河南省確山縣禽源沙門氏菌分離鑒定及其耐藥性研究

摘 要：本研究旨在了解河南省確山縣禽源沙門氏菌流行現(xiàn)狀、血清型分布及其耐藥性情況。采集來自不同家禽養(yǎng)殖場疑似沙門氏菌感染家禽的泄殖腔拭子、心血、肝等病料147份，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、PCR擴(kuò)增和血清分型試驗進(jìn)行鑒定，采用K-B紙片法對所有鑒定為沙門氏菌的菌株進(jìn)行耐藥性檢測。結(jié)果顯示：共獲得53株沙門氏菌，檢出率為36.05%，分屬A、B、C1、D群7個血清型，其中雞白痢沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌分別占比41.59 %、28.30%；分離菌株對氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、阿米卡星、阿奇霉素、復(fù)方新諾明耐藥性較高，分離菌株耐藥種類介于1～10種之間，以4、5、6重耐藥菌株最多，分別占比16.98%、22.64%、20.75%，多重耐藥率為86.79%。試驗結(jié)果表明，確山縣禽源沙門氏菌血清型比較復(fù)雜，以雞白痢沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢流行血清型。禽源沙門氏菌耐藥性嚴(yán)重，建議加強監(jiān)測，開展綜合防控措施。

關(guān)鍵詞：禽源沙門氏菌；分離鑒定；血清分型；耐藥性

中圖分類號：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-1085（2024）10-0033-06

沙門氏菌（Salmonella）是屬于腸桿菌科的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，可感染鳥類、爬行動物和哺乳動物，包括人類。該菌血清型眾多，據(jù)報道，目前已發(fā)現(xiàn)2 600多種，且多數(shù)對人和動物具有致病性[1]。禽沙門氏菌病是由某些致病血清型沙門氏菌感染家禽的一類細(xì)菌性傳染病總稱，通常包括雞白痢、禽傷寒、禽副傷寒等，臨床表現(xiàn)出腹瀉、輸卵管炎、腹膜炎、敗血癥等多樣性癥狀[2]，發(fā)病迅速，病死率較高，降低家禽生產(chǎn)性能，給家禽業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。耐藥性是一個重大的全球性挑戰(zhàn)，其迅速出現(xiàn)歸因于人類、動物不恰當(dāng)或過度使用抗菌藥物。家禽養(yǎng)殖過程中抗生素的長期不科學(xué)使用導(dǎo)致耐藥菌株不斷增多和耐藥性增強，嚴(yán)重限制了疾病的治療和防控。沙門氏菌耐藥性檢測對于有效監(jiān)測該病臨床抗生素應(yīng)用效果非常必要。

河南省確山縣家禽業(yè)發(fā)展較快，但沙門氏菌病一直是危害當(dāng)?shù)丶仪輼I(yè)的重要疫病之一，且目前未見沙門氏菌流行情況的報道。本研究對2023年來自不同家禽養(yǎng)殖場疑似沙門氏菌病的病料進(jìn)行分離鑒定，并檢測分離菌株的耐藥性，以期為本地禽源沙門氏菌綜合防控提供臨床數(shù)據(jù)、資料支撐。

1 材料與方法

1.1 病料和質(zhì)控菌株

2023年1～12月份，無菌采集自確山縣不同規(guī)模養(yǎng)雞、鴨、鵝場疑似感染沙門氏菌病（主要癥狀為腹瀉、腸炎、敗血癥）的病死禽泄殖腔拭子、心血、肝、脾、腸道內(nèi)容物等，共147份。質(zhì)控菌株為大腸桿菌（CVCC3367）、腸炎沙門氏菌（CVCC3377），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑

LB液體培養(yǎng)基、BS瓊脂、XLD瓊脂、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，購自江西其云生物有限公司；法國科瑪嘉沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基，購自HiMedia公司；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，購自鄭州博賽生物技術(shù)研究所；沙門氏菌屬診斷血清，購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DL 2000 DNA Marker、2×Probe PCR PreMix，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；K-B藥敏紙片（12種），購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 引物設(shè)計合成

