摘要：研究濕地松轉(zhuǎn)錄組編碼序列的密碼子使用偏好性，明確密碼子使用頻率，探究濕地松異源表達(dá)受體的最佳選擇，為濕地松分子育種奠定基礎(chǔ)。以篩選到的13 932條濕地松轉(zhuǎn)錄組編碼序列（coding sequence，CDS）為研究對(duì)象，利用CodonW 1.4.2、EMBOSS在線分析程序、MEGA 7等軟件進(jìn)行濕地松密碼子組成分析，計(jì)算同義密碼子相對(duì)使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）、不同位置GC含量和有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENc）等指標(biāo)，同時(shí)展開中性繪圖分析和偏倚性分析等，系統(tǒng)地探究影響密碼子偏好性的主導(dǎo)因素，從而篩選出最優(yōu)密碼子，并選擇合適的遺傳轉(zhuǎn)化受體。研究結(jié)果表明，濕地松轉(zhuǎn)錄組密碼子中的平均GC含量為43.72%，其中GC1含量最大，為50.78%，其次是GC2和GC3，含量分別為40.68%和39.71%，表明不同位置的堿基組成存在差異，第3位上是A/U堿基的概率更大；ENc值在25.94～61.00之間，平均值為53.58，CAI均值較低，為0.20，表明密碼子整體偏好性較弱。中性繪圖、PR2-plot繪圖和ENc-GC3s關(guān)聯(lián)分析結(jié)果均表明，自然選擇是大多數(shù)濕地松基因密碼子存在使用偏好性的主要原因；以高頻率高表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)篩選出25個(gè)濕地松最優(yōu)密碼子，均以A/U結(jié)尾。通過將濕地松與大腸桿菌、擬南芥、煙草、酵母菌、水稻等5種生物的密碼子使用頻率進(jìn)行對(duì)比分析得出，煙草、擬南芥是濕地松基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化功能驗(yàn)證的理想選擇。綜上所述，濕地松轉(zhuǎn)錄組密碼子整體偏好性弱，第3位堿基偏好使用A/U，自然選擇是L/glweODKoYek9h8Qj5+dlZ7Sw06tEPlLdpOzyfAu84=其產(chǎn)生密碼子偏好性的關(guān)鍵原因，煙草、擬南芥可作為濕地松基因異源表達(dá)的理想植物受體。結(jié)果有利于濕地松功能基因的異源表達(dá)，也為進(jìn)一步研究濕地松遺傳背景及高產(chǎn)脂分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：濕地松；轉(zhuǎn)錄組；最優(yōu)密碼子；密碼子使用偏好性

中圖分類號(hào)：S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）18-0050-09

收稿日期：2023-10-12

基金項(xiàng)目：江西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃一般項(xiàng)目（編號(hào)：20203BBFL63058）；江西省自然科學(xué)基金青年基金（編號(hào)：20212BAB215013）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32160385）；江西省林業(yè)廳林業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)（編號(hào)：202311）。

作者簡(jiǎn)介：胡 蓉（1997—），女，云南大理人，碩士研究生，主要從事林木遺傳改良研究。E-mail：hurong089@163.com。

通信作者：易 敏，博士，副教授，主要從事濕地松遺傳改良研究。E-mail：yimin6104@163.com。

密碼子（codon）又稱遺傳密碼，由mRNA上相鄰的3個(gè)核苷酸構(gòu)成，在中心法則翻譯過程中作為遺傳信息和蛋白質(zhì)之間的重要紐帶，起決定性作用^［1］。生物體內(nèi)共有64種密碼子，除色氨酸（Trp）和甲硫氨酸（Met）外，存在同一氨基酸由2個(gè)及以上密碼子編碼的簡(jiǎn)并現(xiàn)象，對(duì)應(yīng)的編碼密碼子被稱為同義密碼子^［2-3］。同義密碼子在沒有選擇壓力和突變基因偏倚作用的情況下使用頻率是一致的^［4］。但生物體為適應(yīng)環(huán)境變化，會(huì)偏好優(yōu)選適合自身生長(zhǎng)發(fā)育的最優(yōu)密碼子，同義密碼子間選擇使用頻率存在差別，有密碼子偏好性（codon usage bias，CUB）^［5］。密碼子偏好性的產(chǎn)生受到GC含量、tRNA豐度、選擇壓力、突變壓力、基因表達(dá)水平等多種因素的影響^［6-7］。因此，針對(duì)植物的密碼子偏好性進(jìn)行分析，探尋密碼子使用偏好模式在不同物種間的異同，有助于進(jìn)一步了解物種相關(guān)基因的功能表達(dá)機(jī)制、親緣關(guān)系和進(jìn)化歷程，也可為基因工程研究中最優(yōu)密碼子、最適外源宿主選擇提供一定的理論依據(jù)。

