摘要 ［目的］以絲瓜（Luffa ssp.）品種“徐綠一號”的未授粉子房為試驗材料，分析不同因素對類胚體形成的影響。［方法］設置L16（215）正交試驗分析子房發(fā)育階段、4 ℃預冷處理、35 ℃黑暗熱激處理、TDZ、6-BA、ABA、NAA、2，4-D對絲瓜離體子房培養(yǎng)獲得類胚體的影響。［結(jié)果］不同因素對子房片的發(fā)育過程具有不同的效果，其中采集當天開放的雌花、4 ℃預冷處理、在MS培養(yǎng)基中添加0.04 mg/L TDZ對子房片的類胚體形成具有促進作用，添加0.04 mg/L 2，4-D對絲瓜子房類胚體形成具有抑制作用，但可以促進子房片生根；另外預冷處理與TDZ、TDZ與雌花采集時間、4 ℃預冷和ABA的兩兩交互作用對絲瓜類胚體的形成也具有顯著影響。［結(jié)論］有效形成絲瓜子房類胚體途徑：當天采集子房+4 ℃預冷處理+0.04 mg/L TDZ。

關鍵詞 絲瓜；離體子房；類胚體；單倍體；TDZ

中圖分類號 S642.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）21-0044-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.21.009

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Induction Study on the Pathway of Embryoid Formation in Ovary Culture of Luffa ssp.

YAN Le-long， HUANG Yao， NI Wei-chen et al

（Nanjing Agricultural University （Changshu） New Rural Development Research Institute Co.， Ltd.， Suzhou，Jiangsu 215500）

Abstract ［Objective］To analyze the effects of different factors on embryoid formation using unpollinated ovaries of Luffa ssp. cultivar ‘Xulv No.1’ as experimental material. ［Method］ An L16（215） orthogonal test was set up to analyze the effects of ovary collection time， 4 ℃ cold pretreatment， 35 ℃ dark heat shock treatment， TDZ hormone， 6-BA hormone， ABA hormone， NAA hormone and 2，4-D hormone on embryoid formation in vitro cultured Luffa ssp. ovaries. ［Result］Different factors had different effects on the development process of ovary slices. Among them， collecting female flowers that opened on the same day and adding TDZ hormone to MS medium had a promoting effect on embryoid formation in ovary slices. However， 2，4-D hormone had an inhibitory effect on embryoid formation in Luffa ssp. ovaries but could promote rooting of ovary slices. In addition， the interaction between 4 ℃ cold pretreatment and TDZ hormone and between TDZ hormone and female flower collection time also had a significant effect on embryoid formation in Luffa ssp.. ［Conclusion］The effective way to form embryoids from Luffa ssp. ovaries is： collecting ovaries on day of flowering+4 ℃ cold pretreatment+0.04 mg/L TDZ hormone induction in vitro.

Key words Luffa ssp.;In vitro ovary;Embryoid;Haploid；TDZ

基金項目 江蘇省自主創(chuàng)新項目（CX202204）；常熟市科技項目（CN20-2204）。

作者簡介 顏樂龍（1998—），男，湖南茶陵人，碩士，從事單倍體誘導技術(shù)研究。*通信作者，教授，博士，從事單倍體育種研究。

收稿日期 2023-12-17

絲瓜（Luffa aegyptiaca Miller）為葫蘆科（Cucurbitaceae）絲瓜屬（Luffa Mill.）一年生草本植物，其嫩瓜含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、氨基酸等物質(zhì)，具有保健和美容的作用［1］；老瓜或藤蔓可用藥，亦可加工，具有特殊的藥用和工業(yè)價值［2］。絲瓜在我國南北均有種植，主要栽培種有普通絲瓜和有棱絲瓜2個類型［3］。近年來，絲瓜市場需求量不斷增大，對絲瓜不同品種的需求也在擴大。

由于F1代的雜合特性，導致F1品種具有較高的產(chǎn)量和活力。因此市場的經(jīng)濟品種都是F1，而F1代通過不同純系品種雜交而來。目前獲得純系的方法有2個，分別為傳統(tǒng)自交和DH技術(shù)［4］。而傳統(tǒng)的多年自交獲得自交系成本高、時間長，這種育種方式限制了現(xiàn)代絲瓜育種的需求［5］。而通過單倍體誘導技術(shù)結(jié)合染色體加倍技術(shù)獲得基因型純合的雙單倍體（DH）能縮短育種時間［6］。

