西洋杜鵑葉斑病病原菌分離鑒定及生物學特性分析和防控藥劑篩選

摘要：為明確云南省昆明市西洋杜鵑葉斑病病原菌的分類地位、生物學特性及其有效防控藥劑，以西洋杜鵑葉斑病病葉為試驗材料，采用組織分離法分離病原菌，通過柯赫氏法則驗證其致病性，聯(lián)合形態(tài)學與多基因序列（ITS、TEF-1、TUB2）分析鑒定病原菌種類，并對其主要生物學特性進行測定。采用菌絲生長速率法分析5種藥劑對病原菌的抑制效果。結果表明，從云南省西洋杜鵑葉斑病病葉組織中分離得到1種致病菌，將其回接到健康植株上，接種后的葉片病癥較為明顯，葉片生成黃褐色病斑，嚴重時脫落，與田間癥狀一致。結合形態(tài)學特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結果將其鑒定為棒孢新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）。該病原菌菌絲體生長的最適溫度為25 ℃，最適pH值為7，甘露醇和蛋白胨分別為其最適碳源、氮源；在供試的5種化學藥劑中，苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果較好，EC50為 0.020 0 mg/mL。

關鍵詞：杜鵑；葉斑??；病原鑒定；生物學特性；殺菌劑

中圖分類號：S436.8 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0155-06

杜鵑（Rhododendron simsii）是中國十大傳統(tǒng)名花之一，又稱映山紅、滿山紅和山石榴等，為杜鵑花科杜鵑屬植物，約有1 000種，多數(shù)種集中在亞洲。我國既是杜鵑花的重要發(fā)源地，也是世界杜鵑花分布中心，其中以云南、四川、貴州和西藏為主要分布區(qū)［1］。杜鵑擁有很高的價值：（1）藥用價值。杜鵑全株供藥用，可治療咳嗽多痰、慢性支氣管炎、高血壓、冠心病等疾?。?］。（2）觀賞價值。杜鵑枝繁葉茂，花色艷麗，花期長，根樁奇特，是優(yōu)良的盆景材料和綠化植物；萌發(fā)力強，耐修剪，可作為矮墻或屏障，是花籬的良好材料。（3）經濟價值。杜鵑葉、花可入藥或提取芳香油，皮、葉可提制烤膠。（4）生態(tài)價值。高山杜鵑根系發(fā)達，是很好的水土保持植物。

云南省擁有豐富的杜鵑資源，是我國重要的杜鵑花資源集中地和主產區(qū)，其品種占全國品種的一半以上，其資源利用及產業(yè)化已形成一定規(guī)模［2］。目前國內關于杜鵑的研究較多，但大多是關于植物育種繁殖、資源調查或者脅迫方面。近年來，由于人類活動和環(huán)境氣候變化等原因，杜鵑病害加劇泛濫，新的致病菌不斷被報道出，從致病部位角度看，主要集中在葉片病害、根部病害、莖及枝干病害等。關于杜鵑病害研究報道較多的是枯梢病、莖腐病、根腐病等危害植株根或枝干的病害，以及炭疽病、葉斑病、葉腫病等感染杜鵑花葉片致病的病害［2-8］。本研究主要針對西洋杜鵑楊梅紅葉斑病，通過鑒定病害病原，并對其生物學特性進行測定，研究病原菌的最適生長條件；通過研究5種常用殺菌劑的防治效果，為治理西洋杜鵑楊梅紅葉斑病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物：感病西洋杜鵑楊梅紅葉斑病病葉于2022年8月23日采自西南林業(yè)大學白龍校區(qū)（25°00′N，102°44′E），病株表現(xiàn)為部分葉片出現(xiàn)不同程度的紅褐色病斑，嚴重時葉片掉落、枝葉干枯（圖1-a）。

供試藥品：10%腈菌唑可濕性粉劑，25%多菌靈可濕性粉劑，80%代森錳鋅可濕性粉劑，45%石硫合劑結晶粉，10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑，均購自北京中保綠農科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化

使用組織分離法，將病葉消毒晾干，從葉片病健交界處獲取5 mm×5 mm左右的組織，接種到PDA平板中，倒置在28 ℃的培養(yǎng)箱內，3 d后挑取病葉附近的菌絲純化，純化3～5次后獲得6株純菌株。