目前，針對(duì)植物密碼子偏好性的研究報(bào)道不少，但在針葉樹種中的研究仍以利用葉綠體基因組進(jìn)行分析較為常見，如思茅松［Pinus kesiya var. langbianensis （A.Chev ） Gaussen］^［8］、高山松（P. densata Mast.）^［9］、云南油杉（Keteleeria evelyniana Mast.）^［10］等。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展與大量轉(zhuǎn)錄組序列的公布為基于轉(zhuǎn)錄組的密碼子相關(guān)研究提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。目前，已在樟樹［Cinnamomum camphora （L.） Presl］、橄欖［Canarium album （Lour.） Rauesch.］^［11］、杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）等多種植物上均有報(bào)道，但在松屬（Pinus）中僅在馬尾松^［12］上有相關(guān)報(bào)道，在濕地松上尚未見有相關(guān)方面的研究。

濕地松（Pinus elliottii Engelm）原產(chǎn)于美國(guó)東南部，是松科（Pinaceae）松屬（Pinus）速生常綠針葉喬木，20世紀(jì)30年代引入我國(guó)，由于適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)快、松脂質(zhì)量好以及松香不易結(jié)晶、不易凝固、雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)人工栽培面積最大的外來產(chǎn)脂樹種^［13-14］。松脂是由松樹樹脂道的泌脂細(xì)胞產(chǎn)生的一種天然樹脂，由揮發(fā)性的松節(jié)油（單萜和倍半萜）和非揮發(fā)性的松香（雙萜）等萜類化合物組成，被廣泛應(yīng)用于紙漿材、食品、農(nóng)藥、生物燃料和醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域，是林業(yè)中最重要的產(chǎn)品之一^［15］。針對(duì)濕地松的高產(chǎn)脂遺傳改良，目前已先后進(jìn)行了種源試驗(yàn)、采脂工藝、產(chǎn)脂相關(guān)性狀遺傳變異、松脂成分等方面的研究^［16-20］，并取得了一定的進(jìn)展。松脂產(chǎn)量及品質(zhì)等為重要經(jīng)濟(jì)性狀，同時(shí)又屬于多基因控制的數(shù)量性狀，易受環(huán)境影響，導(dǎo)致僅利用常規(guī)育種手段往往難以滿足定向培育高產(chǎn)脂濕地松新品種的要求，因此，亟需運(yùn)用現(xiàn)代林木生物技術(shù)來彌補(bǔ)常規(guī)育種技術(shù)的不足，充分挖掘和利用濕地松基因資源中的有利變異，加速高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)濕地松新品種的選育進(jìn)程。盡管濕地松的分子研究起步較遲，但在濕地松TPS基因的克隆^［21］、松脂合成基因的挖掘^{［13，22］}、松脂性狀的關(guān)聯(lián)分析^［23］等方面已取得一定的研究進(jìn)展。但目前濕地松轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍存在瓶頸，基因功能的驗(yàn)證只能借助其他異源物種，導(dǎo)致其表達(dá)效率高低無法預(yù)測(cè)。因此，了解濕地松和轉(zhuǎn)化物種在同義密碼子使用頻率上的差異有利于提高濕地松功能基因在異源物種中的表達(dá)效率，從而為濕地松基因功能驗(yàn)證提供重要的理論依據(jù)。

本研究以不同產(chǎn)脂量濕地松單株通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的13 932條序列為研究對(duì)象，利用軟件CodonW和在線網(wǎng)站EMBOSS Explore進(jìn)行密碼子偏好性分析^［11］，獲得最優(yōu)密碼子，明確密碼子使用頻率，探究濕地松異源表達(dá)受體的最佳選擇，對(duì)進(jìn)一步揭示濕地松的遺傳背景及其高產(chǎn)脂機(jī)制具有重要作用，旨在為后續(xù)濕地松分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 序列獲取與篩選