創(chuàng)制葫蘆科作物單倍體的方式主要有3種：輻射花粉授粉結(jié)合胚培養(yǎng)技術(shù)、離體子房/胚珠培養(yǎng)、花藥/花粉培養(yǎng)［7］。通過這些手段已在甜瓜［8-9］、黃瓜［10］、南瓜［11］、西瓜［12］等作物上獲得了單倍體。且在甜瓜作物上已有利用單倍體誘導技術(shù)培育新品種的報道［13］。單倍體育種能在較短的育種周期內(nèi)純化性狀，加速育種進程。因此，構(gòu)建絲瓜離體子房再生培養(yǎng)體系能加速絲瓜新品種培育。

筆者借鑒其他葫蘆科作物（黃瓜、甜瓜等）的離體子房培養(yǎng)體系，以“徐綠1號”為材料，研究不同因素如子房發(fā)育階段［9］、4 ℃預冷［10］、35 ℃黑暗熱激以及不同種類激素對絲瓜離體子房培養(yǎng)獲得類胚體和根形成的影響［14］，旨在構(gòu)建一條有效的絲瓜離體子房培養(yǎng)獲得類胚體途徑，為后續(xù)的絲瓜離體子房獲得單倍體研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為“徐綠1號”，為常熟地方品種“徐筒玉”高代自交系和自選品系“LZ88”高代自交系雜交一代［15］，由南農(nóng)大（常熟）新農(nóng)村發(fā)展研究院有限公司提供。于2022年9—11月種植于常熟市農(nóng)科所的連棟大棚內(nèi)。

1.2 正交試驗設計

試驗涉及8個因素：子房發(fā)育階段、35 ℃黑暗熱激、4 ℃預冷處理、激素TDZ、6-BA、NAA、ABA、2，4-D，每個因素選取2水平進行 L16（215）正交試驗，共16個處理（表 1），每個處理 3 次重復。試驗數(shù)據(jù)采用 R語言進行統(tǒng)計分析和繪圖。

根據(jù)表1的16種處理進行隨機試驗。于絲瓜植株的第二朵雌花盛開時開始采集子房，選擇當天開花的雌花（圖1b）或前1 d開始采集子房（圖1a）。根據(jù)不同處理的要求對子房進行4 ℃預冷（1 d）處理；消毒處理：洗潔精清洗表面絨毛，流水沖洗15 min，75%乙醇消毒30 s，1 %的次氯酸鈉溶液中浸泡8～9 min（視子房大小調(diào)整浸泡時間），無菌水反復沖洗4～5次，最后用無菌濾紙吸干表面水分；對消毒好的子房進行橫向切割，子房切片厚度為1～2 mm（圖1d），子房切片接種在已添加不同激素種類的MS培養(yǎng)基（4.74 g/L MS+蔗糖30 g/L+瓊脂2.5 g/L，pH 5.8～6.0）上進行培養(yǎng)；之后進行35 ℃黑暗熱激或不進行處理（其中黑暗熱激處理3 d），然后轉(zhuǎn)入25 ℃、光照強度2 000 lx、16 h/8 h（光/暗）條件下培養(yǎng)［6］。

類胚體發(fā)生比例=類胚發(fā)生子房數(shù)量 /外植體總數(shù)

再生根形成比例=形成根的子房數(shù) /子房培養(yǎng)數(shù)

1.3 再生根的倍性鑒定

子房切片培養(yǎng)60 d后，在超凈工作臺上進行取根，然后使用流式細胞儀鑒定再生根的倍性。

流式細胞儀鑒定倍性：取少量幼嫩根組織，置于預冷的培養(yǎng)皿中，加入緩沖液A，并用解剖刀將材料切碎，置于冰上繼續(xù)裂解。裂解10 min后使用40 μm細胞篩網(wǎng)進行過濾，加入碘化丙錠和RNase，避光。使用BECKMAN流式細胞儀進行倍性鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 子房切片產(chǎn)生類胚體和根

黑暗熱激影響子房切片表面顏色。對采集的子房進行切片培養(yǎng)后，按照不同處理組合對外植體放置35 ℃暗環(huán)境或直接放置光照環(huán)境下進行培養(yǎng)。在接種培養(yǎng)3～7 d后，子房切片表面開始形成“隆起物”（圖2a、2b），此時子房開始啟動發(fā)育，而形成的“隆起物”為開始發(fā)育的類胚體。但不同培養(yǎng)條件下的子房切片表面的顏色不同，其中直接放置于自然光環(huán)境下的子房切片呈深綠色（圖2a），而經(jīng)過35 ℃熱激暗培養(yǎng)的子房切片呈黃綠色（圖2b）。培養(yǎng)15 d后，類胚體漸漸形成串狀的形態(tài)（圖2d）。將含有類胚體的切片轉(zhuǎn)至胚分化培養(yǎng)基上后，出現(xiàn)了黃化、發(fā)育停止的現(xiàn)象。培養(yǎng)60 d后，接種在含有0.75 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基的子房切片開始逐漸出現(xiàn)根（圖2c）。

