稻瘟病拮抗菌短小芽孢桿菌NDY-10的功能特性與全基因組分析

摘要：短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）NDY-10對植物病原菌具有廣譜拮抗活性，其中對稻瘟病菌的抑菌率最高。從NDY-10菌株對稻瘟病菌的拮抗特性和全基因組分析2個方面進(jìn)行研究，結(jié)果表明，NDY-10菌株對稻瘟病病菌具有非常強(qiáng)的抑制作用，其無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌的抑制率可達(dá)100%，且與添加量呈正相關(guān)。NDY-10菌株無菌發(fā)酵液對溫度、紫外線輻射不敏感，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿會影響其拮抗活性。經(jīng)3種蛋白酶處理后，NDY-10菌株對稻瘟病病菌的抑制率下降，說明短小芽孢桿菌NDY-10菌株對稻瘟病病菌的拮抗物質(zhì)是一種蛋白。NDY-10菌株的完整基因組大小為3 736 781 bp（含41.63%的G+C），包括3 893個編碼序列（CDS）。從該基因組中鑒定出9條基因簇，其中大部分負(fù)責(zé)抑制代謝物的合成，并且發(fā)現(xiàn)了tasA拮抗基因（801對堿基）。根據(jù)之前的研究，推測其為稻瘟病接抗菌NDY-10菌株的關(guān)鍵功能基因。由本研究結(jié)果可知，NDY-10菌株可以作為潛在的優(yōu)秀的生防制劑用于防治稻瘟病。

關(guān)鍵詞：短小芽孢桿菌；稻瘟病菌；拮抗作用；生物防治；全基因組

中圖分類號：S182；S435.111.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）12-0277-08

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，但在生產(chǎn)過程中常常受到各種病蟲的危害而造成減產(chǎn)。由稻瘟病病菌引發(fā)的稻瘟病是全球范圍內(nèi)最具破壞性的植物病害之一，每年造成的水稻產(chǎn)量損失高達(dá)10%～35%［1］。目前常用于防治植物病原菌的方法主要有化學(xué)殺菌劑防治法、生物防治劑防治法等。化學(xué)殺菌劑的長期過度使用，導(dǎo)致作物對其產(chǎn)生抗藥性和并引發(fā)了環(huán)境污染問題［2］。自20世紀(jì)50年代以來，稻瘟病的生物防治方法得到了廣泛研究，并取得了明顯進(jìn)展。到目前為止，有利用細(xì)菌［3］、真菌［4］和放線菌［5］菌株對稻瘟病進(jìn)行生物防治的研究報道。其中，芽孢桿菌是研究最多的菌屬之一，在抑制多種植物病原菌中發(fā)揮著重要作用［6］，且其用于生物防治的某些菌株已被商業(yè)化應(yīng)用［7］。短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）是芽孢桿菌屬的一員，具有廣泛的拮抗活性，是各種植物病原菌拮抗微生物的重要來源［8-12］。據(jù)報道，短小芽孢桿菌 64-1 菌株的的全基因組可能包括至少12個潛在的生物合成基因簇，從中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌素合成的基因，并可能與其抗菌功能相關(guān)［12］。短小芽孢桿菌NDY-10已被證實(shí)能夠抑制土壤芽孢桿菌［13］，本研究進(jìn)一步分析其抑菌功能，利用全基因組分析有助于獲得NDY-10菌株的相關(guān)拮抗基因。