1.2.2 病原菌致病性測定

離體回接：采取同植株健康無病、生長良好的葉片，表面消毒后晾干備用。用5 mm打孔器取培養(yǎng)7 d 的菌餅，菌絲面直接覆蓋于用滅菌針刺破的葉片傷口處，放置于保濕培養(yǎng)皿，以無菌PDA為空白對照。觀察記錄接種情況，7 d 后用組織分離法從發(fā)病的葉片分離病原菌，得到病原菌DJ-2。

活體回接：將分離純化得到的病原菌打取6個菌餅（直徑d=5.0 mm），接種于150 mL PDB溶液中，放置于轉速180 r/min、溫度28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱搖培7 d。將制備好的菌液均勻噴灑在健康植株葉片上，覆上黑色塑料膜避光保濕，用PDB溶液作對照處理。

1.2.3 病原菌鑒定

形態(tài)鑒定：采用玻片培養(yǎng)法對純化得到的菌株進行培養(yǎng)觀察，將察氏培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，厚度約為1 mm，用解剖刀在凝固好的培養(yǎng)基劃1.5 cm×1.5 cm的方塊，并放置在載玻片上，挑取病原菌菌絲接種在方塊邊緣，蓋上蓋玻片，放置在保濕培養(yǎng)皿中。28 ℃培養(yǎng)4～7 d，長出菌絲后，在顯微鏡下觀察并拍照記錄分生孢子形態(tài)、大小和著生方式等特征。將觀察結果與已報道的病原菌進行比較，并進行形態(tài)學鑒定。

分子生物學鑒定：采用真菌DNA抽提試劑盒提取病菌DNA，以真菌總DNA為模板擴增ITS、TUB2和TEF-1基因序列，所用引物見表1。ITS擴增體系：12.5 μL MIX，9.5 μL雙蒸水，1 μL ITS1，1 μL ITS4，1 μL DNA。反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。其他引物擴增體系：15 μL MIX，12 μL雙蒸水，正反引物各 1 μL，1.2 μL DNA。反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性 40 s，52 ℃或55 ℃退火45 s（退火溫度視情況而定），72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；最后72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存［9］。把擴增后的序列送至北京擎科生物科技股份有限公司測序，獲得的測序結果在NCBI官網進行BLAST比對，并參考文獻篩選出相關菌株序列。用MEGA7的最大似然法（maximum-likelihood，ML），設置Bootstrap值為 1 000，進行Bootstrap校驗，構建真菌系統(tǒng)發(fā)育樹，確定病原菌種類。

1.2.4 生物學特性

溫度篩選試驗：設置5、15、25、35、45 ℃共5個溫度，用打孔器在菌落邊緣打取直徑為 5 mm 的菌餅，將其置于新的PDA平板中央，倒置在25 ℃培養(yǎng)箱下恒溫培養(yǎng)［10］。每處理設3次重復，分別在培養(yǎng)5、7 d時，采用十字交叉法測得菌落直徑并計算菌絲平均生長速率。菌絲平均生長速率=（培養(yǎng)7 d菌落直徑平均值-培養(yǎng)5 d菌落直徑平均值）/2。

pH值篩選試驗：用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH對PDA培養(yǎng)基pH值進行調整，設置4、5、6、7、8、9、10共7個pH值梯度。每處理設3次重復，培養(yǎng)及測量數(shù)據(jù)方法同上。

碳源篩選試驗：將察氏培養(yǎng)基中的蔗糖分別用等質量的葡萄糖、麥芽糖、D-木糖、可溶性淀粉和甘露醇進行替換，制成不同的碳源培養(yǎng)基。每個處理設3次重復，以不加碳源的察氏培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)及測量數(shù)據(jù)方法同上。

氮源篩選試驗：在不加氮源的察氏培養(yǎng)基中分別加入硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨和氯化銨各20 g，制成不同的氮源培養(yǎng)基。每個處理設3次重復，以不加氮源的察氏培養(yǎng)基為對照，培養(yǎng)及測量數(shù)據(jù)方法同上。

1.2.5 藥劑篩選

采用菌絲生長速率法測定病原菌對5種供試殺菌劑的敏感性，將苯醚甲環(huán)唑、石硫合劑、多菌靈、腈菌唑和代森錳鋅分別設置1 000、1 500、2 000、2 500、5 000倍液5個濃度梯度（有效濃度見表2），制成含藥平板，含藥體積比1 ∶10。以無菌水為對照，每個濃度梯度重復3次，25 ℃倒置暗培養(yǎng)7 d。采用十字交叉法測定菌落生長直徑，記錄數(shù)據(jù)并計算不同濃度梯度下殺菌劑的抑菌率［23］。以防治藥劑濃度的對數(shù)值為橫坐標，抑制率的生物統(tǒng)計概率值為縱坐標，繪制毒力回歸方程，并計算有效中濃度（EC50），比較不同防治藥劑的相對抑制效果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應用Duncans新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 致病性測定