2.2 不同處理對根形成和類胚體的影響

由圖3可知，不同處理類胚體和根的形成都有顯著差異。其中處理①、處理②、處理⑦、處理⑧、處理B11、處理B12、處理B13、處理B14對根的形成具有積極影響；其余處理對根的形成幾乎沒有效果（圖3a）。不同處理對類胚體的形成也有不同的效果，其中處理③對類胚體形成促進效果最佳（圖3b）。同時，觀察（圖3a）發(fā)現(xiàn)，不同處理在類胚體的形成與根的形成上呈現(xiàn)相反的分布，且二者的相關系數(shù)為-0.49。為了解造成這種分布的差異，對各個因素進行了單因素方差分析。

2.3 不同因素對根形成和類胚體形成的影響

由圖4和圖5可知，子房發(fā)育階段（圖4、5a）、4 ℃預冷（圖4、5b）、35 ℃黑暗熱激（圖4、5c）、基礎培養(yǎng)基中添加TDZ（圖4、5d）、6-BA（圖4、5e）、ABA（圖4、5f）、NAA（圖4、5g）和2，4-D（圖4、5h）激素對絲瓜子房生根影響具有差異，只有添加0.04 mg/L 2，4-D激素的培養(yǎng)基可以有效誘導絲瓜生根，其他未添加2，4-D的培養(yǎng)基較難誘導形成根系。因此，在絲瓜子房離體培養(yǎng)過程中MS培養(yǎng)基中添加2，4-D能有效誘導根系的產(chǎn)生。

在類胚體形成過程中，4 ℃預冷、培養(yǎng)基中添加NAA和2，4-D對該過程均有顯著影響。在培養(yǎng)基中添加生長素類激素（NAA、2，4-D）和ABA激素對類胚體的誘導具有負向作用，而TDZ對類胚體的誘導具有正向作用。對比（圖4h）和（圖5h），發(fā)現(xiàn)2，4-D激素在根誘導和類胚體誘導上存在負相關關系。此外4 ℃預冷也能提高類胚體誘導效率。

2.4 不同因素的交互作用對根形成和類胚體形成的影響

除探究單因素對絲瓜子房切片的影響外，還分析了不同因素間的交互作用（圖6）；發(fā)現(xiàn)5個因素（子房發(fā)育階段、4 ℃預冷、TDZ激素、ABA激素、35 ℃暗培養(yǎng)）之間的交互作用對子房片的發(fā)育具有影響。在根發(fā)育過程中，子房的采集時間與35 ℃熱激對子房片的發(fā)育具有顯著影響（圖6a）。在類胚體形成過程中（子房發(fā)育階段、TDZ激素、4 ℃預冷、ABA激素）多個因素之間的交互作用顯著。其中，4 ℃預冷因素在顯著的兩兩交互項中出現(xiàn)3次，TDZ激素出現(xiàn)2次，這提示這二者是關鍵因素，因此在改進試驗中要考慮這二者之間的因素水平的關系。子房外植體類胚體的誘導是通過子房發(fā)育形成單倍體或雙單倍體植株的第一步，其誘導效果影響后續(xù)再生植株形成的效率。絲瓜類胚體誘導的途徑：雌花開花當天采集子房+4 ℃預冷處理+ 0.04 mg/L TDZ。

2.5 再生根的倍性鑒定

只有添加0.75 mg/L 2，4-D的處理（處理①、②、⑦、⑧、B11、B12、B13、B14）才能誘導產(chǎn)生根系，其中處理②的根系是從子房切片中心長出，故產(chǎn)生單倍體根系可能性更大。對處理②全部取樣，其他7個處理隨機挑選10個子房切片切取根系進行倍性鑒定，并以正常“徐綠一號”二倍體的根作為對照。流式細胞儀分析結(jié)果顯示，在對照（圖7a）中首個呈現(xiàn)正態(tài)分布的峰熒光強度為 100左右，故單倍體的首個呈現(xiàn)正態(tài)分布的峰熒光強度則為50左右（圖7c），在鑒定樣本中出現(xiàn)了單倍體、二倍體以及不同類型的混倍體，其中只有處理②得到了2株單倍體。