根據(jù)GenBank公布的沙門氏菌特異性基因fimY（登錄號：JQ665438.1）序列設(shè)計一對引物，引物序列為：fimY/F：5＇－CGCCCAGCCATACGGATAACC－3′；fimY/R：5′－TACCACGCAGGGAAAGACACC－3′。目的條帶約為427 bp，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 菌株分離培養(yǎng)

將采集的病料使用2 mL生理鹽水稀釋成液體，按1∶10比例加入亞硒酸鹽胱氨酸增菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，再取增菌液分別接種于SS培養(yǎng)基、麥康凱營養(yǎng)瓊脂，37 ℃純培養(yǎng)24 h，挑取典型菌落（半透明、灰白、表面光滑）接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16 h。收集單個菌落，革蘭氏染色、鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.5 生化試驗

按照沙門氏菌生化鑒定試劑盒說明書操作，將純化培養(yǎng)的菌落接種于包含靛基質(zhì)、硫化氫、氰化鉀、尿素、甘露醇、葡萄糖、山梨醇、賴氨酸、蔗糖、V-P試驗10種生化試驗項目的沙門氏菌生化鑒定條和鑒定管，37 ℃培養(yǎng)24 h，對照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.6 分離菌株P(guān)CR鑒定

典型菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)純化培養(yǎng)后，利用細(xì)菌基因組試劑盒，嚴(yán)格遵循說明書操作，分別提取分離菌株和質(zhì)控菌株的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，采用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：2×Probe PCR PreMix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水補足至總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)定為：93 ℃預(yù)變性3 min，90 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共運行35個循環(huán)；最后，72 ℃延伸8 min。同時設(shè)腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株為陽性對照，大腸桿菌為陰性對照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用凝膠成像儀記錄結(jié)果。

1.7 分離菌株血清型鑒定

參考《GB 4789.4-2016沙門氏菌檢驗》[3]中公布的玻片凝集試驗方法，待檢分離菌首先用A～F 多價O血清鑒定分離菌株O抗原，必要時鑒定Vi抗原，屬于A～F 各O群的菌型，依次用H因子血清檢查H抗原的第1相和第2相。具體操作為：取10 μL沙門氏菌診斷血清滴于載玻片中央，再取經(jīng)純培養(yǎng)的單個菌落，使其與載玻片上的診斷血清混勻，1 min后觀察結(jié)果；同時設(shè)無菌生理鹽水為對照。出現(xiàn)凝集現(xiàn)象者為陽性，渾濁者為陰性。將鑒定出的O抗原和H抗原結(jié)構(gòu)式，對照常見沙門氏菌抗原表，判斷分離菌株的血清型。

1.8 耐藥性試驗

采用美國和臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）公布的K-B紙片擴(kuò)散法檢測所有分離菌株對12種抗菌藥物的藥敏性，腸炎沙門氏菌質(zhì)控菌株為對照組。測量各抑菌圈直徑，參考CLSI藥敏標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

病料接種于各培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，BS瓊脂培養(yǎng)基上可見棕褐色或灰綠色菌落，菌落四周培養(yǎng)基為黑色；XLD瓊脂培養(yǎng)基上可見中心黑色的粉紅色菌落，個別為黃色；法國科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上可見紫色菌落生長。革蘭氏染色為陰性，鏡檢分離菌株呈兩端稍微鈍圓的短桿菌，單個或數(shù)個聚集排列在一起。參考《GB 4789.4-2016沙門氏菌檢驗》標(biāo)準(zhǔn)以及顯色培養(yǎng)基說明書，初步判斷分離菌株為沙門氏菌，分離的53株菌株，其中雞源沙門氏菌為25株，鵝源和鴨源分別為12、16株。

