大豆異黃酮通過(guò)抑制 Wnt/Ca2+信號(hào)通路減輕大鼠腦缺血再灌注引起的鈣超載

摘要：目的 探討大豆異黃酮（SI）減輕腦缺血再灌注（I/R）引起鈣超載的作用機(jī)制。方法 將48 只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)法分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、腦缺血再灌注模型組（I/R組）、病毒空載組（NC 組）、Frizzled-2敲低組（Knock down組），12只/組。采用線栓法堵塞大腦中動(dòng)脈2 h，再灌注24 h構(gòu)建 I/R模型。采用Western blot驗(yàn)證病毒敲低效率并檢測(cè)Wnt/Ca2+信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ的變化。采用鈣含量顯色法檢測(cè)各組缺血半暗帶（IP）區(qū)鈣離子濃度變化，HE檢測(cè)各組IP區(qū)組織結(jié)構(gòu)變化。另將72只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)法分為3組：Sham組、I/R組、大豆異黃酮預(yù)處理組（SI組），24只/組。采用多普勒血流儀檢測(cè)局部腦血流變化，TTC染色檢測(cè)腦梗死體積，HE和尼氏染色檢測(cè)IP 區(qū)組織變化、免疫熒光檢測(cè)ROS、Ca2+和細(xì)胞凋亡水平、流式檢測(cè)細(xì)胞鈣離子濃度，試劑盒檢測(cè)血清MDA和SOD水平，Western blotting 和免疫組化檢測(cè)IP區(qū)Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ蛋白表達(dá)。結(jié)果 與I/R 組比較，Knock down 組鈣離子濃度（Plt;0.001）、Wnt5a（Plt;0.05）、Frizzled-2（Plt;0.05）和P-CaMKⅡ（Plt;0.001）表達(dá)水平均降低；與I/R組比較，SI 組鈣離子濃度（Plt;0.05）、ROS 和MDA水平（Plt;0.001）、細(xì)胞凋亡程度（Plt;0.001）、腦梗死體積（Plt;0.001）、Wnt5a、Frizzled-2 和P-CaMKⅡ表達(dá)水平（Plt;0.05）均降低，SOD水平升高（Plt;0.001）。結(jié)論大豆異黃酮可能通過(guò)抑制Wnt/Ca2+信號(hào)通路減輕大鼠腦缺血再灌注引起的鈣超載

關(guān)鍵詞：大豆異黃酮；腦缺血再灌注；鈣超載；Wnt/Ca2+

腦卒中可分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占所有病例的80%［1］。血流阻塞或血供不足是缺血性腦卒中的根本原因，缺血性腦卒中導(dǎo)致大腦供氧和葡萄糖減少，進(jìn)而引發(fā)興奮毒性、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等一系列病理事件，最終導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元損傷［2， 3］。腦卒中后腦血流的恢復(fù)可以挽救缺血神經(jīng)元損傷，但也可引起腦缺血再灌注損傷（CIRI）［1， 4］。CIRI的形成機(jī)制復(fù)雜，鈣超載是導(dǎo)致 CIRI 后神經(jīng)元持續(xù)損傷的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制［5］。有研究認(rèn)為在腦缺血的前期，短暫的葡萄糖和氧剝奪會(huì)觸發(fā)對(duì)N-甲基-D-天冬氨酸受體的持續(xù)刺激，導(dǎo)致相關(guān)Ca2+通道的激活和Ca2+ 內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷甚至死亡［6］。也有研究認(rèn)為ROS會(huì)影響Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和Ca2+的儲(chǔ)存［7， 8］。但目前對(duì)于腦缺血再灌注過(guò)程中鈣超載具體機(jī)制仍不明確。Wnt/Ca2+信號(hào)通路目前被認(rèn)為在細(xì)胞內(nèi)鈣代謝中起關(guān)鍵作用［9］，但其是否參與缺血再灌注鈣超載尚未見(jiàn)報(bào)道。深入研究腦缺血再灌注引起的鈣超載與Wnt/Ca2+通路的關(guān)系，對(duì)于研究CIRI的具體機(jī)制及尋求治療的新靶點(diǎn)具有重要意義。