在離體回接中，將從西洋杜鵑楊梅紅葉斑病病葉樣品上分離得到的6株純菌株，回接到健康植株葉片上發(fā)現(xiàn)，DJ-2菌株接種5～7 d開始顯示病癥，回接后的葉片開始出現(xiàn)褐色病斑，從傷口處向外擴增直至蔓延整個葉片（圖1-c），與采集的病癥一致。在活體回接中，西洋杜鵑楊梅紅在接種5～7 d 后開始出現(xiàn)癥狀，葉片出現(xiàn)褐色病斑，開始萎縮（圖1-e）。接種10 d左右，葉片出現(xiàn)干枯死亡脫落的現(xiàn)象（圖1-f）。

2.2 病原菌鑒定

形態(tài)鑒定：菌絲白色，菌落圓形具輪紋，逐層向外生長。氣生菌絲濃密呈絮狀，白色至灰白色，背面淡黃色。分生孢子長梭形，分生孢子有4個橫隔5個細胞，中間3個細胞顏色較深，為褐色，兩端細胞均為透明三角［10］。

分子鑒定：利用ITS、TEF-1、TUB2引物擴增病原菌DJ-2的rDNA-ITS區(qū)間、TEF-1區(qū)間和TUB2區(qū)間序列，測序后分別獲得 560、469、934 bp 的基因片段。在NCBI的GenBank進行BLAST比對，病原菌DJ-2與已知模式屬的最大相似性達到了99%，說明新分離菌株的科學分類地位比較明確。選用同源性較高的菌株序列作為參比對象，利用MEGA 7的鄰接法（NJ）合并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果表明，DJ-2與棒孢新擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）聚集在同一分支上（圖3）?；谛螒B(tài)鑒定與多基因系統(tǒng)學分析結果，進一步證實了病原菌DJ-2為棒孢新擬盤多毛孢，并將DJ-2序列上傳NCBI，獲得登錄號OR086090、OR257737、OR257736。

2.3 病原菌的生物學特性

菌株DJ-2的適宜生長溫度范圍為5～35 ℃，在低溫5 ℃條件下生長緩慢，高溫35～45 ℃幾乎不能生長，在25 ℃條件下菌絲生長最快，培養(yǎng)7 d菌落直徑為5.822 cm，菌絲平均生長速率為1.003 cm/d（圖4-a）。

菌株DJ-2的適宜生長pH值范圍為4～10，其中pH值為7時菌絲生長較快，在pH值為7條件下培養(yǎng)7 d時菌落直徑為7.050 cm，菌絲平均生長速率為0.735 cm/d；其次pH值為5時菌落直徑較大，為6.707 cm，菌絲平均生長速率為1.195 cm/d（圖4-b）。通過觀察發(fā)現(xiàn)，pH值為5時與pH值為7時相比，前3 d生長緩慢，培養(yǎng)5 d后菌絲生長速率較快，但是菌絲生長較為稀薄；而在pH值為7時菌落前后期生長速率趨于穩(wěn)定。

以不加氮源的察氏培養(yǎng)基為對照，在供試5種氮源中，菌株DJ-2對蛋白胨的利用效果最好，培養(yǎng)7 d時菌落直徑為8.206 cm，菌絲平均生長速率為0.960 cm/d；該菌株對其他種類氮源的利用效果無顯著差異（圖4-c）。

以不加碳源的察氏培養(yǎng)基為對照，在供試5種碳源中，菌株DJ-2對甘露醇的利用效果較好，對葡萄糖和D-木糖的利用效果較差。培養(yǎng)7 d后，對照和甘露醇處理的菌株DJ-2菌落直徑相差不大，但是對照處理下的菌株DJ-2生長稀疏，菌絲稀薄。整體而言，菌株對甘露醇的利用效果較好，培養(yǎng)7 d后菌落直徑為5.662 cm，菌絲平均生長速率為1.280 cm/d（圖4-d）。