2.2 生化試驗

采用沙門氏菌生化鑒定試劑盒進(jìn)一步對53株疑似沙門氏菌進(jìn)行生化試驗，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，所有分離菌株對山梨醇、甘露醇、葡萄糖、硫化氫、賴氨酸試驗為陽性，V-P試驗為陰性；50株分離菌靛基質(zhì)試驗為陰性，3株為陽性，且這3株分離菌的血清凝集試驗出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，顯示為陽性；同時發(fā)酵山梨醇、甘露醇；51株氰化鉀試驗陰性，而2株分離菌氰化鉀、賴氨酸試驗為陽性，尿素反應(yīng)為陰性。參考《GB4789.4-2016 沙門氏菌檢驗》標(biāo)準(zhǔn)，判定3株分離菌為沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體，2株分離菌與沙門氏菌Ⅳ或Ⅴ群生化特性一致[4]，其余菌株生化特性均符合沙門氏菌生化特性。

2.3 分離菌株的PCR擴(kuò)增反應(yīng)

利用特異性引物fimY—F/R對53株分離菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示所有的分離菌在427 bp處有一條清晰的條帶，與目的條帶吻合，表明53株分離菌為沙門氏菌。部分?jǐn)U增結(jié)果見圖1。

2.4 血清分型鑒定

血清型鑒定結(jié)果顯示，53株分離菌分屬A、B、C1、D群7個血清型；22株血清型為雞白痢沙門氏菌，占比41.59 %；15株為鼠傷寒沙門氏菌，占比28.30%；7株傷寒沙門氏菌，占比13.21%；3株乙型副傷寒，占比5.66%；圣保羅沙門氏菌、湯卜遜沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌各2株，分別占比3.77%。結(jié)果表明，確山縣禽源沙門氏菌血清型比較復(fù)雜，以雞白痢沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢流行血清型。

2.5 耐藥性檢測

利用K-B紙片法進(jìn)行抗菌藥物檢測，結(jié)果見表2。分離菌株對氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、阿米卡星、阿奇霉素、復(fù)方新諾明耐藥性較高，耐藥率介于52.83%～88.68%；其余抗菌藥物耐藥率相對較低，介于11.32～45.28%。多重耐藥性分析結(jié)果見圖2。分離菌株耐藥種類介于1～10種之間，以4、5、6重耐藥菌株最多，分別占比16.98%、22.64%、20.75%，多重耐藥（耐藥種類≥3）率為86.79%。

3 討論

沙門氏菌病是一種在動物和人類之間傳播的傳染病，由多種沙門氏菌引起。沙門氏菌是兼性厭氧菌，可以在低氧、溫暖和潮濕的環(huán)境中生存，在家禽中傳播通常通過糞口途徑，一旦被攝入，很容易在家禽腸道中定植，粘附在腸道上皮細(xì)胞上，導(dǎo)致腸道穩(wěn)態(tài)破壞，引發(fā)腸道內(nèi)的炎癥反應(yīng)并損害腸道屏障功能，從而導(dǎo)致感染禽腹瀉和生長障礙[5]，導(dǎo)致家禽業(yè)遭受重大經(jīng)濟(jì)損失，并對公眾衛(wèi)生健康構(gòu)成風(fēng)險。因此，開展沙門氏菌監(jiān)測對于家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展尤為重要。

