摘要為明確植物源松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌的生物活性和應(yīng)用潛力，采用菌絲生長速率法測定了松油醇與d-檸檬烯對花生白絹病菌的抑菌活性，室內(nèi)篩選了對花生白絹病菌抑制效果好的最佳混配比（質(zhì)量比），并采用共毒系數(shù)法和盆栽法評價(jià)了二者的協(xié)同增效作用。結(jié)果表明，松油醇與d-檸檬烯對花生白絹病菌的抑制活性均較強(qiáng)，抑制中濃度（EC50）分別為49.23 μg/mL和60.87 μg/mL。且在500 μg/mL和1 000 μg/mL濃度下，松油醇處理15 d和30 d可完全抑制花生白絹病菌菌絲生長，菌核形成以及菌核再萌發(fā)。而相同條件下d-檸檬烯對菌絲生長、菌核形成和菌核萌發(fā)無影響。在特定濃度下，松油醇與d-檸檬烯按不同質(zhì)量比復(fù)配均能提高對花生白絹病菌的抑制作用，其中松油醇和d-檸檬烯以1∶4和1∶2復(fù)配時(shí)增效作用最為顯著，共毒系數(shù)（CTC）分別為147.87和216.57。盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示，松油醇和d-檸檬烯以1∶4和1∶2復(fù)配的防效均高于單劑。綜上，松油醇和D-檸檬烯復(fù)配可作為新型植物源殺菌劑進(jìn)行開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞松油醇;d-檸檬烯;花生;病原真菌;齊整小核菌

中圖分類號(hào)：S 435.652文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.16688/j.zwbh.2023543Biological activity and synergistic effects of terpineol and d-limonene against

Sclerotium rolfsii， the causal agent of peanut southern blightWANG Qinqin FENG Jingwen LIU Di ZHANG Guoyan WANG Li MAO Xuewei WANG Meizi CUI Kaidi ZHOU Lin（1. College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Henan Key Laboratory for Creation and Application

of Novel Pesticides， Henan Engineering Technology Research Center of Green-Pesticide Creation， Zhengzhou

450046， China; 2. Henan Plant Protection and Quarantine Station， Zhengzhou450002， China）AbstractTo clarify the biological activity and application potential of terpineol and d-limonene from plant essential oils in fighting peanut southern blight caused by Sclerotium rolfsii， their inhibitory activities were tested using the mycelial growth rate method. The optimal mixing mass ratio of terpineol and d-limonene for controlling S.rolfsii was screened in the laboratory， and the synergistic effect was evaluated using co-toxicity coefficient method and pot experiments. The results showed that the strongest inhibitory activity of terpineol and d-limonene against S.rolfsii was achieved with EC50 values of 49.23 μg/mL and 60.87 μg/mL， respectively. At 500 μg/mL and 1 000 μg/mL， terpineol completely inhibited mycelial growth， sclerotium formation and re-germination when treatment lasted for 15 and 30 days. However， under same treatment conditions， d-limonene did not inhibit mycelial growth for a longer period and did not inhibit sclerotium formation and re-germination. Compared with the single agent， the inhibition rates of combination of terpineol and d-limonene against S.rolfsii at specific concentrations with different mass ratios were elevated. The synergistic effect of terpineol combined with d-limonene in mass ratios of 1∶4 and 1∶2 was the most significant， with co-toxicity coefficients of 147.87 and 216.57， respectively. Potted experiments showed that the control effect of the combination of terpineol and d-limonene in mass ratios of 1∶4 and 1∶2 was higher than that of a single agent， indicating that this combination can be developed and utilized as a new plant-derived fungicide.