2016年4、7、10月分別從江西省吉安市白云山林場(chǎng)（27.22°N，115.13°E）1990年造林的濕地松家系測(cè)定林中選擇高、中、低產(chǎn)脂量的單株木質(zhì)部材料，用液氮速凍后，交由北京百邁客生物信息科技有限公司利用Illumina Hiseq 2000平臺(tái)開展RNA-seq測(cè)序^［13］。對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾后，采用Trinity進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本序列拼接，并將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），登錄號(hào)為PRJNA723669。對(duì)所獲取的CDS序列使用perl程序^［24］進(jìn)行篩選，每條CDS序列應(yīng)滿足堿基數(shù)為3的倍數(shù)，且長(zhǎng)度≥300 bp，最終篩選得到含有13 932條序列的fasta文件。

1.2 密碼子使用偏好性參數(shù)指標(biāo)

利用CodonW 1.4.2軟件 （http：//codonw.sourceforge.net）對(duì)濕地松進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組密碼子使用偏好性參數(shù)分析。密碼子的偏好程度可由RSCU值體現(xiàn)，當(dāng)值為0時(shí)，密碼子不存在偏好性，當(dāng)RSCU>1時(shí)，表示偏好性強(qiáng)，為高頻密碼子，反之則使用頻率較低，為低頻密碼子。ENc是用于衡量基因中偏好程度的參8735f70668aeb4dc1b2a5d930344006a數(shù)，能將偏好程度作數(shù)據(jù)化呈現(xiàn)。ENc的取值范圍在20～61之間，低于35則認(rèn)為密碼子使用具有高偏好性。密碼子適應(yīng)性指數(shù)（codon adaptative index，CAI）介于0～1之間，越接近1，表明偏好性越強(qiáng)，反之則偏好性弱。同時(shí)利用軟件計(jì)算密碼子偏好指數(shù)（codon bias index，CBI）和最優(yōu)密碼子使用頻率（frequency of optimal codons，F(xiàn)op）等參數(shù)。使用EMBOSS Explore在線軟件中的CUSP程序（https：//www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/）分別計(jì)算濕地松轉(zhuǎn)錄組序列中密碼子第1、2、3位GC含量，同義密碼子第3位的GC含量及平均GC含量（GC1、GC2、GC3、GC3s、GCall）。

1.3 中性繪圖分析

以GC3值為橫坐標(biāo)，GC12［GC12=（GC1+GC2）/2］為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖。若回歸系數(shù)趨于1，表示以突變?yōu)橹鲗?dǎo)因素，反之趨于0，則以自然選擇為主導(dǎo)因素。

1.4 ENc-GC3s關(guān)聯(lián)分析

以GC3s值、ENc值分別為橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖。設(shè)置ENc=2+GC3s+29/［GC3s²+（1－GC3s）²］的ENc理論值標(biāo)準(zhǔn)曲線^［25-26］。標(biāo)準(zhǔn)曲線可反映僅受突變壓力影響時(shí)，GC3s值及ENc值變化情況。密碼子偏好性主要受堿基突變影響時(shí)，每個(gè)序列的實(shí)際ENc值都將落在標(biāo)準(zhǔn)理論曲線附8735f70668aeb4dc1b2a5d930344006a近或曲線上，反之ENc值遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，則表示自然選擇或其他因素在密碼子偏好性中起主導(dǎo)作用^［27］。同時(shí)根據(jù)吉德娟等在霸王（Sarcozygium xanthoxylon Bunge）中使用的ENc頻率分布統(tǒng)計(jì)方法［ENc比值=（ENc理論值-ENc實(shí)際值）/ENc理論值］^［28］判斷在密碼子偏好性中起主導(dǎo)作用的因素，若ENc比值>0.05或ENc比值<-0.05，自然選擇在密碼子偏好性中起到主要作用，反之，則是堿基突變?yōu)橹饕绊懸蛩亍?/p>