盡管短小芽孢桿菌菌株在生物防治方面具有巨大的應(yīng)用潛力，但關(guān)于短小芽孢桿菌生物防治稻瘟病的研究卻較少，針對短小芽孢桿菌對稻瘟病菌的拮抗基因和拮抗物質(zhì)的研究也很少。因此，本研究分析短小芽孢桿菌NDY-10對稻瘟病菌的拮抗特性及其全基因組對稻瘟病生物防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 短小芽孢桿菌NDY-10由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離篩選并保存。供試病原菌菌株包括灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、禾旋孢腔菌（Cochlioboluss ativus）、大斑凸臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、瓜果腐霉病菌（Pythium aphanidermatum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。本試驗(yàn)于2020年3月至2021年5月在內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境污染控制與廢物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）LB液體培養(yǎng)基。10 g胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，補(bǔ)充蒸餾水至 1 000 mL，將pH值調(diào)至7.0，在此基礎(chǔ)上添加16 g瓊脂粉，形成固體培養(yǎng)基。（2）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，18 g瓊脂粉，補(bǔ)充蒸餾水至1 000 mL，將pH值調(diào)至7.0。所有培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器 ROTINA 380R型高速離心機(jī)，北京萊比信科技發(fā)展有限公司；LGT-50A型冷凍干燥機(jī)，上海賀帆儀器有限公司；EPOCH2TS型酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；PHS-2F型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 短小芽孢桿菌NDY-10無菌發(fā)酵液的制備 將保存于-80 ℃冰箱的NDY-10菌株用接種環(huán)在LB培養(yǎng)基上劃線活化，在30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h。將純化后的單菌落挑取到試管LB液體培養(yǎng)基中，在150 r/min、30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h。然后，將體積分?jǐn)?shù)為3%種子液轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，在相同條件下于搖床中培養(yǎng)。發(fā)酵8 h后，用紫外分光光度計(jì)測得菌液D600 nm為1.15。將發(fā)酵液搖勻，于4 000 r/min下離心15 min，取上清液，通過0.22 μm細(xì)菌濾膜過濾得到無菌發(fā)酵液。

1.2.2 短小芽孢桿菌NDY-10拮抗作用的測定 將5 mL短小芽孢桿菌NDY-10無菌發(fā)酵上清液倒入滅菌后冷卻至50 ℃左右的20 mL PDA培養(yǎng)基中。在固體培養(yǎng)基中心接入直徑為6 mm的各供試植物病原菌菌餅，菌絲一面貼近培養(yǎng)基作為試驗(yàn)組。同時，以5 mL的LB液體培養(yǎng)基代替5 mL的無菌發(fā)酵上清液作為對照組。所有處理均重復(fù)3次。在30 ℃條件下恒溫靜置培養(yǎng)，待CK組中植物病原菌生長到覆蓋整塊平板或較大時，用“十”字交叉法測量菌落直徑，使用如下公式計(jì)算抑菌率：

抑菌率=對照組菌落直徑-試驗(yàn)組菌落直徑/對照組菌落直徑-菌餅直徑×100%。

為了確定無菌發(fā)酵上清液添加量對稻瘟病菌抑制率的影響，將不同量的短小芽孢桿菌NDY-10的無菌發(fā)酵上清液（5.000、2.500、1.250、0.625、0.313 mL，不足5 mL的用空白培養(yǎng)基補(bǔ)足）與 20 mL PDA固體培養(yǎng)基混合（混合比例分別為 1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64），在平板中心接入稻瘟病菌，觀察并記錄菌餅生長情況，計(jì)算抑菌率。

1.2.3 不同條件下短小芽孢桿菌NDY-10無菌發(fā)酵液的拮抗穩(wěn)定性 測試短小芽孢桿菌NDY-10在不同pH值、溫度、紫外線照射時間和蛋白酶處理下無菌發(fā)酵液的拮抗穩(wěn)定性。用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵濾液的pH值至3、5、7、9、11，調(diào)節(jié)對照組無菌濾液的pH值至6.8，不進(jìn)行酸堿處理。所有樣品在4 ℃冰箱中放置20 h后重新調(diào)整至初始pH值6.8，通過0.22 μm濾膜過濾，得到相應(yīng)的無菌濾液。將離心后并過濾得到的無菌濾液樣品在4、30、40、60、80、100 ℃的不同溫度下處理30 min，再于超凈工作臺中用紫外燈照射2、4、6、8、10 h，然后于37 ℃恒溫水浴中分別用3種100 μg/mL蛋白酶（蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）酶解2 h。CK組為沒有經(jīng)過處理的無菌發(fā)酵液，所有處理組重復(fù)3次。

1.2.4 短小芽孢桿菌NDY-10對稻瘟病菌拮抗物質(zhì)的初步分析 為了提取短小芽孢桿菌NDY-10中可能存在的脂肽類抑菌物質(zhì)，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)無菌發(fā)酵液的pH值至2.0，產(chǎn)生白色絮狀沉淀，在 4 ℃ 冰箱中沉淀過夜。在4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，棄上清，沉淀經(jīng)pH值為2.0的HCl溶液洗滌3次，用無菌水溶解，再將溶液的pH值調(diào)至7.0。冷凍干燥后得到的粗提物用無菌水溶解，過濾后測定抑菌效果。

