關(guān)鍵詞：豐水期；長蕩湖；水質(zhì)評價；微生物群落

中圖分類號：X171.4 文獻標(biāo)志碼：B

前言

微生物是水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在維持水生態(tài)系統(tǒng)的功能和健康中起著重要作用，同時微生物也是反映水環(huán)境健康的重要指標(biāo)。張建波等認(rèn)為后生浮游動物可作為湖泊水環(huán)境變化的指示性生物。由于微生物能將對生態(tài)環(huán)境造成威脅的有機物和有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可以維護生態(tài)平衡的無機物。如枯草芽孢桿菌是一類革蘭氏陽性菌，其分泌的多種高活性胞外酶，能快速分解并吸收水環(huán)境中的有機物，以達(dá)到改善水質(zhì)的效果。因此全面調(diào)查長蕩湖微生物群落組成是極有必要的。

長蕩湖位于江蘇省常州市。長蕩湖南北長約15.5km，東西寬約9km，湖泊總面積85.31km²，平均水深1.1m。隨著長蕩湖周邊農(nóng)業(yè)、漁業(yè)的快速發(fā)展以及過度城鎮(zhèn)化，導(dǎo)致湖泊水體嚴(yán)重富營養(yǎng)化，水質(zhì)日漸惡化。

目前有關(guān)長蕩湖的研究主要聚焦于藻類、動物的群落結(jié)構(gòu)特征以及沉積物污染風(fēng)險等方面，但鮮有全面研究長蕩湖微生物群落結(jié)構(gòu)組成。鑒于豐水期雨量充沛，水樣采集方便且豐水期長蕩湖的水體污染更為嚴(yán)重。因此此研究基于2021年6月長蕩湖采樣數(shù)據(jù)，采用2種水質(zhì)評價方法綜合評價豐水期長蕩湖水質(zhì)現(xiàn)狀，并運用高通量測序技術(shù)分析長蕩湖微生物群落結(jié)構(gòu)特征，為控制長蕩湖水體污染和生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1采樣點設(shè)置與采樣時間

根據(jù)長蕩湖地形輪廓，在長蕩湖南部、中部、東部和北部共設(shè)置4個采樣點。4個采樣點編號依次為W156、W158、W160、W163，于2021年6月（豐水期）進行水體樣品采集。采樣點的分布見圖1。

1.2水樣采集與測定方法

使用有機玻璃采水器采集長蕩湖表層水，每個采樣點采集1L水樣，保存于已消毒滅菌并用樣本底水充分清洗的聚乙烯取樣瓶中，并在4℃條件下運回實驗室。其中500 mL水樣用于理化因子測定，500 mL在實驗室無菌環(huán)境下使用0.45μm濾膜過濾后，將濾膜放入10mL凍存管并保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)DNA測序。

此次測定理化指標(biāo)包括總有機碳（TOC）、總氮（TN）、總磷（TP）、水溫（WT）、pH值及溶解氧（DO）。TOC采用燃燒氧化-非分散紅外吸收法；TN采用堿性過硫酸鉀-紫外分光光度法；TP采用鉬酸銨分光光度法；采用YSI多參數(shù)水質(zhì)分析儀（YSI PR01020，USA）現(xiàn)場測定WT、pH和DO。

1.3微生物群落測序分析方法

先在無菌環(huán)境中將濾膜剪成碎片，然后使用PowerWater DNA（MOBIO，USA）試劑盒提取基因組DNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA。使用正向引物341F（5’-CCTAYGGGRBG-CASCAG -3’）和反向引物806R（5’-GGACTAC-NNGGGTATCTAAT-3’）對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosci-ences，Union City，CA，USA）進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。測序采用IlluminaMiSeq PE300高通量測序平臺進行測序。PCR及測序均由上海凌恩生物科技公司完成。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

水質(zhì)評價方法分別采用水污染指標(biāo)法和內(nèi)梅羅指數(shù)法2種評價方法。

1.4.1水污染指數(shù)法

水污染指數(shù)法以單因子指數(shù)法為基礎(chǔ)，內(nèi)插計算出各污染指標(biāo)的WPI值，選取WPI值的最高值來判定水體污染等級。選取的環(huán)境參數(shù)為總氮、總磷、DO，每個參數(shù)的WPI值計算公式如式（1）：

基于Microsoft Excel處理的原始實驗數(shù)據(jù)；微生物多樣性指數(shù)使用QIIME軟件（1.7.0版）計算，使用Origin 2018軟件繪制物種豐度柱狀圖。依托微信在線平臺繪制Circos圖分析各片區(qū)門分類水平下微生物群落結(jié)構(gòu)特征。

