六倍體栽培小麥AP2/ERF基因家族的全基因組鑒定及表達分析

摘要：AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsivefactor）轉(zhuǎn)錄因子對小麥的生長發(fā)育及脅迫響應等生理過程有重要調(diào)控作用?；谠耘嘈←溔蚪M測序序列，通過生物信息學方法篩選并鑒定了437個TaAP2/ERF基因家族，進而分析這些基因家族的理化性質(zhì)、基因結構、系統(tǒng)進化、啟動子順式作用元件與轉(zhuǎn)錄表達特性等。結果表明，437個TaAP2/ERF家族基因主要定位于細胞核中，可分為AP2、DREB、ERF 3個亞家族，不同的亞家族之間的理化性質(zhì)及結構特性等均存在差異。TaAP2蛋白大部分呈堿性，TaDREB、TaERF蛋白大部分呈酸性，TaAP2、TaDREB全部為親水性蛋白，TaERF蛋白大部分為親水性蛋白，少部分為疏水性蛋白。大部分TaAP2亞家族基因內(nèi)含子數(shù)為3～9個，而大部分TaDREB、TaERF亞家族基因不含有內(nèi)含子，只有1個外顯子。TaAP2、TaDREB和TaERF都有典型的YRG、RAYD元件，TaDREB的保守性高于TaERF。TaAP2/ERF家族基因啟動子中包含較多CAAT-box、CGTCA-motif、DRE core、LTR等順式作用元件。小麥自身及與近緣物種間均存在較多共線性區(qū)段，且共線性區(qū)段較短，由5～15個基因組成。通過RNA-seq數(shù)據(jù)篩選了在小麥葉片、根、穗、莖等組織生長發(fā)育過程及在高溫、干旱、高溫-干旱復合脅迫等非生物脅迫應激反應中起重要作用的一些候選基因。研究結果為進一步探究六倍體栽培小麥AP2/ERF家族生物學功能提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：六倍體栽培小麥；AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子；全基因組鑒定；表達特性

中圖分類號：S512.103.2 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0058-11

AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive element binding factor，AP2/ERF）是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物的生長發(fā)育、生物及非生物逆境響應中起著重要作用，該家族的重要特點是至少包括由約60個氨基酸組成的AP2保守結構域［1］。根據(jù)AP2/ERF家族保守結構域的數(shù)目，結合基因功能，可將其分為AP2、DREB（dehydration responsive element binding protein）、ERF（ethylene-responsive factor）、RAV（related to ABI3/VP1）、Soloist共5個亞家族［2］。從保守結構域的數(shù)量來看，AP2亞家族成員包含2個AP2保守結構域，DREB、ERF亞家族成員均只包含1個AP2保守結構域，RAV亞家族成員則包含1個AP2保守結構域和1個B3 DNA結合基序，Soloist亞家族也只包括1個AP2 domain序列，但Soloist亞家族與AP2、DREB、ERF亞家族之間的遺傳分化程度較遠［3-7］。DREB、ERF亞家族雖然只包含1個AP2結構域，但其區(qū)別在于DREB亞家族的第14、19位氨基酸殘基分別為纈氨酸（V）、谷氨酸（E），而ERF亞家族的第14、19位氨基酸殘基分別為丙氨酸（A）、天冬氨酸（D）［7-8］。DREB、ERF亞家族保守結構域不同，其功能也存在一些差別。DREB亞家族成員在非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，可與脫水應答元件（dehydration respossive element，DRE）特異性結合，調(diào)控啟動子中含有DRE元件基因的表達，能從整體上提高植物的抗逆性，因而近年來受到廣泛關注［9-10］。ERF亞家族成員編碼與致病相關的蛋白，這些蛋白可以通過GCC box（AGCCGCC）特異性結合到順式作用元件上［11］。