1.5 偏倚分析（PR2-plot分析）

以G3s/（G3s+C3s）和A3s/（A3s+U3s）分別作橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，其中A3s、U3s、C3s、G3s分別表示同義密碼子第3位堿基為A、U、C、G堿基的含量。每條序列代表1個(gè)散點(diǎn)，序列點(diǎn)與中心點(diǎn)的矢量距離表示偏好性程度和方向。根據(jù)偏倚規(guī)則，2條互補(bǔ)鏈間不存在偏倚情況即在無突變和自然選擇影響時(shí)^［29］，A=U、C=G，處于散點(diǎn)圖的中心位置。

1.6 最優(yōu)密碼子的分析

利用高頻率高表達(dá)的方法篩選出最優(yōu)密碼子，即ENc值較高的為低表達(dá)基因，反之為高表達(dá)基因。將ENc值從小到大排序，頭尾各篩選序列數(shù)的10%，建立高低表達(dá)基因組，計(jì)算其相對(duì)使用度的差值ΔRSCU，將ΔRSCU≥0.08定義為高表達(dá)密碼子；以RSCU值判定高低頻密碼子，即值大于1，被定義為高頻密碼子。若同時(shí)兼具RSCU值>1且其高低表達(dá)基因組RSCU差值（ΔRSCU）≥0.08，則為最優(yōu)密碼子。

1.7 密碼子頻率分析

密碼子使用頻率比值能在一定程度上反映物種間密碼子偏好的差異大小，在基因的異源表達(dá)分析中起到重要的參考作用。2種生物可以通過比較密碼子使用頻率，分析偏好性差異的大小，從而得出是否適合進(jìn)行物種間異源表達(dá)的結(jié)論。濕地松密碼子使用頻率利用在線程序CUSP計(jì)算，其余物種的數(shù)據(jù)源自Codon Usage Database在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.kazusa.or.jp/codon/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕地松密碼子組成分析

篩選整合序列后用軟件進(jìn)行參數(shù)計(jì)算。結(jié)果（表1）表明，全部CDS序列的GC1為50.78%、GC2為40.68%、GC3為39.71%，密碼子3個(gè)位置的GC含量為GC1>GC2>GC3。平均GC值為43.72%，GC含量在40%～50%之間的CDS序列有10 384條，占總序列的74.53%，GC3含量小于50%的序列有12 205條，占序列總數(shù)的87.60%，濕地松轉(zhuǎn)錄組的U3s（41.40%）>A3s（36.41%）>G3s（26.31%）>C3s（21.89%）。表明濕地松密碼子不同位置的堿基組成存在差異，第3位上是A/U堿基的概率更大。

理論ENc值范圍為20～61，數(shù)值越小表示同義密碼子選擇范圍越小、偏好性越強(qiáng)，反之，當(dāng)ENc=61時(shí)，均勻使用密碼子，偏好性較弱。偏好性強(qiáng)弱界定標(biāo)準(zhǔn)為ENc=35^{［25，30］}，濕地松密碼子序列的ENc值在25.94～61.00之間，平均值為53.58（表1），ENc≤35的基因有296個(gè)，大于35的基因有13 637個(gè)，各占比2.12%和97.88%，其中248個(gè)ENc值為61個(gè)，說明濕地松轉(zhuǎn)錄組CDS的密碼子偏好性整體水平偏低，僅有少數(shù)序列具有較強(qiáng)密碼子偏好性。CAI值較低，介于0.09～0.43之間，均值為0.20，更趨向0，進(jìn)一步驗(yàn)證了偏好性弱、基因表達(dá)水平較低的觀點(diǎn)。CBI值介于-0.37～0.44之間，F(xiàn)op值介于0.21～0.71之間。

2.2 同義密碼子相對(duì)使用度分析

采用CodonW分析濕地松的RSCU值，結(jié)果（圖1）顯示，RSCU≥1的密碼子有32個(gè)（UGA、UAA、UUA、UCU、UCA、UUG、UUU、UGG、UAU、GCA、GCU、UGU、GAU、GAA、GGA、GGU、CAU、CCA、CCU、AGA、AGU、AUU、ACA、AAA、AGG、CUU、AUG、AAU、CAA、ACU、GUU、GUG），其中結(jié)尾為U和A的密碼子分別為15個(gè)和12個(gè)，以G結(jié)尾的密碼子僅有5個(gè)，無以C結(jié)尾的密碼子，說明濕地松密碼子第3位出現(xiàn)A/U堿基的頻率更高，是濕地松偏好的密碼子。