1.2.5 短小芽孢桿菌NDY-10的全基因組測序及組裝 使用普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司的試劑盒提取基因組DNA，將質(zhì)量和濃度合格的基因組DNA用于文庫構(gòu)建和測序（D260 nm/D280 nm=1.8～2.0，DNA總量≥15 μg，DNA濃度≥50 ng/μL）。將樣品送至上海美吉生物技術(shù)有限公司，使用PacBio RSⅡ和Illumina HiSeq X儀器對全基因組進(jìn)行PacBio單分子實(shí)時DNA測序和Illumina測序。用SOAPdenovo 2.04、unicycler 0.4.8 進(jìn)行基因組組裝，用Circos 0.69軟件繪制基因組圈圖，從外到內(nèi)的圓圈依次展示基因組大小、正鏈上的基因信息、負(fù)鏈上的基因信息、ncRNA、GC含量、GC-Skew。

1.2.6 重復(fù)序列分析、基因預(yù)測及注釋 Tandem Repeats Finder 4.07版軟件用于預(yù)測基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列?；蚪M中的基因和編碼序列（CDS）分別由Gene Marks 4.3和Glimmer 3.02預(yù)測。Barrnap 0.8、tRNAscanSE 2.0分別用于預(yù)測rRNA、tRNA相關(guān)基因。CDS對應(yīng)的蛋白功能通過BLAST+2.3.0、Diamond 0.8.35、HMMER 3.1等工具進(jìn)行注釋，參考數(shù)據(jù)庫包括NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO和KEGG等?；蚪M島和前噬菌體分別通過IslandPath-DIMOB 1.0.0和PHAST進(jìn)行預(yù)測。此外，使用antiSMASH 4.0（https：//antismash.secondarymetabolites.org/#！/start）預(yù)測次生代謝物生物合成的基因簇。

1.2.7 稻瘟病菌的抑菌基因分析 將短小芽孢桿菌NDY-10在NCBI上進(jìn)行基因比對查詢，預(yù)測與抑制稻瘟病菌相關(guān)的基因。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 每組試驗(yàn)的所有處理至少重復(fù)3次。用Excel、SPSS 24.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA）和顯著性分析（α=0.05），并用Duncan＇s檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 短小芽孢桿菌NDY-10的抑菌譜

由表1可以看出，短小芽孢桿菌NDY-10的無菌發(fā)酵液對多種植物病原菌表現(xiàn)出優(yōu)良的拮抗作用，尤其是對稻瘟病菌的抑制率達(dá)到100%。對稻瘟病菌、大斑凸臍蠕孢菌的拮抗作用較好，抑制率為90%～100%；對立枯絲核菌、禾旋孢腔菌、瓜果腐霉菌的拮抗作用較好，抑制率為80%～90%。盡管在受試菌株中，短小芽孢桿菌NDY-10對禾谷鐮刀菌的拮抗作用最差，但抑菌率仍在60%以上。上述結(jié)果說明短小芽孢桿菌NDY-10對植物病原菌具有廣譜拮抗活性。

2.2 無菌發(fā)酵液添加量對稻瘟病菌抑制率的影響

由圖1可以看出，當(dāng)短小芽孢桿菌NDY-10無菌發(fā)酵液的添加量為 0.313 mL 時，抑菌率為56.84%；當(dāng)短小芽孢桿菌 NDY-10 無菌發(fā)酵液的添加量為0.625 mL時，抑菌率提高至74.41%；當(dāng)短小芽孢桿菌NDY-10無菌發(fā)酵液添加量為1.250 mL時，抑菌率提高至84.00%；當(dāng)短小芽孢桿菌NDY-10無菌發(fā)酵液的添加量為 2.500 mL時，抑菌率達(dá)到91.76%，此時稻瘟病菌的生長幾乎暫停；當(dāng)短小芽孢桿菌NDY-10無菌發(fā)酵液的添加量為5.000 mL時，抑菌率達(dá)到100.00%，稻瘟病菌的生長完全被抑制。由此可見，抑菌率與發(fā)酵液混合液的添加量呈正相關(guān)。此外，當(dāng)發(fā)酵液添加量從0.313 mL增加到 0.625 mL 時，抑菌率的增加速度比發(fā)酵液添加量為 0.625 mL 以上時更快。