本研究從六倍體栽培小麥基因組序列中篩選到437條AP2/ERF基因家族成員，包括65條AP2亞家族基因、69條DREB亞家族基因和303條ERF亞家族基因。為全面了解六倍體栽培小麥TaAP2/ERF基因家族的序列和結構特征，進一步對TaAP2/ERF基因家族序列進行理化性質(zhì)分析、系統(tǒng)進化樹的構建與分類、結構域預測及保守基序分析、啟動子順式作用元件鑒定、與近緣物種的共線性分析等，并基于六倍體栽培小麥的高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定并分析TaAP2/ERF基因家族在不同組織中的表達特性，以及在高溫、干旱及高溫-干旱復合脅迫、低溫等非生物逆境脅迫環(huán)境下的表達模式，以期為小麥TaAP2/ERF家族基因的抗逆性功能鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

在EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫（https：//plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index）中下載小麥基因組文件（Triticum aestivum.IWGSC.dna.toplevel.fa）、注釋文件（Triticum aestivum.IWGSC.46.gff3）、蛋白質(zhì)文件（Triticum aestivum.IWGSC.pep.all.fa）、編碼序列（CDS）文件（Triticum aestivum.IWGSC.cds.all.fa）、cDNA文件（Triticum aestivum.IWGSC.cdna.all.fa）。

1.2 六倍體栽培小麥AP2/ERF基因家族成員的鑒定

從PFAM數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）中下載AP2/ERF結構域（PF00847）和B3結構域（PF02362）的隱馬爾可夫模型文件，用HMMER 3.0程序在小麥基因組文件中篩選包含AP2/ERF、B3結構域的序列，篩選閾值為E值<1×10-10。通過NCBI-CDD網(wǎng)站服務器（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、SMART數(shù)據(jù)庫（http：//smart.embl-heidelberg.de/）及PFAM （http：//pfam.xfam.org/）數(shù)據(jù)庫對六倍體栽培小麥中預期的AP2/ERF基因家族進行進一步鑒定，去除不完整的序列。

1.3 六倍體栽培小麥AP2/ERF基因家族的理化性質(zhì)分析

通過ExPASy網(wǎng)站（https：//www.expasy.org/）分析AP2/ERF基因家族的組成及理化特性，計算等電點（pI）值、分子量（MW）和氨基酸數(shù)量。用蛋白親水性分析工具（http：//www.detaibio.com/sms2/protein_gravy.html）計算蛋白的親水特性和疏水特性。使用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞的定位預測。

1.4 六倍體栽培小麥AP2/ERF基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

用MEGA 7.0 （http：//www.megasoftware.net/）對六倍體栽培小麥的AP2/ERF結構域序列進行系統(tǒng)發(fā)育和進化分析，用iTOL v3在線服務器對進化樹進行修飾。

1.5 六倍體栽培小麥AP2/ERF基因家族序列的比對和保守基序分析

用ClustalX（版本2.1）進行多序列比對。使用MEME（本地版本），通過特定參數(shù)（-nostatus -maxsize 6000000 -mod anr -nmotifs 26 -minw 6 -maxw 100）預測AP2/ERF的保守基序，基序數(shù)量設置為26，最佳寬度為6～100個氨基酸。

1.6 六倍體栽培小麥AP2/ERF基因家族的順式作用元件分析

在TBtools軟件［12-13］中輸入下載的基因組及基因組注釋文件，提取TaAP2/ERF基因家族成員位于起始密碼子上游2 000 bp的序列作為基因的啟動子序列，用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析預測順式作用元件，并整理分析其規(guī)律、特性。

1.7 六倍體栽培小麥AP2/ERF基因家族的共線性及復制方式分析

通過TBtools軟件［12-13］在六倍體栽培小麥基因組內(nèi)對篩選到的437個TaAP2/ERF基因家族成員進行共線性分析。在二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、玉米（Zea mays）、大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、谷子（Setaria italica）等6個小麥近緣物種中鑒定AP2/ERF基因家族成員，對六倍體栽培小麥中的TaAP2/ERF基因家族成員與近緣物種進行共線性分析。使用McScan［14］（jcvi工具包）進行TaAP2/ERF基因串聯(lián)重復分析。

