1.64%～6.72%之間，RSD在2.82%～14.11%之間（表3）。當(dāng)采用最低的20拷貝/μL基因組DNA（MS11成分約10拷貝/μL）樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，各重復(fù)間百分比含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差仍小于25%，在可接受范圍內(nèi)。

因此，經(jīng)對(duì)10拷貝/μL到8 000拷貝/μL 3個(gè)數(shù)量級(jí)差異的DNA模板測(cè)定結(jié)果表明，基于PEP基因和MS11品系特異性序列建立的雙重?cái)?shù)字PCR定量檢測(cè)方法可重復(fù)性和定量精密度好，即使模板濃度低至10拷貝，仍能準(zhǔn)確定量，方法穩(wěn)定、可靠。

2.4 靈敏度測(cè)試

以2、10拷貝/μL油菜MS11品系DNA為模板，測(cè)試建立的雙重?cái)?shù)字PCR方法的LOD和LOQ。2個(gè)濃度DNA樣品測(cè)定的MS11品系平均值分別為[JP3]9.21、1.91拷貝/μL，SD分別為1.63、0.74拷貝/μL，RSD分別為17.70%和38.75%（表4）；內(nèi)源基因PEP測(cè)定平均值分別為17.38、4.93拷貝/μL，RSD分別為15.85%和27.98%。2個(gè)目標(biāo)2拷貝濃度的RSD超過了可接受范圍，因此雙重?cái)?shù)字PCR方法的檢測(cè)下限（LOD）為2拷貝/μL基因組DNA， 定量下限（LOQ）為10拷貝/μL基因組DNA。

2.5 準(zhǔn)確度測(cè)試

定量準(zhǔn)確度是對(duì)測(cè)量結(jié)果與被測(cè)量的真值之間的一致程度進(jìn)行評(píng)估。配制轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系含量分別為 10 %、2 %、0.5 %和0.1% 4個(gè)百分比的樣品進(jìn)行定量測(cè)定。結(jié)果表明，4個(gè)百分比含量樣品的定量結(jié)果分別為10.07%、2.04%、0.47%和0.10%，各百分含量樣品4次重復(fù)間的SD≤0.38%，RSD≤13.95%。各百分比含量樣品的4次重復(fù)測(cè)定值與設(shè)定值之間的偏差見圖4，可以看出隨著MS11品系成分含量的降低，bias值有增大趨勢(shì)，但所有bias值均小于±25%，在可接受范圍內(nèi)。表明建立的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系雙重?cái)?shù)字PCR方法定量準(zhǔn)確度高，可對(duì)低至0.1%含量轉(zhuǎn)基因油菜MS11成分的樣品進(jìn)行精準(zhǔn)定量。

3 結(jié)論和討論

在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物從無(wú)到有，到快速發(fā)展的20多年間，全球轉(zhuǎn)基因作物種植范圍、面積越來(lái)越廣，種植品系越來(lái)越豐富，由轉(zhuǎn)基因作物加工而來(lái)的農(nóng)產(chǎn)品對(duì)國(guó)際貿(mào)易的影響也逐漸深入。由于各國(guó)/地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及品系的審批范圍、審批進(jìn)度差別很大，轉(zhuǎn)基因成分低水平混雜等現(xiàn)象帶來(lái)的準(zhǔn)入問題日益突出，給農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易帶來(lái)顯著影響。為此，急需在口岸建立和完善我國(guó)未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因作物品系精準(zhǔn)定量檢測(cè)技術(shù)體系、檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，以實(shí)現(xiàn)低含量轉(zhuǎn)基因成分的有效、精確定量，降低轉(zhuǎn)基因成分低水平混雜等貿(mào)易不利因素的影響力。

目前，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)多為基于實(shí)時(shí)熒光PCR建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的相對(duì)定量方法。與實(shí)時(shí)熒光PCR方法相比，基于絕對(duì)定量的數(shù)字PCR方法對(duì)反應(yīng)抑制劑敏感度更低，PCR擴(kuò)增效率對(duì)結(jié)果的影響更小，穩(wěn)健性更強(qiáng)［17-18］。同時(shí)，雙重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，由于2個(gè)目標(biāo)均在同一反應(yīng)單元中完成，由加樣、體系總量差異等帶來(lái)的誤差更低，因此結(jié)果更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確。但是，在方法建立中，仍需對(duì)2個(gè)檢測(cè)目標(biāo)的相互抑制情況、引物探針的匹配性、引物探針濃度、反應(yīng)退火和延伸溫度等進(jìn)行優(yōu)化，從而使結(jié)果更加精準(zhǔn)。目前，已有報(bào)道在轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻等作物幾個(gè)常見品系檢測(cè)中建立了雙重?cái)?shù)字PCR定量檢測(cè)方法［19-24］。

本研究在對(duì)雙重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系進(jìn)行系統(tǒng)地篩選、優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了基于油菜內(nèi)源PEP基因和轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系特異性序列的雙重?cái)?shù)字PCR精準(zhǔn)定量方法。對(duì)方法的特異性、可重復(fù)性、檢測(cè)靈敏度、定量準(zhǔn)確性、精確度等指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定和評(píng)估。結(jié)果表明，方法特異于轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系檢測(cè)，不同濃度模板各平行重復(fù)間的偏差均在可接受范圍內(nèi)，方法LOD低至2拷貝/μL，LOQ為10拷貝/μL MS11品系DNA，可對(duì)0.1%及以上含量的轉(zhuǎn)基因油菜MS11品系成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量，可以滿足口岸對(duì)轉(zhuǎn)基因成分LLP問題的應(yīng)對(duì)需求。

參考文獻(xiàn)：

［1］何 微，李 俊，王曉梅，等. 全球油菜產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)問題、對(duì)策［J］. 中國(guó)油脂，2022，47（2）：1-7.