2.3 短小芽孢桿菌NDY-10對無菌發(fā)酵液拮抗穩(wěn)定性的影響

當(dāng)pH值為5～9時，短小芽孢桿菌NDY-10的無菌發(fā)酵液表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗活性（圖2-A）。當(dāng)短小芽孢桿菌NDY-10的無菌發(fā)酵液的pH值為5、7、9時，抑菌率分別為99.17%、100.00%、98.33%，與對照組（pH值為6.8）的100%抑菌率相比保持穩(wěn)定。然而，當(dāng)pH值高于9或低于5時，抑菌率迅速下降，即當(dāng)pH值為3、11時，抑菌率分別為51.25%、60.42%，與對照組相比分別降低48.75、39.58百分點(diǎn)。上述結(jié)果說明菌株NDY-10無菌發(fā)酵液中的抗真菌物質(zhì)在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下受到較大影響。

短小芽孢桿菌NDY-10的無菌發(fā)酵液在4～100" ℃ 溫度處理下對稻瘟病菌的抑制率均為100%，表明其抑菌物質(zhì)對各種溫度，特別是高溫具有良好的耐受性（圖2-B）。隨紫外線照射時間的延長，抑菌率保持在100%，與對照組相比沒有變化，表明該抗真菌物質(zhì)對紫外線照射不敏感（圖2-C）。

經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶處理后，無菌發(fā)酵液的抑菌率分別為91.67%、94.17%、85.83%，其中木瓜蛋白酶對抑菌作用的影響最大（圖2-D）。根據(jù)所受蛋白酶的影響，推測短小芽孢桿菌NDY-10產(chǎn)生的針對稻瘟病菌的抑菌物質(zhì)屬于蛋白類物質(zhì)。此外，通過脂肽提取法制備的粗提取物對稻瘟病菌沒有抑制作用，表明其抑菌物質(zhì)不是脂肽，進(jìn)一步支持了其為蛋白的假設(shè)。

2.4 短小芽孢桿菌NDY-10的基因組特征

結(jié)合3代PacBio RSⅡ平臺和2代Illumina獲得的測序結(jié)果，基因組測序深度為100×?；趶幕蚪M中搜索到的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)菌株NDY-10屬于短小芽孢桿菌（圖3）。短小芽孢桿菌NDY-10基因組由1條環(huán)形染色體和1個環(huán)形質(zhì)粒組成，總大小為3 736 781 bp。G+C含量為41.63%，基因組包含8個16S rRNA、8個23S rRNA、8個5S rRNA、79個tRNA和3 893個CDS，編碼基因總長度為3 280 458 bp。短小芽孢桿菌NDY-10基因組的一般特征如表2所示?；谌蚪M特征與全基因組序列相結(jié)合繪制基因圈圖，從外到內(nèi)依次為基因組大小、正鏈、負(fù)鏈上的基因信息、ncRNA、GC含量、GC-Skew（圖4）。

2.5 基因預(yù)測與功能注釋

短小芽孢桿菌NDY-10基因組包含18個串聯(lián)重復(fù)序列。如圖5所示，根據(jù)蛋白序列比對結(jié)果在COG數(shù)據(jù)庫中注釋到2 943個基因，數(shù)量最多的是與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)的基因，有292個?；蚪MGO分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，短小芽孢桿菌NDY-10有生物過程、細(xì)胞組成和分子功能三大類，分子功能相關(guān)的GO 注釋結(jié)果最多，有2 193個。通過KEGG數(shù)據(jù)庫對短小芽孢桿菌NDY-10基因組進(jìn)行注釋，結(jié)果注釋到六大類功能區(qū)中，包括細(xì)胞過程、代謝、人類疾病、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和機(jī)體系統(tǒng)，其中與代謝相關(guān)的基因數(shù)量最多，達(dá)1 216個（圖6）。短小芽孢桿菌NDY-10基因組存在9條次級代謝產(chǎn)物基因簇，大部分與非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）、聚酮化合物、細(xì)菌素、抗菌肽等抑菌物質(zhì)的合成有關(guān)，表明菌株NDY- 10對植物病原菌具有廣泛的拮抗活性。