大豆異黃酮（SI）是從大豆中提取的一種帶芳香A-環(huán)的三苯基異黃酮類(lèi)化合物，在抗癌、防骨質(zhì)疏松、防治心血管疾病等多方面都有其獨(dú)特功效［10， 11］。既往研究表明SI可以通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子和鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）減輕CIRI［12-14］，CaMKⅡ活性檢測(cè)可以作為Wnt/Ca2+信號(hào)通路的標(biāo)志物［15］。SI 能否通過(guò)調(diào)控Wnt/Ca2+信號(hào)通路改善腦缺血再灌注導(dǎo)致的鈣超載損傷尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)SI 預(yù)處理，采用線栓法構(gòu)建大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，探討SI 對(duì)腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶內(nèi)鈣水平的影響及其可能的作用機(jī)制，為治療CIRI提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年雄性SD大鼠（250～280 g），購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，均在適當(dāng)?shù)拿芏认嘛曫B(yǎng)，環(huán)境、溫度、濕度適宜，光照/黑暗周期為12 h/12 h，自由飲水和進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)蚌埠醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2021-206）。

1.1.2 主要試劑和儀器

腺相關(guān)病毒（上海漢恒生物有限公司）； SI（Acmec，純度40%，S64650）；栓線（北京西濃科技公司）；2，3，5- 三苯基氯化四氮唑（TTC，Solarbio）；蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天）；Wnt5a、β-actin 抗體（abcolne）；P-CaMK Ⅱ、CaMKⅡ抗體（Abcam）；Frizzled-2 抗體和山羊抗兔二抗（Affinity）；HE染料（Biosharp）；尼氏染料（源葉）；鈣含量顯色試劑盒、超氧化物陰離子熒光檢測(cè)探針DHE、鈣離子試劑盒和一步TUNEL 染色試劑盒（碧云天）；MDA 和SOD 試劑盒（南京建成有限公司）；電泳儀（Servicebio）；激光多普勒血流儀（Perimed）；高端倒置熒光顯微鏡（Obsever）； 流式細(xì)胞儀（貝克曼）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)法將48只SPF級(jí)雄性SD大鼠（250g～280 g）隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（Sham組）、腦缺血再灌注模型組（I/R 組）、病毒空載組（NC組）、Frizzled-2敲低組（Knock down組），12只/組。其中NC組和Knock down組對(duì)大鼠進(jìn)行側(cè)腦室注射腺相關(guān)病毒，NC組為Knock down組的陰性對(duì)照組，注射21 d后再構(gòu)建腦缺血再灌注模型。再采用隨機(jī)數(shù)法將另外72 只SPF級(jí)雄性SD大鼠（250g～280 g）隨機(jī)分為3 組：假手術(shù)組（Sham組）、腦缺血再灌注模型組（I/R組）、SI預(yù)處理組（SI組），24只/組。SI組給予SI（120 mg/kg）［13］灌胃21 d后構(gòu)建腦缺血再灌注模型，Sham組和I/R組給予等體積生理鹽水灌胃，I/R組21 d后構(gòu)建腦缺血再灌注模型，Sham 組不插栓線其他步驟同I/R組。

1.2.2 腦缺血再灌注模型的建立

手術(shù)前將大鼠麻醉（1%戊巴比妥鈉，腹腔注射，40 mg/kg）俯臥位置于手術(shù)平板上。剃除頭部的毛發(fā)并用酒精消毒，剪開(kāi)額頂部的皮膚并剔除皮下組織和骨膜，暴露中線、冠狀縫和右頂骨，使用牙科鉆在顱骨頂骨上橫竇上方、上矢狀竇外側(cè)、冠狀縫下方形成一骨窗［16］，穿透顱骨至硬腦膜，將多普勒激光探頭固定于此，實(shí)時(shí)檢測(cè)局部腦血流（rCBF）變化。

