氣相色譜-質(zhì)譜法測定食用植物油中多種植物甾醇含量

摘要 ［目的］建立氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）同時測定食用油中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇含量的方法。［方法］樣品選用氫氧化鉀-乙醇皂化、正己烷萃取、濃縮、衍生化后以正己烷定容，采用GC-MS選擇離子掃描模式（SIM），外標(biāo)法定量。［結(jié)果］β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇的線性范圍為5～500 μg/mL，菜油甾醇的線性范圍為2.5～250.0 μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999，檢出限為0.05～0.10 mg/kg，定量限為0.1～0.3 mg/kg，加標(biāo)回收率為80.5%～107.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.3%～9.8%。［結(jié)論］該方法操作簡單、高效、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于食用植物油樣品中β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇含量的測定。

關(guān)鍵詞 氣相色譜-質(zhì)譜法；食用植物油；植物甾醇；含量測定

中圖分類號 TS 227 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）22-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.22.037

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Determination of Various Phytosterols in Edible Vegetable Oils by Gas Chromatography-mass Spectrometry

HUANG He-he

（Fujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002）

Abstract ［Objective］A method for simultaneous determination of β-sitosterol，stigmasterol，campesterol and brassicasterol in edible oil was established by gas chromatography-mass （GC-MS）.［Method］Sample was saponified by potassium hydroxide-ethanol solution，n-hexane extraction，concentration，derivatization，and then diluted with n-hexane.GC-MS was used to select ion scanning mode （SIM） and external standard method was used for quantification.［Result］ There were good linear relationships for β-sitosterol，stigmasterol，brassicasterol in 5-500 μg/mL，and campesterol in 2.5-250.0 μg/mL，respectively.Linear correlation coefficients（R2）were greater than 0.999.Limits of detection were 0.05-0.10 mg/kg and limits of quantification were 0.1-0.3 mg/kg，respectively.Adding standard recovery rate was 80.5%-107.8%，relative standard deviation （RSD） was 2.3%-9.8%.［Conclusion］This method is easy to operate，efficient，highly sensitive，and has good repeatability，which is suitable for the determination of β-sitosterol，stigmasterol，campesterol and brassicasterol contents in edible vegetable oil samples.

Key words Gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）;Edible vegetable oil;Phytosterol;Content determination

植物甾醇，又被稱為植物固醇，在各類植物中普遍存在，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用在食品、藥品領(lǐng)域。植物甾醇在結(jié)構(gòu)、生化特性上均與膽固醇相似，但又略有不同^［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇能夠降低人體血清膽固醇（TC）與低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，可以有效防治心血管疾病并加速膽固醇的代謝降解。人體并不能自主合成植物甾醇，但在植物源品中植物甾醇是生物活性成分，人體可從日常飲食中獲得所需的植物甾醇。根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部公告2010年第3號規(guī)定，在除嬰幼兒食品外，其他各類食品均可以使用植物甾醇，且食用量≤2.4 g/d^［3］；《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》中推薦植物甾醇攝入量在0.9 g/d^［4］。

食用植物油作為人們?nèi)粘５氖秤檬称?，其中含有豐富的植物甾醇、礦物質(zhì)、不飽和脂肪酸等，同時也是植物甾醇含量較為豐富的食品之一。因此，在日常飲食中，可以通過控制食用油中植物甾醇的含量，來控制所需人群每日植物甾醇的攝入量，從而指導(dǎo)人們合理膳食。目前，常見的植物甾醇分析方法主要有薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法（GC-MS/MS）、液相色譜法（LC）、液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法 （LC-MS/MS）等^［5-17］。其中TLC前處理繁雜，操作性不強；GC測定植物甾醇的靈敏度低、重現(xiàn)性差；LC存在干擾大、響應(yīng)差等；GC-MS/MS和LC-MS/MS雖然具有干擾小、重現(xiàn)性好、靈敏度高等特點，但儀器價格高，不利于方法的推廣。常見食用植物油中的植物甾醇主要為β-谷甾醇、菜油甾醇、谷甾醇和菜籽甾醇4種，占總甾醇的50%～90%。筆者結(jié)合當(dāng)前的研究，選用GC-MS，通過優(yōu)化相關(guān)參數(shù)，建立便捷、高效、靈敏的分析方法，為有效測定食用油中4種常見植物甾醇的含量提供技術(shù)支持，也為指導(dǎo)人們合理膳食提供保障。