血清分型是調(diào)查沙門氏菌感染流行病學(xué)狀況的基本生物標(biāo)志物[6]。此外，由于不同地區(qū)、環(huán)境、飼養(yǎng)管理、用藥行為、用藥時期等因素會影響沙門氏菌血清型的分布，并且血清型鑒定有利于選擇候選疫苗株進(jìn)行疫苗研制和應(yīng)用。張若楠[7]報道，2020年7月—2021年6月，江蘇和安徽部分地區(qū)的禽源沙門氏菌總體分離率為12.26%（76/620），以鼠傷寒沙門菌（56.58%）和雞白痢沙門菌（34.21%）為優(yōu)勢流行菌株，與本研究中確山縣禽源沙門氏菌優(yōu)勢血清型的結(jié)果一致。撒朗文朱[8]報道，2020年12月—2021年8月，四川部分地區(qū)的禽源沙門氏菌總分離率為10.60%（100/943），鑒定出7種血清型，其中雞白痢沙門、鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌為優(yōu)勢血清型。本研究對來自確山縣不同規(guī)模養(yǎng)禽場疑似感染沙門氏菌的147份病料進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、生化反應(yīng)試驗、分子生物學(xué)檢測和血清型鑒定試驗，分離鑒定出53株沙門氏菌，檢出率為36.05%，表明該地區(qū)禽源沙門氏菌感染比較普遍。血清型鑒定結(jié)果顯示，確山縣禽源沙門氏菌血清型比較復(fù)雜，分屬A、B、C1、D群7個血清型，其中優(yōu)勢血清型為雞白痢沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，說明危害確山縣家禽養(yǎng)殖業(yè)的沙門氏菌病主要為雞白痢和禽副傷寒，這為研發(fā)疫苗候選菌株提供了方向。不同地區(qū)沙門氏菌流行程度存在差異，這是因為許多因素影響沙門氏菌感染的嚴(yán)重程度，包括宿主年齡、宿主免疫力、合并感染、感染劑量、管理問題、環(huán)境壓力等[9]。本研究的試驗結(jié)果豐富了沙門氏菌的研究資源，為今后預(yù)防和控制該病的流行提供了重要數(shù)據(jù)支持。

長期以來，抗菌藥物廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床和養(yǎng)殖生產(chǎn)，對于控制畜禽疫病發(fā)生和提高生產(chǎn)性能發(fā)揮了積極作用，但是，無節(jié)制地使用抗菌藥物破壞了家禽腸道菌群的平衡，導(dǎo)致抗菌藥物耐藥性不斷增強、耐藥譜進(jìn)一步擴(kuò)大，獸藥殘留問題已經(jīng)成為人們關(guān)注的焦點。據(jù)報道，許多沙門氏菌存在抗生素耐藥性，自然地表現(xiàn)出對多種抗生素的耐藥性，包括氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素類、四環(huán)素類、磺胺類和多粘菌素類[10-12]。這種廣泛的自然耐藥性使該疾病的抗生素治療變得復(fù)雜。根據(jù)美國國家抗菌素耐藥性監(jiān)測系統(tǒng) （NARMS） 的數(shù)據(jù)，2019 年從雞肉和火雞肉零售肉中分離出的所有沙門氏菌血清型中，分別有29% 和7%是多重耐藥[13]。本研究對53株沙門氏菌抗菌藥物耐藥性檢測，結(jié)果顯示，所有菌株對氨芐西林、阿莫西林、慶大霉素、阿米卡星、阿奇霉素、復(fù)方新諾明耐藥性較高。多重耐藥性比較嚴(yán)重，分離菌株耐藥種類介于1～10種之間，以4、5、6重耐藥菌株最多，分別占比16.98%、22.64%、20.75%，多重耐藥（耐藥種類≥3）率高達(dá)86.79%。與溫錦芳等[14]、王瑤等[15]報道的沙門氏菌耐藥性研究結(jié)果存在差異，這是由于流行菌株、用藥行為、飼養(yǎng)管理等導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性具有一定的差異性。本研究的耐藥性檢測分析表明，確山縣禽源沙門氏菌普遍存在比較嚴(yán)重的耐藥性。目前，益生菌、中草藥等天然免疫增強劑因其環(huán)境友好、副作用小、無化學(xué)殘留等優(yōu)點，常被用作飼料添加劑來控制細(xì)菌性疾病。建議推廣應(yīng)用抗菌肽、益生菌、抗菌性中草藥等作為飼料添加劑來控制沙門氏菌病流行，阻止耐藥性菌株的進(jìn)一步擴(kuò)大。

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