采用改良的Longa's法建立大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型［17］。沿頸部正中線切開(kāi)，仔細(xì)剝離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），結(jié)扎ECA和CCA 近心端，動(dòng)脈夾短暫夾閉CCA，在動(dòng)脈夾與CCA結(jié)扎處中間打一活結(jié)。于CCA結(jié)扎處遠(yuǎn)心端剪一斜口，將栓線經(jīng)此斜口輕輕向前推進(jìn)，拉緊活結(jié)固定住栓線，松開(kāi)動(dòng)脈夾從CCA經(jīng)ICA入顱至大腦前動(dòng)脈，阻斷大腦中動(dòng)脈形成缺血。缺血2 h后，拔出栓線以恢復(fù)腦血流灌流24 h，模擬急性腦缺血再灌注模型。

1.2.3 側(cè)腦室注射敲低Frizzled-2 的腺相關(guān)病毒

采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［18］中列出的坐標(biāo)定位側(cè)腦室（前囟后1 mm，正中線右側(cè)1.5 mm，深度4 mm），并用牙科鉆在此位置上鉆1個(gè)直徑2 mm的小孔，暴露硬腦膜。使用吸取5 μL腺相關(guān)病毒溶液的微量注射器緩慢（1 μL/min）注射到側(cè)腦室。注射結(jié)束后靜置5 min再取下針頭，棉簽按壓以防出血，最后進(jìn)行頭皮縫合。

1.2.4 腦梗死體積檢測(cè)和行為學(xué)評(píng)分

大鼠麻醉后立即處死，斷頭取腦，用預(yù)冷的PBS清洗后置于-80 ℃冰箱速凍1 h，取出后在冰上切成6片2 mm厚的冠狀腦切片。將腦片置于2% TTC染液中37 ℃水浴孵育10 min，再將腦片翻面繼續(xù)孵育10 min，隨后置于4%多聚甲醛中固定，隔日拍照并利用Image J 進(jìn)行腦梗死面積的分析。紅色區(qū)域?yàn)槲垂Ｋ绤^(qū)，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)。腦梗死體積比=各腦切片梗死面積和/各腦切片面積和×100%。

再灌注24 h后，參照Longa's評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行神經(jīng)學(xué)評(píng)分［17］。無(wú)神經(jīng)功能缺陷：0 分；對(duì)側(cè)上肢不能完全伸展：1分；行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈：2分；行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒：3分；不能自動(dòng)行走，存在意識(shí)喪失現(xiàn)象：4分。選擇評(píng)分在1～3的進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并在各組大鼠中隨機(jī)選擇6只，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 腦組織HE染色和尼氏染色

再灌注24 h后麻醉大鼠，先用0.9%生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，再用4%多聚甲醛緩慢灌注直至肺變白，最后取腦置于4%多聚甲醛中4 ℃冰箱存放。隔日進(jìn)行梯度酒精脫水、浸蠟、包埋和切片，分別進(jìn)行HE和尼氏染色。

1.2.6 腦組織ROS、Ca2+免疫熒光染色

再灌注24 h 后麻醉大鼠，立即取腦置于-80 ℃速凍后直接包埋制成冰凍切片。用預(yù)冷的PBS清洗切片3遍于室溫稍晾干，再用組化筆圍組織畫(huà)圈，后分別滴加DHE探針和Fluo-4探針，37 ℃水浴孵育30 min，隨后用PBS清洗3遍，再用DAPI 染液室溫孵育5 min，PBS清洗5 遍，滴加抗熒光淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡采集圖像并利用 Image J進(jìn)行分析。