1 材料與方法

1.1 儀器 7890N/5977氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent科技有限公司）；毛細管色譜柱（HP-5MS，30 m×250 μm×0.25 μm，美國Agilent科技有限公司）；分析天平BT224S；WA12通用水浴槽（德國維根技術(shù)有限公司）；MS3 basic 旋渦混勻器（德國艾卡集團）；EVA50氮吹儀（北京POLYTECH儀器有限公司）；Heraeus Multifuge X3R離心機（美國Thermo Fisher科技有限公司）。

1.2 試劑 β-谷甾醇、豆甾醇購于上海安譜（ANPEL）實驗科技有限公司；菜籽甾醇、菜油甾醇購于美國Standford Chemicals 公司；N，O-雙（三甲基硅）三氟乙酰胺（BSTFA）-三甲基氯硅烷（TMCS）（V∶V=99∶1）；無水乙醇、異辛烷、丙酮、氫氧化鉀、無水硫酸鈉均為分析純。4種植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品信息見表1。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件。毛細管色譜柱為HP-5MS彈性石英毛細管色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；進樣量1 μL；進樣口溫度320 ℃；分流模式為分流進樣；分流比為5∶1；載氣為高純度氦氣（純度≥99.999%）；載氣流速1 mL/min；GC與MS接口溫度300 ℃。升溫程序：起始溫度150 ℃，保持2 min；以15 ℃/min 升溫至300 ℃，保持8 min；以10 ℃/min，升溫至320 ℃，保持8 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件。EI離子源溫度230 ℃; 能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度290 ℃；溶劑延遲時間12 min；Scan掃描范圍為40～450 amu；掃描模式為SIM模式分段掃描。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取10 mg（精確至0.01 mg）β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇，加入少量異辛烷與丙酮溶劑溶解，配制成濃度為1 mg/mL的植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，密封保存。標(biāo)準(zhǔn)溶液系列工作液以正己烷為稀釋溶劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取各類食用油樣品0.1 g（精確至0.000 1 g）至10 mL試管中，加入2 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液5 mL，渦旋1 min，置60 ℃水浴鍋中水浴加熱45 min，取出，冷卻至室溫。加入2～3 mL蒸餾水，再準(zhǔn)確移取2 mL正己烷，渦旋1 min，靜置待分層，取上層有機溶液，重復(fù)提取2次，合并有機相，用去離子水洗滌至中性，過無水硫酸鈉進行脫水，經(jīng)氮吹儀濃縮近干后，加入100 μL BSTFA- TMCS（V∶V=99∶1）80 ℃衍生化20 min，正己烷定容至1 mL，渦旋混勻后，過0.22 μm有機濾膜上機測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化。

采用GC-MS對4種植物甾醇進行全掃描，然后，根據(jù)質(zhì)譜圖分別對4種植物甾醇各個化合物的碎片離子進行選擇，以相對豐度較高、質(zhì)量數(shù)較大的離子碎片作為待測物的特征目標(biāo)監(jiān)測離子。選定監(jiān)測離子后，采用SIM模式（選擇離子掃描）對目標(biāo)化合物進行定性定量分析，以提高靈敏度、減少干擾。4種植物甾醇的保留時間及定性、定量離子見表2。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化。