2.3 中性繪圖分析（Neutrality Plot）

開展中性繪圖分析，是為了深入探究導(dǎo)致濕地松出現(xiàn)密碼子使用偏好性的主要原因，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄組GC3含量的分布范圍較廣，在6.93%～96.21%之間，而GC12含量的分布范圍相對(duì)較窄，在25.00%～83.02%之間。GC12和GC3含量的決定系數(shù)r²=0.130 2，相關(guān)性較弱，這表明密碼子受突變壓力的影響程度有限。中性圖的回歸系數(shù)（斜率）表示突變的壓力^［31］。通過對(duì)濕地松進(jìn)行中性繪圖分析得線性回歸方程y=0.137 3x+40.283，斜率為0.137 3，即突變壓力對(duì)濕地松轉(zhuǎn)錄組密碼子偏好的影響占比僅為13.73%，不足50%，其余占比為自然選擇和其他因素產(chǎn)生的影響。由此可知，濕地松的密碼子使用偏好性是自然選擇壓力主導(dǎo)的，突變因素是次要影響因素。

2.4 ENc-GC3s關(guān)聯(lián)分析

ENc-GC3s分析結(jié)果（圖3）顯示，基因點(diǎn)大多偏離理論值，也有少數(shù)點(diǎn)分布在曲線上或附近。為精準(zhǔn)評(píng)估實(shí)際值與理論值間的差異，進(jìn)行ENc比值計(jì)算，并繪制頻數(shù)分布圖，結(jié)果（圖4）顯示，ENc比值分布在-3.73～0.72之間，分布在-0.05～0.05之間的基因僅占總數(shù)的5.30%。ENc比值在-0.45～-0.35之間的分布占比達(dá)到峰值，大多數(shù)基因的比值集中在-0.55～-0.15之間，ENc實(shí)際值和理論值之間差異較大，大多數(shù)理論值高于實(shí)際值，表明自然選擇主要影響密碼子偏好性，堿基突變的影響不是關(guān)鍵性的，與Neutrality Plot分析結(jié)果相同。

2.5 偏倚分析（PR2-plot分析）

從偏倚分析結(jié)果（圖5）可以看出，4個(gè)區(qū)域內(nèi)序列點(diǎn)分布不均勻，在垂直方向上，中線下方的基因數(shù)量要多于上方；在水平方向上，大部分基因位于中線右側(cè)。由此表明，濕地松密碼子中第3位堿基組成頻率U>A、G>C。若基因點(diǎn)均勻分布且堿基使用頻率相等，則突變?yōu)橹鲗?dǎo)因素，反之則為圖中情況，非均勻分布，表明自然選擇壓力可能在濕地松密碼子使用偏好中起主導(dǎo)作用，突變壓力是次要因素。

2.6 轉(zhuǎn)錄組最優(yōu)密碼子分析

以濕地松轉(zhuǎn)錄組各基因的ENc值作衡量依據(jù)，將數(shù)值從小到大排列，首尾各選10%的基因構(gòu)建高表達(dá)和低表達(dá)基因組樣本，進(jìn)行RSCU值計(jì)算分析（表2），密碼子的ΔRSCU≥0.08時(shí)，被認(rèn)定為高表達(dá)密碼子，共有29個(gè)。若某密碼子RSCU=1，表示該密碼子無使用偏性，反之則存在偏好性。有30個(gè)密碼子RSCU>1（圖1），為高頻密碼子。同時(shí)若密碼子兼具高頻（RSCU值>1）和高表達(dá)（ΔRSCU≥0.08）的特點(diǎn)，則被認(rèn)定為最優(yōu)密碼子^［32］，分別有GCA、GCU、UGU、GAU、GAA等25個(gè)。其中第3位堿基為A的密碼子有10個(gè)、為U的有15個(gè)，沒有以C/G結(jié)尾的最優(yōu)密碼子。這與濕地松密碼子組成分析所得的密碼子第3位偏好使用A/U的結(jié)論相一致。