1.2.7 腦組織TUNEL免疫熒光染色

再灌注24 h后麻醉大鼠，進(jìn)行心臟灌注后取腦置于4%多聚甲醛中固定24 h，后置于20%～30%蔗糖中脫水，OCT包埋制備冰凍切片。根據(jù)TUNEL染色試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，PBS洗3 遍后用DAPI 染色液染色，再用PBS清洗3 遍后封片。采用熒光顯微鏡觀察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，Image J計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取3張圖片計(jì)算細(xì)胞凋亡率。TUNEL細(xì)胞陽(yáng)性率（%）=TUNEL細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)/DAPI細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鈣離子濃度

再灌注24 h后取各組大鼠缺血半暗帶區(qū)域腦皮質(zhì)組織并制備成單細(xì)胞懸液，用Fluo-4探針37 ℃孵育30 min，PBS清洗2遍，后用緩沖液重懸上機(jī)檢測(cè)。

1.2.9 分光光度法檢測(cè)血清中MDA和SOD水平

再灌注24 h后麻醉大鼠，開(kāi)腹腔通過(guò)腹主動(dòng)脈采血離心收集血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入待測(cè)樣品和相應(yīng)試劑后置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)各組吸光度值，帶入相應(yīng)公式計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)含量。

1.2.10 Western blot 和免疫組織化學(xué)檢測(cè)Wnt5a、Frizzled-2 和P-CaMKⅡ的表達(dá)水平

再灌注24 h 后取腦組織缺血半暗帶區(qū)域勻漿并裂解，取蛋白上清BCA測(cè)定蛋白濃度、變性、上樣（30 μg）、電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶或5%BSA 封閉2 h，Wnt5a（1∶1000）、Frizzled-2（1∶1000）、P-CaMKⅡ（1∶4000）和CaMKⅡ（1∶25 000）抗體，4 ℃搖床孵育過(guò)夜；TBST洗膜，山羊抗兔二抗室溫孵育2 h；TBST洗膜，滴加曝光液顯影并拍照。取各組腦組織石蠟切片脫蠟至水、抗原修復(fù)、血清封閉，一抗4 ℃過(guò)夜、二抗避光孵育15 min；用DAB液顯色后行細(xì)胞核復(fù)染、脫水封片置于顯微鏡下觀察。

1.2.11 鈣含量顯色法測(cè)定腦組織鈣離子濃度

再灌注24 h將大鼠處死后取腦組織，將IP區(qū)腦組織剪切成細(xì)小的碎片，按試劑盒說(shuō)明書(shū)加入待測(cè)樣品和相應(yīng)試劑后置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)各組吸光度值，帶入相應(yīng)公式計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較多組間差異，采用T多重比較法比較兩組間差異。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路介導(dǎo)腦缺血再灌注引起的鈣超載

Western blotting 檢測(cè)Frizzled-2 敲低效果和Wnt/Ca2+信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，與Sham組相比，NC組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），Knock down組Frizzled-2蛋白表達(dá)降低約50%（Plt;0.001，圖1A、B）；I/R組Wnt5a、P-CaMKⅡ和Frizzled-2的表達(dá)增高。與I/R 組相比，Knock down 組Wnt5a、P-CaMK Ⅱ 和Frizzled-2 的表達(dá)均降低（圖1C～F）。鈣含量顯色法檢測(cè)各組腦組織鈣離子濃度的結(jié)果顯示，與 Sham 組相比，I/R組鈣離子濃度明顯增高；與 I/R 組相比，NC 組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），Knock down 組鈣離子濃度降低（圖1G）。HE結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組組織結(jié)構(gòu)分布紊亂，可見(jiàn)大量空泡，染色不均，胞核深染。與I/R組相比，NC 組無(wú)明顯變化，Knock down組病理?yè)p傷可見(jiàn)明顯改善（圖1H）。

2.2 腦缺血再灌注模型建立過(guò)程中局部腦血流的變化

I/R組（圖2A）和SI組（圖2B）大鼠局部腦血流檢測(cè)結(jié)果顯示，插線后兩組rCBF均迅速降至初始值的10%～20%，2 h 后拔出栓線血流恢復(fù)至初始值的50%～60%。在缺血的2 h內(nèi)血流保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，但 I/R 組血流恢復(fù)速度慢于SI組。