2.6 短小芽孢桿菌NDY-10對稻瘟病菌的拮抗基因

TasA是芽孢桿菌中普遍存在的抑菌蛋白，是一種芽孢結(jié)合蛋白，具有廣泛的拮抗活性［14］。已有研究結(jié)果顯示，短小芽孢桿菌DX01的TasA蛋白通過在大腸桿菌中異源表達(dá)，對稻瘟病菌表現(xiàn)出高度的拮抗作用［15］。目前已從短小芽孢桿菌NDY-10的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個基因編號為BP2328的tasA基因，位置為2 195 410～2 194 610 bp，編碼266個氨基酸。結(jié)合之前的結(jié)論，得出菌株NDY-10針對稻瘟病發(fā)揮抑菌功能的是一種蛋白，并推測其拮抗基因?yàn)閠asA（801對堿基）。短小芽孢桿菌DX01異源表達(dá)的tasA蛋白對稻瘟病菌具有良好的拮抗活性，在短小芽孢桿菌NDY-10中也找到了tasA基因。短小芽孢桿菌NDY-10與短小芽孢桿菌DX01的TasA蛋白一級序列相似度為62.55%，差異如圖7所示。

3 結(jié)論與討論

拮抗微生物一直被認(rèn)為是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)性好和可持續(xù)的生物制劑［16］，其中部分拮抗微生物有益于植物生長［17］。芽孢桿菌對多種植物病原菌的拮抗活性使其成為重要的農(nóng)業(yè)生物防治劑［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，短小芽孢桿菌NDY-10對多種植物病原菌具有顯著的拮抗作用，特別是對稻瘟病菌的抑制率達(dá)到了100%。但是，目前利用短小芽孢桿菌防治稻瘟病的研究還很少。

先前的研究報道了一些短小芽孢桿菌菌株可用于防治稻瘟病。Sha等從非根際水稻土壤中分離出能夠定殖于水稻莖組織的短小芽孢桿菌S9，對稻瘟病菌有很高的抑制率（80%～90%）［19］。在液體改性的BPY培養(yǎng)基中生長72 h后，短小芽孢桿菌 LM-031 的高度拮抗作用使稻瘟病菌抑制區(qū)的直徑達(dá)到22 mm［20］。來自芽孢桿菌屬的其他菌株對稻瘟病菌也有很好的抑菌活性。貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）ZW-10的無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌的抑制作用與發(fā)酵液濃度成正比，其拮抗物質(zhì)在酸性或高溫條件下仍能保持活性。ZW-10無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌的相對抗抑菌活性最高，為（76.27±3.36）%［21］。解淀粉芽孢桿菌Rdx5分離自白芷中，其抑菌活性與生長狀態(tài)成正比，當(dāng)濾液濃度為 66.7 μL/mL 時，無菌發(fā)酵液對稻瘟病菌的相對抑制率達(dá)55.9%［22］。短小芽孢桿菌NDY-10可以強(qiáng)烈抑制稻瘟病菌菌絲體的生長，抑制率可高達(dá)100%，表明該菌株是潛在優(yōu)良的稻瘟病生防菌。

芽孢桿菌菌株能夠產(chǎn)生多種針對植物病原菌的抗菌化合物，包括脂肽（LP）、抗生素和酶，這些化合物通常具有良好的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性［17，23-25］。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，來自芽孢桿菌的抗菌肽可以作為良好的生防制劑［26］。但是，研究者在制備了針對脂肽的菌株NDY-10粗提物后，發(fā)現(xiàn)其對稻瘟病菌并沒有抑制作用，表明其抑菌物質(zhì)不是脂肽。NDY-10 無菌發(fā)酵液的拮抗穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，發(fā)酵液受木瓜蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶的影響明顯，表明該抑菌物質(zhì)應(yīng)為蛋白。