2結(jié)果與討論

2.1長蕩湖水質(zhì)現(xiàn)狀

長蕩湖理化因子濃度與空間分布有一定關(guān)聯(lián)。如表1所示，長蕩湖3個理化因子呈現(xiàn)從南到北濃度逐步降低的趨勢。其中TN濃度從1.14 mg/L降至0.68 mg/L；TP濃度從0.1 mg/L降至0.03 mg/L；TOC含量從5.4 mg/L降至3.8 mg/L。這是因為豐水期降雨量大，且人湖河流在長蕩湖北部的輸水量更多，因此造成了長蕩湖南部污染物濃度高于北部。長蕩湖各片區(qū)的WT、pH差距不大，長蕩湖南部片區(qū)和北部片區(qū)DO濃度低于中部和東部片區(qū)。整體而言，除南部片區(qū)，長蕩湖其他片區(qū)的理化指標(biāo)均達(dá)到地表Ⅲ類水標(biāo)準(zhǔn)。

運用水污染指數(shù)法、內(nèi)梅羅指數(shù)法分別對豐水期長蕩湖進行水質(zhì)評價。2種水質(zhì)評價方法結(jié)果顯示：長蕩湖南部片區(qū)比其他3個片區(qū)水質(zhì)現(xiàn)狀嚴(yán)重，超標(biāo)因子為TN、TP。但采用水污染指數(shù)法評價的水質(zhì)現(xiàn)狀普遍低于內(nèi)梅羅指數(shù)法。因為水污染指數(shù)法是基于單因子指數(shù)法，即采用“最差規(guī)則”來確定水質(zhì)等級，雖然對單項指標(biāo)有較好的評價意義，但缺乏對水體環(huán)境綜合考慮?？傮w而言，長蕩湖南部片區(qū)的部分水質(zhì)指標(biāo)（TN、TP）超標(biāo)，但長蕩湖整體水質(zhì)達(dá)標(biāo)。

2.2長蕩湖微生物群落分布特征

2.2.1微生物群落Alpha多樣性指數(shù)分析

長蕩湖微生物群落Alpha多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表2。

長蕩湖4個采樣點的Coverage指數(shù)均在97%以上，說明此次測序結(jié)果可靠。Ace、Chaol指數(shù)代表微生物豐富度。北部片區(qū)Ace指數(shù)最高，達(dá)5 462；中部片區(qū)最低，為2 590。相同地，北部片區(qū)Chaol指數(shù)最高（5248），而中部片區(qū)最低（2528）。Shannon、Simpson指數(shù)表示微生物群落的多樣性。Shannon指數(shù)最高的是北部片區(qū)，其次為東部片區(qū)、南部片區(qū)、中部片區(qū)。Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)反映結(jié)論一致?？傮w而言，長蕩湖微生物群落的豐富度與多樣性呈現(xiàn)出北部片區(qū)gt;東部片區(qū)gt;南部片區(qū)gt;中部片區(qū)的規(guī)律。

2.2.2門分類水平微生物群落結(jié)構(gòu)

長蕩湖微生物群落在門分類水平上具有較高的多樣性。4個采樣點中共檢測出32種已知微生物菌門，長蕩湖微生物在門分類水平上組成如圖2（a）所示，其中相對豐度排在10名之后的菌門和其他未知物種歸為其它（ others）。長蕩湖相對豐度大于10_10的主要菌門有放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）。

不同片區(qū)優(yōu)勢菌門的種類相似。如放線菌門（Actinobacteria）為長蕩湖各片區(qū)占比最高的優(yōu)勢菌門，據(jù)報道放線菌門（ Actinobacteria）是濕地、湖泊及海洋等各種水環(huán)境細(xì)菌群落中的優(yōu)勢門類。相比其他細(xì)菌，放線菌能更好地躲避原生動物的捕食，死亡率相對較低；在氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)元素充足的湖泊中，碳源常會限制細(xì)菌生長繁殖，而放線菌在利用碳源方面具有更強的競爭力，所以水中放線菌門（Actinobacteria）的占比相對較高。但不同片區(qū)優(yōu)勢菌門的相對豐度卻有所差別。藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobac-teria）在長蕩湖北部片區(qū)和東部片區(qū)的相對豐度分別為13.27%和5.86%，高于長蕩湖中部片區(qū)（2.93%）和南部片區(qū)（0.81%）。研究表明藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）繁殖過多則會引發(fā)水華、使水體富營養(yǎng)化且藍(lán)藻生長潛力由營養(yǎng)物質(zhì)濃度決定。但此研究中北部、東部片區(qū)的氮磷濃度低于南部和中部片區(qū)，猜測是人湖河流含有大量的藍(lán)細(xì)菌，進而導(dǎo)致北部、東部片區(qū)藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）的豐度急劇上升。長蕩湖南部片區(qū)和中部片區(qū)厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度為16.86%、20.92%，遠(yuǎn)高于東部（0.25%）和北部片區(qū)（0.35%）。這與李建松等研究結(jié)論一致。研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門（Firmi-cutes）是藍(lán)藻水華降解末期的最優(yōu)勢菌門。原因可能是藍(lán)藻降解末期水體中溶解氧幾乎耗盡，引起了嗜陽菌屬（Heliophilum）的大量增殖，進而導(dǎo)致厚壁菌門（Firmicutes）在水體中的比例上升。