1.8 小麥AP2/ERF基因家族的組織特異性及抗逆性表達分析

在小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（http：//www.wheat-expression.com/）中下載小麥葉片、根、莖、穗等組織中的全部基因的轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)，在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載SRP045409［15］、SRP043554［16］、SRP041017、DRP000768在高溫、干旱、高溫-干旱復合作用、低溫等非生物脅迫下的高通量轉(zhuǎn)錄表達數(shù)據(jù)，進行小麥AP2/ERF基因家族的表達特性分析。

2 結果與分析

2.1 六倍體栽培小麥中AP2/ERF基因家族的全基因組鑒定

六倍體栽培小麥基因組大小為14 066.3 bp，基因總數(shù)為107 545個。在六倍體栽培小麥中鑒定出437個不同的AP2/ERF家族成員，包含65個AP2、69個DREB、303個ERF亞家族成員，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因占全基因組總基因數(shù)的0.41%，AP2/ERF基因家族在基因組中的分布密度為 0.031個/Mb（圖1）。其中，在六倍體栽培小麥AA和BB、DD亞基因組中分別鑒定到139、148、150個AP2/ERF基因。從TaAP2/ERF基因在染色體上的分布情況可以看出，437條TaAP2/ERF基因在21條染色體上呈現(xiàn)不均勻的分布特點，且TaAP2/ERF基因家族在不同染色體上的發(fā)生數(shù)量與基因組大小成正比，另外在Chr6A、Chr6B、Chr6D等染色體中可以發(fā)現(xiàn)大部分TaAP2/ERF基因存在成簇聚集的現(xiàn)象。

2.2 六倍體栽培小麥中AP2/ERF基因家族的理化性質(zhì)分析

六倍體栽培小麥AP2/ERF蛋白的編碼序列（CDS）長度、蛋白質(zhì)分子量（MW）和等電點（PI）差異較大，呈現(xiàn)多態(tài)性。TaAP2/ERF蛋白的氨基酸殘基大小為119～1 401 aa，等電點為4.12～12.2，分子量為12.6～155.8 ku。TaAP2、TaDREB、TaERF既含有堿性蛋白也含有酸性蛋白，亞家族的等電點分別為5.03～10.50、4.40～11.21、4.12～12.20，TaAP2蛋白大部分（61.5%）為堿性，TaDREB、TaERF蛋白大部分（82.6%、53.1%）為酸性。TaAP2、TaDREB、TaERF亞家族蛋白的疏水性區(qū)間分別為-0.854～-0.389、-0.983～-0.186、-1.116～0.191，因此推測TaAP2、TaDREB全部為親水性蛋白。在TaERF蛋白中，除TraesCS5D02G317000.1、TraesCS2B02G448100.1、TraesCS2D02G425700.1、TraesCS5A02G310500.1、TraesCS5B02G310800.1、TraesCS5D02G317100.1、TraesCS5A02G310100.1為疏水性蛋白（0.018～0.191）外，其余全部為親水性蛋白（-1.116～-0.049）。

亞細胞定位預測結果表明，大多數(shù)TaAP2/ERF蛋白（83.08% TaAP2、84.06% TaDREB、74.26% TaERF）位于細胞核內(nèi)，其余少部分位于葉綠體、線粒體等細胞器中。

2.3 六倍體栽培小麥中AP2/ERF基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用鄰接（NJ）方法構建基于六倍體栽培小麥AP2/ERF結構域比對的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），研究AP2/ERF超家族中AP2、DREB和ERF這3個亞家族基因之間的系統(tǒng)發(fā)育關系。結果顯示，437條TaAP2/ERF基因家族蛋白被分至13個分支中，65個AP2亞家族基因被聚類到分組Ⅰ中，與DREB、ERF之間的界限分明； DREB與ERF亞家族基因序列間的相似度較高，但又存在差異，它們被聚類至6個分組中，DREB被聚類至分組Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅻ中，ERF被聚類至分組Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅷ中，DREB與ERF分組相間分布。其中DREB亞家族的6個分組（Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅻ）中分別含有13、4、32、4、10、6個基因成員，ERF亞家族的6個分組（Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ、ⅩⅢ）中分別含有38、8、17、11、20、209個基因成員。