Key wordsterpineol;d-limonene;peanut;pathogenic fungi;Sclerotium rolfsii

隨著社會(huì)大眾環(huán)保意識(shí)、食品安全意識(shí)、健康意識(shí)的提高，農(nóng)藥的發(fā)展也朝著高效、低毒、高選擇性的方向轉(zhuǎn)變。從天然植物資源中尋找活性物質(zhì)來代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥逐漸受到國內(nèi)外的廣泛重視。這在新農(nóng)藥創(chuàng)制和病蟲害綠色防控策略中具有重要的意義，并在許多生產(chǎn)實(shí)踐中得到了廣泛的應(yīng)用。

松油醇（terpineol，C10H18O）是廣泛存在于植物精油中的一種典型萜類化合物，包括α-松油醇，β-松油醇和γ-松油醇3種同分異構(gòu)體，是不可多得的生物資源。近年來，松油醇在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的報(bào)道也日趨增多。如研究發(fā)現(xiàn)，松油醇對意大利青霉Penicillium italicum具有很強(qiáng)的抑制活性，主要表現(xiàn)為影響細(xì)胞壁合成，破壞真菌的形態(tài)和膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)的成分泄漏等［1］。以松油醇為主要成分的綠茶精油制備成納米乳劑具有優(yōu)異的抗稻瘟病菌Pyricularia oryzae的活性，能夠引起細(xì)胞損傷［2］。此外，松油醇具有較強(qiáng)的抗茶樹病原菌膠胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和茶假擬盤多毛孢Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis的活性［3］。然而，有關(guān)松油醇對花生病原真菌的生物活性鮮有報(bào)道。d-檸檬烯（d-limonene， C10H16）是一種單環(huán)單萜，在檸檬、橙子和葡萄等柑橘類植物中大量存在，具有抗氧化，消炎和抗癌的作用［4］。因其具有高質(zhì)量的香味，d-檸檬烯作為香料和香料添加劑在香水、肥皂、食品和飲料中的應(yīng)用也不斷增加［5］。d-檸檬烯在我國農(nóng)業(yè)上作為助劑或殺蟲劑對螨類或蚜蟲等害蟲的生物活性已有研究［67］。然而，關(guān)于d-檸檬烯對作物病原菌的抑菌活性卻鮮有報(bào)道，特別是對由齊整小核菌Sclerotium rolfsii引起的土傳病害花生白絹?。╬eanut sclerotium blight）的作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道。在中國，奧羅阿格瑞國際有限公司和禹城聯(lián)合利農(nóng)生物科技有限公司現(xiàn)已登記d-檸檬烯原藥和可溶液劑，用于防治煙粉虱、紅蜘蛛、炭疽病和白粉病。而松油醇在我國尚無農(nóng)藥登記信息。此外，d-檸檬烯可作為助劑與農(nóng)藥混用，通過降低農(nóng)藥的表面張力，增加藥液在作物葉片上的最大持留量和沉積量發(fā)揮協(xié)同增效作用［6］。而松油醇和d-檸檬烯作為不同的植物源化學(xué)成分，其對花生白絹病的聯(lián)合抑菌活性是否能發(fā)揮協(xié)同增效作用值得深入探究。

基于此，本文將采用菌絲生長速率法測定松油醇和d-檸檬烯對齊整小核菌的抑菌活性，在此基礎(chǔ)上篩選二者混配時(shí)對齊整小核菌具有最佳抑菌活性的質(zhì)量比，采用共毒系數(shù)法和盆栽法評價(jià)其協(xié)同增效作用，旨在為松油醇和d-檸檬烯聯(lián)合開發(fā)成防治花生病害的植物源殺菌劑及未來用于生產(chǎn)實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

供試藥劑：20%松油醇可溶液劑和10% d-檸檬烯可溶液劑由邁圖有機(jī)硅材料（上海）有限公司贈(zèng)送。

供試病原菌：花生白絹病原菌齊整小核菌Sclerotium rolfsii采自河南省正陽縣花生主產(chǎn)區(qū)（32.61°N， 114.39°E），由河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于2022年分離保存。

1.2松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌菌絲生長、菌核形成及菌核萌發(fā)的抑制作用采用菌絲生長速率法［8］。用無菌水分別將20%松油醇可溶性液劑和10% d-檸檬烯可溶性液劑配制成10 000 μg/mL母液，然后再稀釋成5 000、2 000、1 000、500、250、125 μg/mL 6個(gè)濃度的藥液。取1 mL藥液加到9 mL PDA培養(yǎng)基中配制成含藥培養(yǎng)基，在每個(gè)含藥培養(yǎng)皿中心放置1個(gè)直徑5 mm的菌餅，重復(fù)3次，以加無菌水的PDA培養(yǎng)基為空白對照，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。將各處理繼續(xù)置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于第15天和第30天觀察菌絲的生長狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)形成的菌核數(shù)量。收集對照培養(yǎng)基中形成的菌核，消毒處理后接入含藥培養(yǎng)基中，以加無菌水的PDA培養(yǎng)基為空白對照，48 h后統(tǒng)計(jì)菌核萌發(fā)情況，計(jì)算菌核萌發(fā)抑制率。