2.3 SI對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積和神經(jīng)缺損評(píng)分的影響

采用TTC 染色檢測(cè)大鼠腦梗死體積，結(jié)果顯示Sham組未見(jiàn)明顯梗死區(qū)域，I/R組出現(xiàn)明顯的梗死區(qū)（Plt;0.001），而SI組梗死體積較I/R組明顯減?。≒lt;0.001，圖3A、B）。Sham組未出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙癥狀，神經(jīng)功能評(píng)分為0。而I/R組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分明顯高于Sham 組（Plt;0.001），SI組癥狀明顯輕于I/R組（Plt;0.01，圖3C）。

2.4 SI對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織病理學(xué)形態(tài)

HE染色和尼氏染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞輪廓清晰，未見(jiàn)壞死細(xì)胞，尼氏小體、細(xì)胞核及核仁清晰可見(jiàn)。I/R組大鼠腦組織排列不規(guī)則，染色不均勻，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，尼氏小體縮小，分布紊亂，細(xì)胞核較小甚至消失。而SI組病理?yè)p傷有所改善（圖4）。

2.5 SI對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織胞內(nèi)鈣離子的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組鈣離子熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，SI組鈣離子熒光強(qiáng)度介于Sham組和I/R組之間（Plt;0.001，圖5A、B）。流式細(xì)胞術(shù)呈現(xiàn)相同趨勢(shì)（Plt;0.05，圖5C、D）。

2.6 SI對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響

與Sham組相比，I/R組ROS熒光強(qiáng)度、MDA水平增加，SOD水平下調(diào)（Plt;0.001）。與I/R組相比，SI組ROS熒光強(qiáng)度、MDA水平降低，SOD上調(diào)（Plt;0.001，圖6）。

2.7 SI對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

免疫熒光結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率明顯增高，與I/R組相比，SI組凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率降低（Plt;0.001，圖7）。

2.8 SI 對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后Wnt/Ca2+信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路相關(guān)蛋白Wnt5a、Frizzled-2 和PCaMKⅡ表達(dá)明顯升高（Plt;0.001）；與I/R組相比，SI 組Wnt5a、Frizzled-2、P-CaMKⅡ蛋白的表達(dá)量均降低（Plt;0.05，圖8A）。免疫組化結(jié)果也顯示，與Sham組相比，I/R組Wnt5a、Frizzled-2 和P-CaMKⅡ蛋白表達(dá)水平明顯升高；與I/R組相比，SI組Wnt5a、Frizzled-2和P-CaMKⅡ蛋白的表達(dá)量均降低（圖8B）。

3 討論

CIRI的病理生理機(jī)制復(fù)雜，尚未完全清晰，目前認(rèn)為涉及以下多種可能的機(jī)制：氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載及血腦屏障破壞等［19-23］。這些發(fā)病機(jī)制互為因果、共同作用，推動(dòng)CIRI的發(fā)生發(fā)展。既往研究表明細(xì)胞內(nèi)鈣超載在CIRI的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用［24， 25］，也是多數(shù)情況下細(xì)胞死亡的最后共同通路［26］，但目前對(duì)于探討鈣超載在腦缺血再灌注中的具體機(jī)制及通過(guò)改善鈣超載來(lái)治療CIRI的研究甚少。本研究首次證實(shí)了Wnt/Ca2+信號(hào)介導(dǎo)腦缺血再灌注鈣超載損傷，并發(fā)現(xiàn)SI 可能通過(guò)減輕Wnt/Ca2+信號(hào)通路減輕CIRI。