2.4 病原菌的藥劑室內篩選

采用生長速率法測定5種供試殺菌劑對病原菌的室內毒力，結果表明，DJ-2在不同濃度含藥平板上均能生長，但與對照組相比，菌絲生長緩慢，且抑制率與殺菌劑濃度呈正相關，表明5種供試殺菌劑對其菌絲的生長均有較好的抑制效果。通過對數(shù)據(jù)進行擬合，得到5種殺菌劑的毒力回歸方程（表3）。其中苯醚甲環(huán)唑對病原菌生長的抑制效果最好，EC50值為0.0 200 mg/mL，腈菌唑和多菌靈次之。由EC50可知，病原菌對5種殺菌劑的敏感性依次為苯醚甲環(huán)唑＞腈菌唑＞多菌靈＞石硫合劑＞代森錳鋅。

3 討論

呈褐色的小斑點，后逐漸擴展呈不規(guī)則狀，病斑顏色逐漸呈暗褐色，蔓延到整個植株。致病菌能在植株內潛伏過冬，在第2年成為分生孢子，借助雨水或者風力傳播，在溫度過高和過濕的環(huán)境下會增加發(fā)病概率。本研究結合形態(tài)學特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結果將云南省昆明市西洋杜鵑楊梅紅葉斑病的病原菌鑒定為棒孢新擬盤多毛孢（N. clavispora）。2023年，寸海春等在研究高山杜鵑褐斑病時發(fā)現(xiàn)了該病原菌［10］。除此之外，該病原菌還可以引起香龍血樹、紅豆杉、月季、鐵皮石斛、黑老虎、芒果和草莓的葉斑病，藍莓、小翠云枯稍病，紅掌枯萎?。?1-20］。

本研究對西洋杜鵑楊梅紅葉斑病病原菌的生物學特性進行了測定，該病原菌菌絲體在5～35 ℃范圍內都能生長，其中最適溫度為25 ℃；另外該病原菌最適pH值為7，之后下降趨于穩(wěn)定，說明病原菌適宜在偏酸性培養(yǎng)基中生長，這與薛德勝等的研究結果［21］基本一致。而本研究最適碳源研究結果與薛德勝等的研究結果［21］存在一定出入，說明引起不同植物的棒孢新擬盤多毛孢最適生長條件存在差異。因此，明確病原菌的生物學特性是研究其所致病害的發(fā)生規(guī)律、流行動態(tài)以及綜合防治的基礎。結合本研究病原菌的最適生長條件，在進行西洋杜鵑楊梅紅種植時應該避免高溫高濕這種有利于病原菌生長的環(huán)境，防止病害發(fā)生。

目前杜鵑葉斑病的防治措施主要集中在化學防治和園藝措施。在近幾年的研究中，證實唑醚·代森聯(lián)、苯醚甲環(huán)唑、福美雙、苯甲·丙環(huán)唑和二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲對棒孢新擬盤多毛孢均具有一定的抑制效果［22-23］。本研究選擇了5種常用化學藥劑進行毒力測定，結果表明，10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和10%腈菌唑可濕性粉劑的抑菌作用較為突出，對病原菌的EC50分別為0.020 0 mg/mL和0.021 7 mg/mL。其中效果最明顯的是苯醚甲環(huán)唑，表明苯醚甲環(huán)唑對于棒孢新擬盤多毛孢引起的西洋杜鵑楊梅紅葉斑病具有一定的防控潛力，這與薛德勝等的研究結果［21］一致。

參考文獻：

［1］溫 強，曠藝軍，葉金山，等. 杜鵑花培育及常見病蟲害防治技術研究進展［J］. 江西林業(yè)科技，2004 （2）：21-25.

［2］楊秀梅，唐藝榕，李進昆，等. 杜鵑炭疽病病原鑒定及其生物學特性研究［J］. 江西農業(yè)學報，2018，30（3）：74-77，82.

［3］李秀艷，張 革，陳 軍. 杜鵑花枯梢病病原菌的研究［J］. 森林病蟲通訊，1999，18（1）：30.

［4］姜子德，戚佩坤，陳永青，等. 廣州地區(qū)西洋杜鵑根腐與莖基腐病病原種類鑒定［J］. 云南農業(yè)大學學報，2000，15（4）：333-336.

［5］任緯恒. 高山杜鵑病害的病原菌分離鑒定與防治基礎研究［D］. 貴陽：貴州師范大學，2019：30-32.