4種待分析的目標(biāo)物均為弱極性化合物，根據(jù)相似相溶的原理，可選擇弱極性色譜柱作為分離柱，同時結(jié)合當(dāng)前相關(guān)研究，該研究選用5%苯基-甲基聚硅氧烷作為固定相的毛細管色譜柱，對4種目標(biāo)物進行檢測分析。同時，通過優(yōu)化合理的升溫程序，以達到將化合物分離的目的。通過試驗表明，HP-5MS彈性石英毛細管色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）在優(yōu)化的條件下，菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇具有良好的響應(yīng)和分離度。4種植物甾醇總離子流圖見圖1，4種植物甾醇特征目標(biāo)監(jiān)測離子質(zhì)譜圖如圖2所示。

2.1.3 皂化條件的優(yōu)化。

植物甾醇沸點高，較難氣化，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測，需要結(jié)合皂化、衍生前處理技術(shù)。植物甾醇進行皂化反應(yīng)，通常選用氫氧化鉀-甲醇或氫氧化鉀-乙醇，該研究比較了氫氧化鉀-甲醇與氫氧化鉀-乙醇分別作為植物甾醇進行皂化的出峰情況。結(jié)果表明，采用氫氧化鉀-甲醇進行皂化時，存在較多的雜質(zhì)，對試驗造成干擾；采用氫氧化鉀-乙醇進行皂化時，峰形勻稱，且具有良好的分離度與靈敏度。

該研究在選用氫氧化鉀-乙醇后，比較了不同溫度與時間下的皂化效果。分別將皂化溫度設(shè)置為室溫、40 ℃、60 ℃和80 ℃，在不同溫度下分別進行15、30、45、60 min反應(yīng)時間的比較，通過分析16個組別的結(jié)果情況，結(jié)果表明食用植物油樣品在4個不同溫度下反應(yīng)45 min，在室溫和40 ℃條件下，油脂溶解性較差，對目標(biāo)化合物產(chǎn)生較大干擾，在60、80 ℃條件下進行衍生，脂肪在熱乙醇中具有較好的溶解性，能夠有效地降低對目標(biāo)化合物的干擾。結(jié)合除雜效果及節(jié)能減排，該研究最終選擇60 ℃作為衍生溫度。通過對不同皂化溫度及反應(yīng)時間的對比，該研究最終選擇采用氫氧化鉀-乙醇作為皂化試劑，皂化時間為45 min，反應(yīng)溫度為60 ℃。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 線性范圍與檢出限、定量限。

取4種植物甾醇系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照該研究優(yōu)化的儀器條件進行測定分析。橫坐標(biāo)為目標(biāo)物各組分濃度，縱坐標(biāo)為目標(biāo)物各組分的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程。結(jié)果表明（表3），4種植物甾醇在線性范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）的規(guī)定，檢出限S/N（信噪比）≥3，定量限S/N≥10。4種目標(biāo)化合物的檢出限為0.05～0.10 mg/kg，定量限為0.1～0.3 mg/kg。

2.2.2 方法回收率和精密度。

按照該研究建立的方法進行加標(biāo)回收試驗。選用本底值含量適中，便于進行加標(biāo)回收試驗的2個食用油樣品（橄欖油、芝麻油）分別在3個不同添加濃度水平下進行加標(biāo)回收試驗，每種食用油樣品的每個水平濃度設(shè)置6個平行。結(jié)果表明（表4），菜籽甾醇的回收率為80.2%～104.1%，RSD為4.9%～9.8%；菜油甾醇的回收率為80.3%～102.1%，RSD為2.3%～7.7%;豆甾醇的回收率為81.5%～107.8%，RSD為2.9%～7.1%;β-谷甾醇的回收率為80.5%～104.1%，RSD為2.5%～9.0%。

2.3 實際樣品測定

利用該研究建立的測定方法進行實際樣品的測定。對菜籽油、大豆油、橄欖油、花生油、山茶油、調(diào)和油、玉米油、芝麻油等40批次食用油進行4種植物甾醇的含量測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表5），不同批次食用油所含4種植物甾醇的含量差異較大，其中菜籽甾醇在藤椒油中含量為794.8 mg/kg；菜油甾醇在藤椒油中含量為2 452.1 mg/kg；豆甾醇、β-谷甾醇在調(diào)和油中含量較高，豆甾醇含量為554.5 mg/kg，β-谷甾醇含量為5 738.8 mg/kg。