3 討論

離體培養(yǎng)時胚囊的發(fā)育狀態(tài)是子房發(fā)育形成胚的關鍵因素，胚囊接近成熟或完全成熟時才具有較高的潛力開始發(fā)育［16］。Zou等［17-18］比較了黃瓜雌花不同發(fā)育階段對胚形成的影響，發(fā)現(xiàn)完全發(fā)育的胚囊子房（開花當天）是雌核發(fā)育最優(yōu)的外植體，這與西瓜離體子房培養(yǎng)一致 。同樣在南瓜和冬瓜的離體子房研究中，也認為使用處于花期的子房可獲得最高的胚誘導率［11］。該研究設置了2種不同的子房采集期（開花前1 d和開花當天），結(jié)果表明開花當天采集的子房形成的類胚體數(shù)量顯著高于開花前1 d，這與前人的研究結(jié)果一致。

一些非生物因素的脅迫作用如冷脅迫、暗培養(yǎng)、饑餓處理對離體子房培養(yǎng)具有刺激作用［5］。脅迫處理可以改變配子體發(fā)育途徑進入孢子體發(fā)育途徑以形成單倍體的胚或植株［19］。4 ℃預冷處理不僅可以促進離體子房的類胚體發(fā)生數(shù)量［20］，也可以提高小孢子培養(yǎng)的胚形成效率［21］。Deng等［10］認為子房4 ℃預冷4 d可有效提高黃瓜子房離體培養(yǎng)中胚的發(fā)生數(shù)量；而Pazuki等［20］認為甜菜花序預冷7 d可有效提高體胚發(fā)生數(shù)量。而該研究發(fā)現(xiàn)，預冷1 d再進行離體培養(yǎng)，類胚體的發(fā)生數(shù)量顯著提高。

該研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中0.04 mg/L TDZ對絲瓜類胚體的形成具有顯著的積極效應，Diao等［22］認為TDZ對胚的形成具有正向作用。Deng等［10］研究發(fā)現(xiàn)黃瓜子房在MS+0.04 mg/L TDZ可以直接形成再生植株。在南瓜離體子房培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)基中附加0.04～0.06 mg/L TDZ能誘導離體子房直接產(chǎn)生再生植株。此外，Kurtar等［11，14］認為在誘導培養(yǎng)基中增加低劑量的TDZ可明顯提高南瓜和黃瓜子房形成類胚體的數(shù)量。2，4-D也被用于離體子房培養(yǎng)的誘導培養(yǎng)基［23-24］。Metwally等［25］認為在培養(yǎng)基中添加1～5 mg/L 2，4-D可以提高西葫蘆子房培養(yǎng)的再生植株數(shù)量。Rakha等［26］研究發(fā)現(xiàn)2，4-D可以促進花藥培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)形成再生植株的數(shù)量。相反，Kielkowska等［27］研究發(fā)現(xiàn)2，4-D會抑制胚的形成。該研究結(jié)果表明，2，4-D抑制類胚體的形成但促進根的發(fā)育。因此，2，4-D是導致該研究中生根率與類胚體率呈負相關（-0.49）的原因。

不同因素的交互作用也在一些研究中有過報道［10，12］ 。Zou等［12］研究發(fā)現(xiàn)基因型和誘導培養(yǎng)基之間的交互作用對類胚體的形成具有重要影響。而Deng等［10］也認為4 ℃預冷和TDZ激素之間的交互作用顯著，這與該研究結(jié)果一致。

該研究并未在試驗中獲得完整的植株（類胚體在轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基后黃化死亡），認為類胚體的死亡原因：①類胚體的質(zhì)量不佳（約2/3類胚體顏色呈黃綠色），可能與培養(yǎng)基的滲透壓有關；②基因型依賴性，研究僅使用了1種絲瓜品種，可能是“徐綠一號”對于離體培養(yǎng)的過程不敏感；③絲瓜本身對離體培養(yǎng)具有抑制性。這可能是目前沒有通過孤雌生殖誘導成功絲瓜單倍體的原因。該研究獲得了2個進展，即通過鑒定再生根為單倍體，表明通過離體子房培養(yǎng)可以啟動絲瓜卵細胞啟動發(fā)育，并分化形成了單倍體的器官；子房發(fā)育階段、TDZ、4 ℃預冷對類胚體的形成影響較大。

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