2.4 六倍體栽培小麥中AP2/ERF基因家族的基因結構分析

對TaAP2/ERF基因結構和蛋白保守基序進行分析，結果表明，不同基因亞家族之間的基因結構存在較大差異。在65個TaAP2亞家族基因中，除5個基因（TraesCS6B02G158500.1、TraesCS6B02G158900.1、TraesCS6D02G120100.1、TraesCS6B02G158800.1、TraesCS6D02G120200.1）不包含內(nèi)含子外，其余基因的內(nèi)含子數(shù)量為3～9個。在69個TaDREB亞家族基因中，除8個基因包括1～15個內(nèi)含子外，其他基因均沒有內(nèi)含子，只有1個外顯子。在303個TaERF亞家族中，大部分（78.5%）基因不包含內(nèi)含子，只有1個外顯子，且在少部分包含內(nèi)含子的基因中，除TraesCS1D02G242800.1包含8個內(nèi)含子外，其他基因均只含有1～2個內(nèi)含子。

2.5 六倍體栽培小麥中AP2/ERF基因家族的蛋白質(zhì)結構域分析

分別對TaAP2、TaDREB、TaERF亞家族的蛋白保守結構域的氨基酸殘基進行比對，結果（圖3）表明，3個亞組蛋白結構域的氨基酸序列相似性分別為57.57%、72.55%、51.15%，其氨基酸殘基數(shù)分別為93～116、47～53、45～59 aa。多序列比對分析結果顯示，TaAP2亞家族成員分別包含2個YRG保守元件（β-sheet-1）和2個RAYD保守元件（β-sheet-3、α-螺旋），其中7個氨基酸殘基AA（x）3D（x）2A（x）17G（x）3A（x）13G完全保守。與 TaAP2亞家族基因不同，TaDREB、TaERF亞家族中分別含有1個YRG保守元件、1個RAYD保守元件（β-sheet-3、α-螺旋），并且YRG保守元件不僅包括 β-sheet-1， 還包括由保守的EIR氨基酸殘基組成的β-sheet-2。TaDREB、TaERF的特征氨基酸均滿足其蛋白序列特征，TaDREB保守結構域第14位是完全保守的纈氨酸（V），第19位是高度保守的谷氨酸（E）。TaERF的第14、19位氨基酸分別是丙氨酸（A）、天冬氨酸（D），但保守性不太高。TaDREB中有18個完全保守的氨基酸殘基GVR（x）R（x）3G（x）WV（x）E（x）R（x）7R（x）WLG（x）7AA（x）A（x）D（x）A，TaERF中有4個完全保守的氨基酸殘基G（x）7AA（x）3D，整體上看，TaDREB的保守性高于TaERF。

2.6 六倍體栽培小麥中AP2/ERF基因家族啟動子的順式作用元件分析

對TaAP2/ERF基因家族啟動子的順式作用元件進行整理歸類，由圖4可以看出，在TaAP2/ERF基因家族中共有108種順式作用元件，TaAP2、TaDREB、TaERF這3個不同亞家族啟動子中含有108種順式作用元件的基因數(shù)量之間總體呈兩兩顯著正相關關系（Pearson系數(shù)=0.82～0.98）。大部分（50.77%～98.55%）TaAP2、TaDREB、TaERF亞家族基因啟動子中均包含AAGAA-motif、A-box、ABRE、ABRE3a、ABRE4、ARE、as-1、AT～TATA-box、CAAT-box、CAT-box、CCAAT-box、[JP3]CCGTCC motif、CCGTCC-box、CGTCA-motif、DRE core、G-Box、GC-motif、LTR、MBS、MYB recognition site、Myb-binding site、MYB-like sequence、O2-site、Sp1、STRE、TATA-box、TGACG-motif、TGA-element、W box、WRE3等30個順式作用元件。