2.7 密碼子使用頻率分析

同一密碼子在2個(gè)物種間的使用頻率比介于0.5～2.0內(nèi)，則認(rèn)為物種間對(duì)于該密碼子的使用存在不顯著的偏好差異。對(duì)濕地松轉(zhuǎn)錄組中密碼子使用頻率與Condon Usage Datebases數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的大腸桿菌（Escherichia coli，Ec）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）、煙草（Nicotiana sylvestris L.，Nt）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae，Sc）、水稻（Oryza sativa L.，Os）密碼子使用頻率進(jìn)行比較，得出的結(jié)果（圖6）顯示，與2種微生物相比，濕地松密碼子偏好性與大腸桿菌中存在較大差異的密碼子有9個(gè)，與酵母菌僅有3個(gè)密碼子存差，可見酵母菌真核表達(dá)系統(tǒng)更適合濕地松異源表達(dá)，但仍可能需要對(duì)部分密碼子如GGA、CGA、CGG進(jìn)行改造和優(yōu)化。在與模式植物的比較中，濕地松與雙子葉植物煙草和擬南芥的使用特性差異小，比值范圍分別為0.68～1.44和0.55～1.54；與單子葉植物水稻相比密碼子使用偏好性有12個(gè)密碼子存在差異?？梢姡瑹煵?、擬南芥是濕地松基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化功能驗(yàn)證的理想選擇。

3 討論與結(jié)論

植物基因和基因組中密碼子偏好性現(xiàn)象常見，生物體在長(zhǎng)期進(jìn)化和自然適應(yīng)過程中不是隨機(jī)使用同義密碼子，而是對(duì)特定密碼子的使用具有傾向性，形成密碼子偏好性，分析密碼子偏好性對(duì)于揭示物種或基因的起源、進(jìn)化關(guān)系及突變方式有重要意義^［31］。密碼子偏好性分析在精細(xì)調(diào)控基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、蛋白折疊等方面有所助力^［33］，除此之外，對(duì)研究基因重組、預(yù)測(cè)基因功能、發(fā)現(xiàn)新基因、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物、探究合適的異源表達(dá)系統(tǒng)等也有參考價(jià)值^［34-35］。借助遺傳轉(zhuǎn)化體系成熟的模式生物進(jìn)行基因的異源表達(dá)是基因功能驗(yàn)證的常用方法之一。在異源表達(dá)和遺傳轉(zhuǎn)化研究過程中，需要對(duì)目標(biāo)基因及受體的密碼子偏好特點(diǎn)進(jìn)行分析，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行目標(biāo)基因的優(yōu)化和定向改造，否則可能會(huì)由于密碼子使用偏好性的差異導(dǎo)致出現(xiàn)基因甲基化、低水平表達(dá)或基因沉默等現(xiàn)象^［36］。

植物間存在密碼子偏好性差異，在僅受突變壓力和自然選擇影響的情況下，堿基組成的差異被認(rèn)定為偏好性模式存在差異的重要原因。GC含量是反映堿基組成的重要指標(biāo)，且可反映方向性突變的強(qiáng)弱。第3位堿基擺動(dòng)引起的同義突變不會(huì)導(dǎo)致氨基酸種類發(fā)生變化，其堿基突變受到的選擇壓力亦小于第1、2位堿基，因此，GC3s常用作密碼子偏好性分析的指標(biāo)之一^［37］。本研究篩選出濕地松轉(zhuǎn)錄組的13 932條CDS序列，利用軟件進(jìn)行參數(shù)分析得出，GC3s值為37.38%，表明濕地松總體上偏好使用第3位堿基為A/U的密碼子，與高山松^［9］、云南油杉^［10］、朝倉(cāng)花椒（Zanthoxylum piperitum DC. var. inerme Makino）^［38］的分析結(jié)果相一致，也符合大多雙子葉植物的密碼子組成規(guī)律^［39］。若選擇密碼子第3位堿基偏好為G/C的物種作濕地松基因的異源表達(dá)受體則需要適當(dāng)進(jìn)行密碼子定向優(yōu)化。