抑制率=對照菌落直徑-處理菌落直徑/對照菌落直徑-菌餅直徑×100%（1）

菌核萌發(fā)抑制率=

對照菌核萌發(fā)數(shù)量-處理菌核萌發(fā)數(shù)量/對照菌核萌發(fā)數(shù)量×100%（2）

1.3特定濃度不同質(zhì)量配比的松油醇和d-檸檬烯混合物對花生白絹病菌的抑菌作用為進(jìn)一步評價(jià)松油醇和d-檸檬烯復(fù)配對花生白絹病菌的抑菌作用，將20%松油醇可溶液劑和10% d-檸檬烯可溶液劑按照質(zhì)量比9∶1、5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5和1∶9配制成2 000 μg/mL和400 μg/mL的藥液。取供試藥液1 mL加到 9 mL PDA培養(yǎng)基配制成終濃度分別為200 μg/mL和40 μg/mL的含藥平板，在每個(gè)含藥培養(yǎng)基中心放置1個(gè)直徑5 mm的菌餅，重復(fù)3次，以添加無菌水的PDA培養(yǎng)基為空白對照。在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。分別按公式（3）和（4）計(jì)算理論抑菌率和增效系數(shù)。

混劑的理論抑菌率（IR_T）=P_A×IR_A+P_B×IR_B （3）

增效系數(shù)（SR）=IR_M/IR_T（4）

A、B為單劑，M為混合藥劑。IRA和IRB分別為A藥劑和B藥劑實(shí)際抑制率，IRM為混劑的實(shí)際抑制率，IRT為混劑的理論抑制率。P為有效成分的百分含量，SR為混劑增效系數(shù)。SR＞1表現(xiàn)為增效作用，SR=1表現(xiàn)為相加作用，SR＜1表現(xiàn)為拮抗作用［9］。

1.4最佳質(zhì)量配比下松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌的聯(lián)合毒力測定20%松油醇可溶液劑和10% d-檸檬烯可溶液劑按質(zhì)量比1∶2和1∶4配制成10 000 μg/mL母液，然后再稀釋成5 000、2 000、1 000、500、250、125 μg/mL 6個(gè)濃度的藥液。取供試藥液1 mL加到9 mL PDA培養(yǎng)基中，每培養(yǎng)皿中心放置1個(gè)直徑5 mm的菌餅，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復(fù)3次，以添加無菌水的PDA培養(yǎng)基為空白對照。當(dāng)對照菌落長至直徑7 cm以上時(shí)，用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。根據(jù)幾率值分析法，分別求出其毒力回歸方程、EC50和EC90。2種藥劑的聯(lián)合抑菌作用通過共毒系數(shù)（co-toxicity coefficient， CTC）進(jìn)行評估［1012］。

相對毒力指數(shù)（TI）=標(biāo)準(zhǔn)藥劑的EC₅₀/供試藥劑的EC₅₀×100（5）

混劑實(shí)際毒力指數(shù)（ATI）=標(biāo)準(zhǔn)藥劑的EC₅₀/供試混劑的EC₅₀×100（6）

混劑理論毒力指數(shù)（TTI）=A藥劑的ATI×A藥劑在混劑中的百分含量+B藥劑的ATI×B藥劑在混劑中的百分含量。（7）

CTC=混劑的實(shí)際毒力指數(shù)（ATI）/混劑的理論毒力指數(shù)（TTI）×100%（8）

若混劑的CTC≥120，表示有增效作用;CTC介于80～120之間，表示有相加作用;CTC≤80，表示有拮抗作用。

1.5最佳質(zhì)量配比下松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌的治療和保護(hù)作用采用噴淋法測試松油醇和d-檸檬烯對齊整小核菌引起的花生白絹病的盆栽防治效果。試驗(yàn)花生品種為‘豫花22’，選取顆粒飽滿，大小一致的花生種子置于盆中，加入無菌水淹沒種子的三分之一，并放于培養(yǎng)箱中浸種半天。將基質(zhì)土與蛭石以2∶1的體積比例混合，加入無菌水調(diào)整土壤持水量為70%后置于盆缽中，將發(fā)芽的種子胚根朝下播種。