SI主要分為游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷兩種形式，其中糖苷不具有活性，需要在腸道菌群的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚攒赵l(fā)揮療效［27， 28］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SI以120 mg·kg-1·d-1的劑量治療腦缺血再灌注大鼠表現(xiàn)出較好的療效［13］。因此，本研究沿用此劑量以灌胃的給藥方式對(duì)大鼠進(jìn)行術(shù)前干預(yù)，采用改良版線栓法大腦中動(dòng)脈堵塞模型誘導(dǎo)大鼠CIRI模型，在模型構(gòu)建過(guò)程中采用 LDF 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠rCBF的動(dòng)態(tài)變化。LDF可以準(zhǔn)確地體現(xiàn)腦內(nèi)的微循環(huán)灌注情況［29］，也可作為判斷MCAO模型構(gòu)建成功的依據(jù)［30］。本研究監(jiān)測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，I/R 組插線后rCBF驟降，拔線后rCBF恢復(fù)緩慢且恢復(fù)速度明顯慢于SI組，提示MCAO模型構(gòu)建成功且SI預(yù)處理可改善再灌注初期血流的低灌注情況。

SI 是大豆中的異黃酮類(lèi)化合物的總稱，因其抗氧化、抗炎作用目前多被用于抗癌研究［31-33］。研究表明，SI 在減輕CIRI 中也發(fā)揮一定的作用［34］，但對(duì)于SI 在CIRI鈣超載層面的研究較少。為探討SI是否能夠減輕腦缺血再灌注誘導(dǎo)的鈣超載，本研究采用免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，結(jié)果顯示I/R組胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，SI 組鈣離子降低，提示 SI 可改善腦缺血再灌注誘導(dǎo)的鈣超載。

Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路一種非典型 Wnt 通路，在早期胚胎發(fā)育、癌癥進(jìn)展、神經(jīng)間通訊、炎癥反應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［35-38］。Wnt/Ca2+ 通路激活可誘使細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 濃度升高并可活化Ca2+ 敏感信號(hào)成分，在介導(dǎo)細(xì)胞Ca2+ 超載、氧化應(yīng)激和凋亡等病理過(guò)程中扮演重要角色。既往研究探討缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的鈣超載機(jī)制主要集中在再灌注后鈉-鈣交換體的功能失調(diào)、內(nèi)源性兒茶酚胺的增多導(dǎo)致的鈣通道開(kāi)放增加和生物膜損傷通透性增加［19，39，40］，而較少關(guān)注Wnt/Ca2+信號(hào)通路在細(xì)胞內(nèi)鈣代謝中起的作用。既往關(guān)于Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路在缺血再灌注損傷的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞中Wnt5a和Frizzled-2表達(dá)增加，細(xì)胞中的鈣離子含量增多，抑制細(xì)胞中Frizzled-2表達(dá)后，缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞中鈣離子含量顯著下降［41］；也有研究發(fā)現(xiàn)肝組織缺血再灌注損傷后Wnt5a和Frizzled-2表達(dá)上調(diào)，靶向抑制肝細(xì)胞Frizzled-2表達(dá)能減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平［42］。這提示我們?cè)谌毖俟嘧p傷中，Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路會(huì)被激活，而靶向抑制Frizzled-2可以減輕缺血再灌注損傷。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)腦創(chuàng)傷可通過(guò) Wnt5a/Frizzled-2信號(hào)通路導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載，靶向抑制Frizzled-2能抑制腦創(chuàng)傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度過(guò)度增加［43］。這提示腦組織也存在 Wnt/Ca2+ 通路，而靶向抑制 Frizzled-2 可以減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。因此本研究為驗(yàn)證 Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路在大鼠腦缺血再灌注后是否被激活，同樣選擇靶向抑制 Frizzled-2以達(dá)到抑制Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路的作用。Wnt/Ca2+ 信號(hào)主要由Wnt5a 和 Frizzled-2 啟動(dòng)，且CaMKⅡ是Wnt/Ca2+信號(hào)通路的標(biāo)志物［44］，故本研究采用 Western blotting 檢測(cè)Wnt5a、Frizzled-2和 P-CaMKⅡ的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示成功敲低了Frizzled-2，且與 Sham 組相比，I/R組這些蛋白的表達(dá)均增高，說(shuō)明在CIRI中 Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路被上調(diào)，而敲低Frizzled-2后，這些蛋白的表達(dá)水平又有所降低，敲低Frizzled-2可以有效地抑制 Wnt/Ca2+信號(hào)通路。HE結(jié)果顯示，與I/R組相比，Knock down 組的病理?yè)p傷明顯減輕，再次說(shuō)明了 Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路確實(shí)參與腦缺血再灌注這一病理過(guò)程且抑制 Wnt/Ca2+信號(hào)通路可以減輕腦缺血再灌注病理?yè)p傷。采用鈣含量顯色法檢測(cè) IP 區(qū)鈣離子濃度結(jié)果顯示與 I/R 組相比，Knock down 組的鈣離子濃度降低，表明Wnt/Ca2+信號(hào)通路介導(dǎo)腦缺血再灌注鈣超載損傷。我們猜測(cè)SI改善腦缺血再灌注誘導(dǎo)的鈣超載與調(diào)控Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路有關(guān)。為驗(yàn)證該想法，本實(shí)驗(yàn)采用Western blotting檢測(cè)了SI 組Wnt5a、Frizzled-2 和P-CaMKⅡ的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與I/R組相比，SI組這些蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明SI 可以抑制Wnt/Ca2+信號(hào)通路，SI 可能通過(guò)抑制Wnt/Ca2+信號(hào)通路減輕腦缺血再灌注引起的鈣超載。