2.7 六倍體栽培小麥及近緣物種中AP2/ERF基因家族的共線性及復制分析

通過物種內(nèi)共線性分析方法鑒定六倍體栽培小麥內(nèi)TaAP2/ERF同源基因之間的分布及排列關系（圖5）。在六倍體栽培小麥1-7A、1-7B、1-7D共21個染色體的437個TaAP2/ERF基因家族成員中，61 841個同源基因?qū)Υ嬖诠簿€性，其中TaAP2/ERF基因在A、B、D亞基因組間兩兩共線性對數(shù)較高，具體如下：染色體1A與1B的共線性對數(shù)為 2 471 對，1A與1D為2 634對，1B與1D為2 678對，2A與2B為3 252對，2A與2D為3 547對，2B與2D為3 544對，3A與3B為3 024對，3A與3D為3 187對，3B與3D為3 294；4A與4B為1 958對，4A與4D為2 053對，4B與4D為2 357；5A與5B為2 917對，5A與5D為3 057對，5B與5D為 3 407；6A與6B為2 290對，6A與6D為2 347對，6B與6D為2 376；7A與7B為2 532對，7A與7D為3 050對，7B與7D為2 703對。61 841個同源基因?qū)M成了144個共線性區(qū)域，每個共線性區(qū)域包含6～1 167對同源基因。進一步在ABD亞基因組中分別篩選得到95個TaAP2/ERF基因在亞基因組間呈1 ∶1 ∶1對應的同源關系。

通過分析TaAP2/ERF基因的復制方式，發(fā)現(xiàn)437個TaAP2/ERF基因，共發(fā)生了2 087個串聯(lián)復制事件，其中產(chǎn)生每個串聯(lián)復制基因簇的基因數(shù)量為2～17個，最常見的是包含2個基因的基因簇。串聯(lián)重復發(fā)生事件數(shù)與染色體長度間具有顯著相關性（Pearson相關系數(shù)=0.76）。

本研究進一步構建了六倍體栽培小麥與近緣物種的共線性圖譜，比較分析了AP2/ERF基因家族成員在六倍體栽培小麥及近緣物種中的進化特性（圖6）。在二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、玉米（Zea mays）、大麥（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、谷子（Setaria italica）中分別有367、238、286、69、173、116個AP2/ERF基因與TaAP2/ERF基因同源，與六倍體栽培小麥分別有54、38、34、11、26、19個共線性區(qū)塊，每個共線性區(qū)域分別由6～9、6～7、6～15、6～8、5～8、5～6個基因組成。六倍體栽培小麥的近緣物種二穗短柄草、玉米、大麥、水稻、高粱、谷子的AP2/ERF基因保守結構域的序列同源性分別為53.67%、48.16%、53.68%、53.76%、55.13%、56.83%。

2.8 六倍體栽培小麥中AP2/ERF基因家族的表達特性分析

在六倍體栽培小麥中，大部分AP2、DREB、ERF亞家族基因主要參與生物學過程，少部分參與細胞定位，行使分子功能（圖7）。

在小麥組織葉片、根、穗、莖中，437個TaAP2/ERF基因家族的基因轉(zhuǎn)錄豐度呈正相關（Person相關系數(shù)>0.55），其中在穗、莖中的轉(zhuǎn)錄豐度呈高度正相關（Pearson相關系數(shù)=0.92）（圖8）。TraesCS5D02G223700.1、TraesCS5A02G215900.1、TraesCS5B02G214400.1、TraesCS7D02G158500.1、TraesCS7A02G158000.1、TraesCS7B02G062200.1、TraesCS3A02G328000.1、TraesCS6D02G281200.1、TraesCS2D02G425700.1、TraesCS6B02G331000.1、TraesCS6A02G301900.1、TraesCS4B02G299700.1等12個AP2/ERF基因家族的基因在葉片、根、穗、莖中的相對表達量均較高，相對表達量分別為 30.07～100.92、18.89～68.59、41.39～119.39、20.72～99.67、18.59～67.57、14.69～65.69、38.86～62.47、21.65～68.81、36.44～63.32、23.10～65.16、28.57～65.93、24.51～69.38。