［2］王漢中，殷 艷. 我國(guó)油料產(chǎn)業(yè)形勢(shì)分析與發(fā)展對(duì)策建議［J］. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2014，36（3）：414-421.

［3］張 冉，曹娟娟，濮 超，等. 中國(guó)油菜籽和菜籽油的生產(chǎn)、進(jìn)出口及供需分析［J］. 中國(guó)油脂，2022，47（6）：8-14，52.

［4］國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織. 2019年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)［J］. 中國(guó)生物工程雜志，2021，41（1）：114-119.

［5］ISAAA. 國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織網(wǎng)站［EB/OL］.［2023-07-01］. https：//www.isaaa.org/.

［6］黃耀輝，焦 悅，付仲文. 國(guó)際轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品低水平混雜政策對(duì)我國(guó)的啟示［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2021，23（9）：1-11.

［7］WHO. Codex Alimentarius Commission. Annex 3：food safety assessment in situations of low-level presence of recombinant- DNA plant material in food：CAC/GL 45-2003［R］. Geneva，2008.

［8］Oecd. Low-level presence of transgenic plants in seed and grain commodities：Environmental risk/safety assessment and availability and use of information［EB/OL］. （2016-04-05）［2023-07-01］. https：//www.oecd-ilibrary.org/environment/safety-assessment-of-transgenic-organisms-in-the-environment-volume-6/low-level-presence-of-transgenic-plants-in-seed-and-grain-commodities_9789264253421-4-en.

［9］ISAAA Inc. APHIS policy on low-level presence of GE material［EB/OL］. （2007-04-04）［2023-08-10］. https：//www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/article/default.asp？ID=1366.

［10］European Union. Questions and answers on the low level presence [JP3]（LLP） of GMOs in feed import［EB/OL］. （2011-06-24）［2023-07-01］. https：//ec.europa.eu/commission/presscorner/api/files/document/print/en/memo_11_451/MEMO_11_451_EN.pdf.

［11］斯能武，李 俊，武玉花，等. 數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)中的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2021，43（1）：40-50.

［12］國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局. 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：GB/T 19495.4—2018［S］. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2018.

［13］Zhu P Y，F(xiàn)u W，Wang C G，et al. Development and application of absolute quantitative detection by duplex chamber-based digital PCR of genetically modified maize events without pretreatment steps［J］. Analytica Chimica Acta，2016，916：60-66.

［14］Stila. Precision performance of crystal digital PCR vs. quantitative PCR ［EB/OL］. ［2023-07-01］. https：//www.stillatechnologies.com/digital-pcr/naica-system-analysis/precision-performance-of-crystal-digital-pcr-vs-quantitative-pcr/.

［15］Marco M，Cristian S，Chrystele C D，et al. Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing European network of GMO laboratories （ENGL）［EB/OL］. （2008-10-13）［2023-07-01］. https：//publications.jrc.ec.europa.eu/repository/bitstream/JRC49650/jrc49650%20-%20final%20version%20-%20%20min%20perf%20req.pdf.

［16］Vynck M，Vandesompele J，Thas O. Quality control of digital PCR assays and platforms［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2017，409（25）：5919-5931.

［17］Xu X L，Peng C，Wang X F，et al. Comparison of droplet digital PCR with quantitative real-time PCR for determination of zygosity in transgenic maize［J］. Transgenic Research，2016，25（6）：855-864.

［18］Zhao Y，Xia Q Y，Yin Y P，et al. Comparison of droplet digital PCR and quantitative PCR assays for quantitative detection of Xanthomonas citri subsp. citri［J］. PLoS One，2016，11（7）：e0159004. [HJ1.7mm]

［19］肖 芳，李 俊，王顥潛，等. 轉(zhuǎn)基因玉米NK603轉(zhuǎn)化體/zSSIIb內(nèi)標(biāo)基因二重微滴數(shù)字PCR方法的建立及應(yīng)用［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2021，54（22）：4728-4739.

［20］肖 芳，張秀杰，李 俊，等. 轉(zhuǎn)基因玉米MON87427/zSSIIb二重微滴數(shù)字PCR方法建立及應(yīng)用［J］. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2021，43（1）：90-98.

［21］Kppel R，Bucher T，Br D，et al. Validation of 13 duplex droplet digital PCR systems for quantitative GMO analysis of most prevalent GMO traits［J］. European Food Research and Technology，2018，244（2）：313-321.

［22］繆青梅，汪小福，陳笑蕓，等. 基于雙重微滴數(shù)字PCR精準(zhǔn)定量轉(zhuǎn)基因水稻G6H1的方法研究［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2019，27（1）：159-169.

［23］梁美丹，宋安華，張明明，等. 基于雙重微滴數(shù)字PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米Bt11品系定量檢測(cè)［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2020，28（3）：543-552.

［24］劉 曉，朱鵬宇，景小艷，等. 雙重?cái)?shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)中的應(yīng)用［J］. 生物技術(shù)進(jìn)展，2020，10（1）：60-66.

基金項(xiàng)目：上海市 “科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目（編號(hào)：21DZ2203000）；海關(guān)總署科研項(xiàng)目（編號(hào)：2021HK155）。

作者簡(jiǎn)介：錢昌元（1987—），男，江蘇南通人，博士，從事分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因分子檢測(cè)技術(shù)研究。E-mail：qiancynj@126.com。

通信作者：李 想，博士，研究員，從事分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因分子檢測(cè)技術(shù)研究。E-mail：idealne@163.com。