3 結(jié)論

該研究通過優(yōu)化色譜條件、質(zhì)譜條件及前處理條件，建立了GC-MS測定食用植物油中4種植物甾醇含量的方法。該方法經(jīng)熱皂化，正己烷渦旋提取，BSTFA-TMCS硅烷化，外標(biāo)法定量。通過添加回收的方式考察了方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果表明，該研究建立的方法回收率高、重現(xiàn)性好、靈敏度高、便捷高效，適合于食用油中植物甾醇含量的分析測定。

參考文獻

［1］

常翠青.植物甾醇與心血管疾病的研究進展和應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.中國食物與營養(yǎng)，2016，22（6）：76-80.

［2］ 曹玫，歐陽露.植物甾醇的抗腫瘤作用及其機制研究進展［J］.實用藥物與臨床，2015，18（9）：1104-1107.

［3］ BAUMGARTNER S，RAS R T，TRAUTWEIN E A，et al.Plasma fat-soluble vitamin and carotenoid concentrations after plant sterol and plant stanol consumption：A meta-analysis of randomized controlled trials［J］.European journal of nutrition，2016，56（3）：909-923.

［4］ 佚名.中華人民共和國衛(wèi)生部公告2010年第3號［J］.中國食品衛(wèi)生雜志，2010，22（2）：167.

［5］ 劉海霞，仇農(nóng)學(xué)，王峰，等.蘋果籽油中植物甾醇含量的薄層色譜-分光光度法測定［J］.中國油脂，2008，33（11）：76-79.

［6］張喜金，魏鮮娥，蘇昭侖，等.氣相色譜法測定小麥胚芽油、大豆油和大蒜油中植物甾醇的組成和含量［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2016，7（8）：3388-3392.

［7］ 趙晶，石馨，胡美杰，等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定牛乳中β-谷甾醇［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2015，38（1）：22-25.

［8］ 鐘冬蓮，莫潤宏，沈丹玉，等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用植物油中β-谷甾醇含量［J］.中國油脂，2015，40（2）：95-97.

［9］ 李濤，李琪，林麗云，等.氣相色譜-質(zhì)譜法測定熱帶水果中植物甾醇的含量［J］.熱帶作物學(xué)報，2018，39（12）：2486-2490.

［10］ 楊春英，劉學(xué)銘，池建偉，等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析茶枝柑籽油脂肪酸和不皂化物組成［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2017，8（11）：4418-4423.

［11］ 王東暉，張玥，范蓓，等.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析不同產(chǎn)地豆類中植物甾醇形態(tài)及含量［J］.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2017（3）：21-27，37.

［12］ 陳月曉，何濤，唐凌軒，等.氣相色譜法同時測定食品中的膽固醇和植物甾醇［J］.食品科學(xué)，2016，37（14）：180-183.

［13］ 周蕾.氣相色譜-質(zhì)譜法測定植物蛋白飲料中植物甾醇和膽固醇［J］.中國釀造，2021，40（5）：177-181.

［14］ 毛文岳，段向東，邵琳雅，等.牡丹花粉植物甾醇的分析及其與油菜花粉的比較［J］.中國食物與營養(yǎng)，2020，26（11）：35-37.

［15］ 陳其釗，林燕純，劉志鵬，等.三種糖品中植物甾醇的測定［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2020，46（22）：238-244.

［16］ LIU S S，HU H Y，YU Y P，et al.Simultaneous determination of tocopherols，phytosterols，and squalene in vegetable oils by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Food analytical methods，2021，14（8）：1567-1576.

［17］ POKKANTA P，SOOKWONG P，TANANG M，et al.Simultaneous determination of tocols，γ-oryzanols，phytosterols，squalene，cholecalciferol and phylloquinone in rice bran and vegetable oil samples［J］.Food chemistry，2019，271：630-638.