溫-干旱復合脅迫處理，發(fā)現(xiàn)不同基因應對高溫、干旱及高溫-干旱復合脅迫的反應不同（圖9）。TraesCS5B02G193200.1[JP3]未處理組的相對表達量較高（TPM=18.88），在干旱脅迫處理1、6 h，高溫脅迫處理1、6 h，高溫-干旱復合脅迫過程中處理1、6 h，其相對表達量均持續(xù)上調(diào)，分別是未處理組的2.57、[JP3]3.18、1.23、3.56、1.36、4.76倍。TraesCS7A02G057800.1、TraesCS7D02G469200.1、TraesCS7D02G158500.1、TraesCS7B02G062200.1等4個基因在干旱脅迫處理1～6 h的過程中，基因分別表達上調(diào)4.40、3.61、3.80、4.37倍。TraesCS6A02G301900.1、TraesCS6D02G281200.1、TraesCS1B02G235100.1等3個基因在高溫、高溫-干旱復合脅迫處理1、6 h 的過程中，均持續(xù)上調(diào)表達，相對表達量是未處理的2.92～12.54倍。

取在正常溫度（萌發(fā)后在23 ℃生長4周）、低溫脅迫（在23 ℃生長2周后在4 ℃生長2周）下生長的三葉期小麥葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)TraesCS5B02G214400.1、TraesCS5A02G473800.1、TraesCS6B02G334700.1、TraesCS5A02G215900.1、TraesCS7A02G158000.1、TraesCS7D02G127600.1、TraesCS5D02G223700.1、TraesCS5B02G312000.1、TraesCS2D02G515800.1等9個基因在4 ℃生長條件下的相對表達量分別是23 ℃生長條件的3.65、2.23、2.43、3.88、5.20、3.47、5.65、12.17、7.87倍。

3 結論與討論

AP2/ERF超家族轉(zhuǎn)錄因子是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在多種不同植物中基于全基因組及EST序列進行了鑒定，如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中分別鑒定了18、122、6、1個AP2、ERF、RAV、Soloist亞家族基因［17］；在高粱（Sorghum bicolor）中分別鑒定了16、105、4、1個AP2、ERF、RAV、Soloist亞家族基因［18］；在苦蕎麥［Fagopyrum tataricum （L.） Gaertn.］中分別鑒定了15、116、3個AP2、ERF、RAV亞家族基因［19］。通過進行功能研究發(fā)現(xiàn)，它們在植物生長發(fā)育和對各種逆境的響應中發(fā)揮著重要作用。

不同研究者對小麥TaAP2/ERF家族進行了分析，如基于六倍體栽培小麥EST數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)117個AP2/ERF家族成員［20］，基于小麥全基因組序列鑒定出74個AP2/ERF家族基因等［21］。但是，由于六倍體栽培小麥的基因組較大，隨著高通量測序技術的發(fā)展，所測基因組框架圖越來越精細，可能有更多TaAP2/ERF家族基因被發(fā)現(xiàn)。因此，筆者重新在最近測序得到的六倍體栽培小麥全基因組序列中進行了篩選，鑒定出437個TaAP2/ERF家族候選基因。根據(jù)AP2結構域數(shù)量及結構特征，將本研究鑒定到的437個TaAP2/ERF家族基因分為AP2、DREB、ERF 3個亞家族，不同亞家族之間既有較為保守的相似基序，也有各自獨特的基序，AP2與部分ERF亞家族系統(tǒng)的分支距離較遠，另一部分ERF、DREB亞家族位于二者之間且呈帶狀相間排列，表明TaAP2/ERF各亞家族成員基因功能在進化過程中，既存在同一性又存在功能分化差異。

本研究通過序列比對分析，發(fā)現(xiàn)TaAP2、TaDREB和TaERF都有典型的由19～22、18個氨基酸組成的YRG、RAYD元件，與前人的研究結果相似。前人研究發(fā)現(xiàn)，DREB在第14、19位的保守氨基酸V、E在DNA結合中起著至關重要的作用，用A、D取代會降低其DNA結合活性、特異性，并且由于第14位氨基酸殘基V比19位氨基酸殘基E在決定DREB轉(zhuǎn)錄因子、DRE順式作用元件的DNA結合特異性方面具有重要性，無論第19個殘基是什么，第14位氨基酸殘基為V的保守結構域都將被歸類為DREB［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，TaDREB的第14位氨基酸殘基V完全保守，第19位氨基酸殘基E高度保守；TaERF的第14、19位氨基酸殘基A、D的保守性較低。除此之外，在TaAP2、TaDREB、TaERF亞家族中還有一些完全保守的氨基酸殘基，可能同樣在進化過程中起重要作用。