Circos圖可以直觀展現(xiàn)長蕩湖不同片區(qū)的門分類水平微生物群落組成情況。如圖2（b）所示，放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）在不同片區(qū)生物量分布均勻。如放線菌門（Actinobac-teria）是長蕩湖各片區(qū)占比最高的菌門，其在南部片區(qū)、中部片區(qū)、東部片區(qū)及北部片區(qū)的相對豐度依次為36.6%、43.01%、39.56%、33.85%。疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）相對豐度呈現(xiàn)由南到北逐漸遞增的趨勢。而厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度呈現(xiàn)由南到北逐漸遞減的趨勢。特別是擬桿菌門（Bacteroidetes）在北部片區(qū)（13.72%）、南部片區(qū)（11.52%）、東部片區(qū)（11.85%）的相對豐度相近，但高于中部片區(qū)（3.94%）。由于人湖河流攜帶的污染物對長蕩湖水質(zhì)有一定影響，猜測長蕩湖北部、南部和東部片區(qū)的擬桿菌門相對豐度的提升來源于人湖河流的輸入。可見長蕩湖微生物群落結(jié)構(gòu)與空間位置、外源輸入有關(guān)。

2.2.3科分類水平微生物群落結(jié)構(gòu)

豐水期長蕩湖共檢測出378種微生物菌科，如圖3所示，相對豐度前5的菌科依次為：螢光桿菌科（Ilumatobacteraceae）、魚孢菌科（Sporichthyaceae）、動球菌科（Planococcaceae）、叢毛單胞菌科（Co-mamonadaceae）。莫拉菌科（Moraxellaceae）。

不同片區(qū)的科分類水平下微生物相對豐度有一定差別。如動球菌科（Planococcaceae）在長蕩湖南部片區(qū)和中部片區(qū)的相對豐度遠(yuǎn)高于東部和北部片區(qū)，據(jù)報道動球菌科（Planococcaceae）的生長受多種環(huán)境因素共同影響，如pH、鹽度等。推測可能是人湖河流的輸入導(dǎo)致東部和北部片區(qū)水體理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而造成動球菌科（Planococcaceae）含量降低。長蕩湖南部片區(qū)和中部片區(qū)莫拉菌科（Moraxellaceae）的含量同樣高于東部和北部片區(qū)。說明科分類水平下微生物與外源輸入有關(guān)。

2.2.4屬分類水平微生物群落結(jié)構(gòu)

長蕩湖4個采樣點共檢測出467種微生物菌屬；但所有采樣點均有未能確定分類學(xué)地位的菌屬。如圖4所示，相對豐度排在10名之后的菌屬和其他未知物種歸為其它（others）。長蕩湖相對豐度前5的菌屬依次為：CL500-29 marine group、hgcl clade、類芽孢八疊球菌屬（Paenisporosarcina）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、Clade Ill_norank。

長蕩湖不同片區(qū)優(yōu)勢菌屬種類相似，但占比不同。CL500-29 marine group是長蕩湖占比最高的菌屬，其在中部片區(qū)的占比高于其他片區(qū)。hgclclade分布情況與CL500-29 marine group一致。類芽孢八疊球菌屬（Paenisporosarcina）、不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度呈現(xiàn)出南部片區(qū)、中部片區(qū)高于東部片區(qū)和北部片區(qū)。研究表明不動桿菌屬（ Acinetobacter）屬于變形菌門，是一類重要的反硝化聚磷菌，其生長繁殖受營養(yǎng)物質(zhì)影響；由于長蕩湖氮磷濃度自南到北逐步降低，因此不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度也是自南到北逐漸下降。相反地，Clade Ill_norank在東部片區(qū)、北部片區(qū)的相對豐度略高于南部片區(qū)與中部片區(qū)?？赡苁侨牒恿鬏斎朐斐傻摹?/p>

3結(jié)論

兩種水質(zhì)評價方法結(jié)果顯示，豐水期長蕩湖南部片區(qū)污染最為嚴(yán)重，其中超標(biāo)因子為TN、TP，但整體上長蕩湖水質(zhì)達(dá)標(biāo)。高通量測序結(jié)果表明，長蕩湖4個采樣點共檢測出微生物群落32門378科467屬。長蕩湖各片區(qū)的微生物群落中優(yōu)勢菌門、菌科、菌屬種類相似，但相對豐度卻有所差別。相對豐度前3的優(yōu)勢菌門、菌科分別為放線菌門（Actinobacte-ria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmi-cutes）與螢光桿菌科（Ilumatobacteraceae）、魚孢菌科（Sporichthyaceae）、動球菌科（Planococcaceae）；占比前3的優(yōu)勢菌屬包含CL500-29 marine group、hgclclade、類芽孢八疊球菌屬（Paenisporosarcina）。微生物群落Alpha多樣性分析結(jié)果顯示，長蕩湖微生物群落多樣性和豐富度呈現(xiàn)北部片區(qū)gt;東部片區(qū)gt;南部片區(qū)gt;中部片區(qū)的規(guī)律。長蕩湖微生物群落結(jié)構(gòu)與空間位置、外源輸入有關(guān)。