［6］段維軍，呂 燕. 杜鵑花枯萎病菌研究進展［J］. 植物檢疫，2021，35（3）：9-12.

［7］陳明珠，丁海霞，劉國琴，等. 錦繡杜鵑葉腫病菌鑒定及病原菌培養(yǎng)代謝產物的初步分析［J］. 植物病理學報，2021，51（6）：1005-1010.

［8］劉浩凱，張 輝，陳玲芳，等. 浙江景寧云錦杜鵑葉斑病病原菌鑒定及生物學特征研究［J］. 浙江林業(yè)科技，2020，40（2）：9-16.

［9］Slippers B，Boissin E，Phillips A J L，et al. Phylogenetic lineages in the Botryosphaeriales：a systematic and evolutionary framework［J］. Studies in Mycology，2013，76（1）：31-49.

［10］寸海春，何鵬搏，何鵬飛，等. 高山杜鵑褐斑病病原學研究［J］. 菌物d5516dea4cfacf40b251c4db15a91050282327a556929f9fb1b0b5ea6a6ca67f學報，2023，42（3）：707-718.

［11］習平根，戚佩坤，姜子德. 香龍血樹真菌病害的鑒定［J］. 華南農業(yè)大學學報（自然科學版），2002，23（2）：30-32，57.

［12］Wang R B，Chen S Z，Zheng B W，et al. Occurrence of leaf spot disease caused by Neopestalotiopsis clavispora on Taxus chinensis in China［J］. Forest Pathology，2019，49（5）：e12540.

［13］Cao P，F(xiàn)ang Y H，Zheng Z K，et al. Occurrence of Neopestalotiopsis clavispora causing leaf spot on Dendrobium officinale in China［J］. Plant Disease，2022：PDIS11212432PDN.

［14］Xie J，Wei J G，Wang K W，et al. Three phytotoxins produced by Neopestalotiopsis clavispora，the causal agent of ring spot on Kadsura coccinea［J］. Microbiological Research，2020，238：126531.

［15］Feng Y R，Liu B S，Sun B B. First report of leaf blotch caused by Pestalotiopsis clavispora on Rosa chinensis in China［J］. Plant Disease，2014，98（7）：1009.

［16］Ismail A M，Cirvilleri G，Polizzi G. Characterisation and pathogenicity of Pestalotiopsis uvicola and Pestalotiopsis clavispora causing grey leaf spot of mango （Mangifera indica L.） in Italy［J］. European Journal of Plant Pathology，2013，135（4）：619-625.

［17］趙景楠，馬 喆，劉正坪，等. 草莓擬盤多毛孢葉斑病的病原菌［J］. 菌物學報，2016，35（1）：114-120.

［18］González P，Alaniz S，Montelongo M J，et al. First report of Pestalotiopsis clavispora causing dieback on blueberry in Uruguay［J］. Plant Disease，2012，96（6）：914.

［19］McClymont M，Nessia H，Waipara N，et al. First report of Pestalotiopsis clavispora from Selaginella kraussiana （African club moss）：an invasive plant species in New Zealand［J］. Australasian Plant Disease Notes，2013，8（1）：79-80.

［20］Daengsuwan W，Wonglom P，Arikit S，et al. Morphological and molecular identification of Neopestalotiopsis clavispora causing flower blight on Anthurium andraeanum in Thailand［J］. Horticultural Plant Journal，2021，7（6）：573-578.

［21］薛德勝，李保華，練 森，等. 藍莓葉斑病病原菌鑒定及其生物學特性［J］. 植物保護學報，2019，46（2）：323-329.

［22］唐鑫彪，倪玉潔，胡玉慈，等. 刺葡萄棒狀擬盤多毛孢葉斑病病原菌的分離鑒定及其防治藥劑篩選［J］. 植物保護，2020，46（4）：110-115，154.

［23］薛德勝，邵兆浩，李保華，等. 防治藍莓棒狀擬盤多毛孢菌化學藥劑的室內篩選［J］. 山東農業(yè)科學，2018，50（9）：115-118.

基金項目：云南農業(yè)聯(lián)合專項（編號：202301BD070001-091）。

作者簡介：田蕓菁（1999—），女，四川達州人，碩士研究生，研究方向為園藝植物病害治理。E-mail：2111413923@qq.com。

通信作者：蘆俊佳，博士，副教授，從事植物病蟲害綜合治理研究。E-mail：58826911@qq.com。