本研究篩選到的437條TaAP2/ERF基因染色體上呈不均勻分布特點，在部分染色體上成簇聚集。由于在六倍體栽培小麥基因組中存在A、B、D這3個亞基因組，不可避免會出現(xiàn)大量的基因序列重復事件，串聯(lián)重復導致基因家族成員擴張是引起基因家族成員在染色體上分布不均勻的重要原因之一。本研究在六倍體栽培小麥的21個染色體中發(fā)現(xiàn)了2 087個串聯(lián)復制事件，其中最為常見的是包含2個基因的基因簇，且串聯(lián)重復發(fā)生事件數(shù)與染色體長度具有顯著相關性。進一步在ABD亞基因組中分別篩選得到95個TaAP2/ERF基因在亞基因組間呈1 ∶1 ∶1對應的同源關系，可作為單拷貝基因用于輔助比較3個亞基因組進化過程中的功能。

不同物種的同源基因可能在功能上是保守的，本研究在二穗短柄草、玉米、大麥、水稻、高粱、谷子中分別鑒定了367、238、286、69、173、116個AP2/ERF家族基因，并且均與六倍體栽培小麥存在共線性，種間基因同源性分析表明，同源性最低的是玉米。由于共線性片段長短與物種間分化時間具有相關性，如果物種間分化時間較長易于變異而導致共有的特征變少，獲得較短的共線性片段，本研究發(fā)現(xiàn)，小麥及近緣物種間共線性區(qū)段由5～15個基因組成，推測它們經(jīng)歷了較長時間的分化。

AP2、DREB及ERF亞家族轉(zhuǎn)錄因子在植物葉片形態(tài)［22］、葉片表皮細胞的識別［23］、小穗分生組織的確定［24］等生長發(fā)育過程中具有重要功能，在生物和非生物脅迫反應［25-27］及代謝調(diào)節(jié)［28-30］中也發(fā)揮關鍵作用。本研究通過RNA-seq數(shù)據(jù)揭示了TaAP2/ERF基因家族在六倍體栽培小麥生長發(fā)育及非生物脅迫應激反應中起重要作用，其中437個TaAP2/ERF家族基因在小麥葉片、根、穗、莖等組織中的轉(zhuǎn)錄豐度呈正相關，其中穗、莖中TaAP2/ERF家族基因轉(zhuǎn)錄豐度的相關性最高，并在葉片、根、穗、莖中篩選得到12個轉(zhuǎn)錄豐度均較高的AP2/ERF基因家族基因。不同的TaAP2/ERF家族基因在高溫、干旱、高溫-干旱復合脅迫處理中具有不同的表達量，表明不同基因的功能是非冗余的。通過篩選發(fā)現(xiàn)TraesCS5B02G193200.1在干旱、高溫、高溫-干旱復合脅迫過程中，均持續(xù)上調(diào)表達，推測其對干旱及高溫均有較好的應激反應；TraesCS7A02G057800.1等4個基因、TraesCS6A02G301900.1等3個基因、TraesCS5B02G214400.1等9個基因分別在干旱、高溫及高溫-干旱復合脅迫、低溫處理中，有較好的應激反應。這些可以通過進一步驗證以用于改良六倍體栽培小麥在極端天氣中的耐高溫、干旱、低溫特性。

綜上所述，本研究結果為理解六倍體栽培小麥AP2/ERF基因家族的分子機制和進化提供了理論依據(jù)。

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基金項目：國家小麥產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（編號：CARS-3）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系小麥創(chuàng)新團隊項目（編號：SDAIT-01）。

作者簡介：[JP3]張 新（1974—），男，山東聊城人，碩士，高級農(nóng)藝師，主要從事作物遺傳育種與栽培研究。E-mail：13606355680@139.com。

通信作者：李敏敏，博士，高級農(nóng)藝師，主要從事作物遺傳育種與栽培研究。E-mail：liminmin527@163.com。