治療作用：播種后10 d，選取健康、長勢、大小一致的花生植株，在每株莖基部接種2個(gè)菌餅，并用土掩埋。當(dāng)觀察到花生植株和土壤上出現(xiàn)白色菌絲后，分別以1 000 mg/L的松油醇、d-檸檬烯、松油醇∶d-檸檬烯=1∶2和1∶4藥液噴淋植株根莖部及周圍土壤，每株噴藥液10 mL。含0.1% DMSO和0.1% 吐溫80的無菌水作為對照。每處理20株，重復(fù)3次。

保護(hù)作用：選取健康、長勢、大小一致的植株，在花生莖基部灌根1 000 mg/L的松油醇、d-檸檬烯、松油醇∶d-檸檬烯=1∶2和1∶4藥液（除了花生莖基部，也要照顧到花生子葉和土壤1～2 cm處，因?yàn)榫z會(huì)在土壤表面生長和侵染死組織子葉），每株花生10 mL藥液（用5 mL移液槍打到莖基部、子葉和土壤周圍1～2 cm處），打藥2 d后，用挑針在花生莖基部輕輕劃傷，將有菌絲一面的菌餅貼在花生莖基部，并用土掩埋，每株植株接入2個(gè)菌餅。

施藥或接菌后7 d，按分級標(biāo)準(zhǔn)對病情進(jìn)行分級并計(jì)算病情指數(shù)和防治效果［13］。0級：無病斑;1級：僅在莖基部產(chǎn)生病斑;3級：莖基部產(chǎn)生縊縮癥狀，整株的三分之一以下表現(xiàn)系統(tǒng)癥狀（枯萎、死亡、萎蔫等）;5級：整株的三分之一到三分之二表現(xiàn)系統(tǒng)癥狀;7級：整株的三分之二以上表現(xiàn)系統(tǒng)癥狀;9級：植株枯死。

病情指數(shù)=∑（病級數(shù)×該病級株數(shù)）/最高病級數(shù)×調(diào)查總株數(shù)×100（9）

防治效果=對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)/對照病情指數(shù)×100%（10）

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel統(tǒng)計(jì)不同濃度藥劑對花生白絹病菌菌絲生長的抑菌率，計(jì)算毒力回歸方程、抑制中濃度EC50和95%置信區(qū)間并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。使用DPS version 7.05對兩藥劑處理后的菌核數(shù)量和盆栽防效等進(jìn)行單因素方差分析及Duncan氏新復(fù)極差法多重比較，最后使用Origin 8制圖軟件制圖。

2結(jié)果與分析

2.1松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌菌絲生長的影響松油醇和d-檸檬烯對花生病原真菌齊整小核菌菌絲生長的室內(nèi)毒力測定結(jié)果見表1和圖1。松油醇和d-檸檬烯對齊整小核菌菌絲生長均具有較強(qiáng)的抑制活性，其EC50分別為49.23 μg/mL和60.87 μg/mL。同時(shí)，藥劑處理后菌絲形態(tài)受到顯著干擾，表現(xiàn)出分枝增多，隨著處理濃度的升高菌絲呈現(xiàn)出先變粗再變細(xì)的現(xiàn)象。

2.2松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌菌核形成的影響處理15 d，松油醇在500 μg/mL 和1 000 μg/mL濃度下能夠完全抑制花生白絹病菌的生長（圖2），且能夠顯著干擾菌核的形成，處理30 d菌核形成的數(shù)量顯著降低（P＜0.05），尤其在1 000 μg/mL濃度下幾乎完全抑制了菌核的形成（圖3）。

2.3松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌菌核萌發(fā)的影響如圖4所示，200～1 000 μg/mL的松油醇下能夠完全抑制花生白絹病菌菌核的萌發(fā)，顯著優(yōu)于d-檸檬烯。1 000 μg/mL濃度下，d-檸檬烯對菌核萌發(fā)的抑制率僅為（20±5.77）%，其他濃度下d-檸檬烯處理菌核對其萌發(fā)無影響，萌發(fā)率為100%。