在密碼子偏好性分析中，ENc值被認(rèn)為是最具有參考價(jià)值的指標(biāo)之一^［30］。本研究以ENc值為基礎(chǔ)，按高頻高表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)篩選最優(yōu)密碼子，在濕地松基因組中確定了25個(gè)最優(yōu)密碼子，其中以A結(jié)尾的密碼子有10個(gè)，U結(jié)尾的密碼子有15個(gè)，無以G/C結(jié)尾的最優(yōu)密碼子，充分說明濕地松偏好選用A/U結(jié)尾的密碼子。這與在大黃（Rheum officinale Baill.）^［40］和香樟^［41］等植物上的研究結(jié)果相類似。研究結(jié)果也進(jìn)一步表明，異源基因同義密碼子第3位堿基偏好為A/U時(shí)，在濕地松中可能會(huì)獲得高表達(dá)效率，_{zttDf/P5YeP8eaGo9loD4w==}但還需要進(jìn)一步開展試驗(yàn)驗(yàn)證。前人研究認(rèn)為，在排除自然環(huán)境壓力的前提下，突變壓力的方向會(huì)影響密碼子堿基及末尾堿基的組成^{［11，36］}，由此推斷，濕地松在進(jìn)化過程中密碼子可能從GC到AU方向發(fā)生突變。

突變和自然選擇是影響密碼子偏好性的主要因素，本研究進(jìn)行濕地松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的中性繪圖、PR2-plot繪圖和ENc-GC3s關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果均表明，大多數(shù)濕地松基因密碼子存在使用偏好性的關(guān)鍵原因是自然選擇，少數(shù)基因受突變壓力的影響。這與在香樟和石榴上進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組基因密碼子的分析結(jié)果^［24］相一致。在異源表達(dá)研究中，密碼子偏好性分析能為外源基因和受體匹配提供參考，選擇密碼子偏好模式差異小的物種作異源受體，對(duì)于外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯效率的提高及獲取高表達(dá)量有益^［42］。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，濕地松與擬南芥、煙草密碼子之間的偏好性差異較小，密碼子使用頻率比值處于0.5～2.0范圍內(nèi)，雙子葉植物擬南芥、煙草均可作濕地松基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的受體，進(jìn)一步表明濕地松基因可能更適合在擬南芥、煙草等雙子葉模式植物中進(jìn)行功能基因的驗(yàn)證。如朱靈芝和李榮分別將馬尾松萜類化合物合成途徑關(guān)鍵酶基因PmDXR和PmDXS轉(zhuǎn)入擬南芥中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)擬南芥的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）活性、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS）活性以及葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量較野生型均有提高^［43-44］。

在后續(xù)研究中，可進(jìn)一步與其他針葉樹種密碼子進(jìn)行比較，精細(xì)分析密碼子的區(qū)域分布，且可針對(duì)萜類合成途徑中的某一關(guān)鍵酶基因做密碼子偏好性分析，不僅能了解物種間的遺傳進(jìn)化規(guī)律，還能為基因的外源表達(dá)選擇最佳宿主。此外，現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)在不斷的發(fā)展，將其與濕地松生長(zhǎng)、松脂組分和產(chǎn)脂量等相關(guān)轉(zhuǎn)錄本間密碼子偏好性結(jié)合進(jìn)行分析，能夠?yàn)闈竦厮筛弋a(chǎn)脂性狀形成的遺傳機(jī)制研究提供重要的依據(jù)^［11］。

本研究初步分析濕地松轉(zhuǎn)錄組的密碼子偏好性及其異源表達(dá)模式、表達(dá)載體的選擇，為之后濕地松基因功能驗(yàn)證尋找合適的轉(zhuǎn)化載體，逐步完善濕地松的遺傳轉(zhuǎn)化體系提供了參考，也對(duì)后續(xù)利用基因工程技術(shù)進(jìn)行濕地松高產(chǎn)脂遺傳改良具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究表明，濕地松基因組平均GC含量、GC3值、GC3s的值分別為43.72%、39.71%、37.37%。整體密碼子偏好性較弱，偏好以A/U堿基結(jié)尾的密碼子。利用高頻率高表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn)選出25個(gè)最優(yōu)密碼子，均以A/U結(jié)尾。中性繪圖、PR2-plot繪圖分析和ENc-GC3s關(guān)聯(lián)分析結(jié)果均表明，濕地松基因組偏好性受多種因素共同影響，其中自然選擇是主要原因。酵母菌真核表達(dá)系統(tǒng)較大腸桿菌而言，更適合濕地松基因的異源表達(dá)，遺傳轉(zhuǎn)化體系較為完善的模式植物煙草是濕地松基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化功能驗(yàn)證的理想選擇。

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