胞內(nèi)鈣超載可引起自由基堆積、線粒體功能障礙及穩(wěn)態(tài)失衡，激活神經(jīng)元一氧化氮合酶以形成一氧化氮，激活磷脂酶和蛋白酶降解細(xì)胞脂質(zhì)及相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白，還可激活核酸酶引起DNA損傷［45］，并導(dǎo)致羥基自由基等生成增加，進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激，最終引起神經(jīng)元凋亡或壞死［46］。超氧化物陰離子具有濃度水平極低、活性較高、壽命短、易轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，且是機(jī)體最先產(chǎn)生的ROS，可直接反應(yīng)腦組織氧化應(yīng)激水平。MDA可間接反應(yīng)氧化應(yīng)激損傷程度，而SOD是機(jī)體抗氧化的關(guān)鍵酶。為探討SI 是否能夠影響機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，本研究采用免疫熒光和分光光度法分別檢測(cè)腦組織中超氧化物陰離子和血清中MDA和SOD的含量，結(jié)果顯示I/R組超氧化物陰離子和MDA水平明顯升高，SI組相應(yīng)指標(biāo)均降低，SOD水平呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，提示SI可改善腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。進(jìn)一步采用免疫熒光檢測(cè)各組的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示SI組細(xì)胞凋亡數(shù)量較 I/R組明顯減少，提示SI 可減少腦缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明，SI對(duì)腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激水平變化的影響趨勢(shì)與鈣離子水平變化一致。為探討SI是否會(huì)減輕腦缺血再灌注后的梗死體積和病理?yè)p傷，本研究采用TTC、HE和Nissl染色分別檢測(cè)各組的腦梗死體積和病理?yè)p傷程度，結(jié)果也顯示 SI 可減少腦缺血再灌注導(dǎo)致的腦梗死體積和病理?yè)p傷程度，提示 SI 可減輕CIRI。然而，本研究的結(jié)果大部分都局限于表型實(shí)驗(yàn)，后續(xù)仍需進(jìn)一步探討 SI 抑制 Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路減輕CIRI的具體分子機(jī)制。

綜上所述，腦缺血再灌注會(huì)激活 Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路并介導(dǎo)缺血再灌注后的鈣超載，SI 可能通過(guò)抑制Wnt/Ca2+ 信號(hào)通路減輕腦缺血再灌注誘導(dǎo)的鈣超載減輕CIRI。

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（編輯：郎 朗）

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