2.4松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌協(xié)同增效離體活性松油醇和d-檸檬烯以質(zhì)量比為9∶1，5∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶4，1∶5和1∶9復(fù)配，在混劑濃度為40 μg/mL和200 μg/mL處理下對花生白絹病菌的實(shí)際抑菌率普遍高于理論抑菌率。在低濃度處理?xiàng)l件下，采用1∶2和1∶4質(zhì)量比時(shí)增效效果較好，增效系數(shù)分別為1.54和1.42（表2），共毒系數(shù)（CTC）分別為216.57和147.87，均大于120（表3），具有非常顯著的協(xié)同增效作用。

2.5松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌協(xié)同增效活體活性從圖5可知，松油醇在1 000 μg/mL劑量下保護(hù)作用和治療作用的活體防效相當(dāng)，分別為15.86%和14.48%，d-檸檬烯在1 000 μg/mL劑量下治療作用（25.74%）是保護(hù)作用（15.35%）活體防效的1.68倍;此外，T∶D=1∶2和T∶D=1∶4對齊整小核菌的活體防效均高于單劑處理，其中保護(hù)作用分別為32.03%和40.20%，治療作用活體防效分別為28.42%和41.29%。盆栽試驗(yàn)結(jié)果再次表明，松油醇和d-檸檬烯混配對花生白絹病病原菌具有協(xié)同增效作用，優(yōu)于單劑的防病效果。

3結(jié)論與討論

目前，松油醇在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域研究應(yīng)用較多［14］，其對作物病害病原真菌如意大利青霉、稻瘟菌、茶樹病原菌膠胞炭疽菌、茶假擬盤多毛孢和指狀青霉Penicillium digitatum具有抑制活性［1， 1517］。d-檸檬烯在我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，研究報(bào)道多集中在殺蟲活性和作為助劑添加對殺蟲劑減量增效等方面［67］。如畢曉陽等報(bào)道了d-檸檬烯對柑橘全爪螨Panonychus citri成螨產(chǎn)卵具有較好的抑制作用［7］。王芳等揭示了d-檸檬烯對吡蟲啉防治枸杞棉蚜Aphis gossypii 的增效作用與其降低藥液表面張力和增加藥液在枸杞葉片上的最大持留量和沉積量有關(guān)［6］。但松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌的生物活性以及二者聯(lián)合使用是否能夠發(fā)揮協(xié)同增效作用尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

本文的研究結(jié)果表明，松油醇和d-檸檬烯對花生白絹病菌具有顯著的抑制作用。特別是，松油醇對其菌核的形成具有強(qiáng)烈的干擾作用，菌核形成數(shù)量隨著處理濃度升高而顯著降低，具有明顯的劑量依賴性?；ㄉ捉伈∈怯升R整小核菌引起的一種世界性土傳真菌病害［18］。其主要以堅(jiān)硬菌核越冬，且菌核能在土壤中存活5～8年，菌核為次年的初侵染源，高溫高濕的環(huán)境條件利于其重復(fù)侵染，這無疑增加了花生白絹病的防治難度。而松油醇可抑制菌核的形成及萌發(fā)，對于花生白絹病的防治具有重要意義。因此，植物精油化學(xué)成分松油醇具有開發(fā)成綠色植物源菌核抑制劑的潛力，后期可結(jié)合新型劑型加工在田間驗(yàn)證其防治花生白絹病的效果。此外本研究發(fā)現(xiàn)，松油醇與d-檸檬烯以不同質(zhì)量比組合時(shí)對齊整小核菌均表現(xiàn)出協(xié)同增效作用（SR＞1），其中以質(zhì)量比1∶2和1∶4混配時(shí)增效系數(shù)最大，且共毒系數(shù)CTC顯著大于120，具備開發(fā)成新型綠色植物源抑菌劑的潛力。相同濃度下，松油醇和d-檸檬烯質(zhì)量比為1∶2和1∶4對花生白絹病菌的活體防效均高于或顯著高于單獨(dú)使用松油醇或d-檸檬烯的防效。綜上所述，推薦將松油醇和d-檸檬烯以1∶2和1∶4質(zhì)量比混配，開發(fā)成植物源農(nóng)藥用于花生白絹病的防治。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）