芽孢桿菌菌株能夠分泌具有抗真菌特性的蛋白［27-28］。有研究發(fā)現(xiàn)，在芽孢桿菌屬的幾種生防制劑中檢測到了與拮抗活性相關(guān)的TasA蛋白［14，29］。盡管多種菌株已被證實(shí)具有抑制稻瘟病菌的特性，但少見關(guān)于其拮抗基因的報道。Wu等從水稻根際土壤中分離出1株莫氏假單胞菌（Pseudomonas mosselii）BS011，它能夠顯著抑制稻瘟病菌生長，基因缺失試驗(yàn)結(jié)果表明，基因簇c-xtl是影響稻瘟病菌活性的關(guān)鍵基因簇［3］?；趯Χ绦⊙挎邨U菌SG2的2種幾丁質(zhì)酶（ChiS和ChiL）能抑制稻瘟病菌生長的研究，研究者尚未在短小芽孢桿菌NDY-10的基因組中尋找到相應(yīng)基因。短小芽孢桿菌DX01異源表達(dá)的TasA蛋白雖然對稻瘟病菌具有良好的抑制作用，但抑制率未能達(dá)到100%。相比之下，短小芽孢桿菌NDY-10可以完全抑制其生長，其TasA蛋白結(jié)構(gòu)引起的拮抗活性差異有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］Asibi A E，Chai Q，Coulter J A. Rice blast：a disease with implications for global food security［J］. Agronomy，2019，9（8）：451.

［2］Srivastava D A，Harris R，Breuer G，et al. Secretion-based modes of action of biocontrol agents with a focus on Pseudozyma aphidis［J］. Plants，2021，10（2）：210.

［3］Wu L J，Xiao W，Chen G Q，et al. Identification of Pseudomonas mosselii BS011 gene clusters required for suppression of rice blast fungus Magnaporthe oryzae［J］. Journal of Biotechnology，2018，282：1-9.

［4］Ohtaka N，Kawamata H，Narisawa K. Suppression of rice blast using freeze-killed mycelia of biocontrol fungal candidate MKP5111B［J］. Journal of General Plant Pathology，2008，74（2）：101-108.

［5］Law J W F，Ser H L，Khan T M，et al. The potential of Streptomyces as biocontrol agents against the rice blast fungus，Magnaporthe oryzae （Pyricularia oryzae）［J］. Frontiers in Microbiology，2017，8：3.

［6］Cawoy H，Debois D，F(xiàn)ranzil L，et al. Lipopeptides as main ingredients for inhibition of fungal phytopathogens by Bacillus subtilis/amyloliquefaciens［J］. Microbial Biotechnology，2015，8（2）：281-295.

［7］Hassan M N，Namood-E S，Zia-Ul-Husnain Shah S，et al. Suppression of red rot disease by Bacillus sp.based biopesticide formulated in non-sterilized sugarcane filter cake［J］. BioControl，2015，60（5）：691-702.

［8］Swadling I R，Jeffries P. Antagonistic properties of two bacterial biocontrol agents of grey mould disease［J］. Biocontrol Science and Technology，1998，8（3）：439-448.

［9］Ghasemi S，Ahmadian G，Sadeghi M，et al. First report of a bifunctional chitinase/lysozyme produced by Bacillus pumilus SG2［J］. Enzyme and Microbial Technology，2011，48（3）：225-231.

［10］Rishad K S，Rebello S，Shabanamol P S，et al. Biocontrol potential of halotolerant bacterial chitinase from high yielding novel Bacillus pumilus MCB-7 autochthonous to mangrove ecosystem［J］. Pesticide Biochemistry and Physiology，2017，137：36-41.

［11］Sharma A，Kashyap P L，Srivastava A K，et al. Isolation and characterization of halotolerant bacilli from chickpea （Cicer arietinum L.） rhizosphere for plant growth promotion and biocontrol traits［J］. European Journal of Plant Pathology，2019，153（3）：787-800.

［12］Freitas-Silva J，de Oliveira B F R，Vigoder F M，et al. Peeling the layers away：the genomic characterization of Bacillus pumilus 64-1，an isolate with antimicrobial activity from the marine sponge Plakina cyanorosea （Porifera，Homoscleromorpha）［J］. Frontiers in Microbiology，2021，11：592735.

［13］李靜泉，高 坤，許繼飛，等.土壤芽孢桿菌NDD-1及其拮抗菌短小芽孢桿菌NDY-10的分離、鑒定和抑菌特性［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（15）：91-95.

［14］Yin X T，Xu L N，Xu L，et al. Evaluation of the efficacy of endophytic Bacillus amyloliquefaciens against Botryosphaeria dothidea and other phytopathogenic microorganisms［J］. African Journal of Microbiology Research，2011，5（4）：340-345.. [HJ2mm]

［15］劉 通，陳云鵬，李瓊潔，等. 短小芽胞桿菌抑菌蛋白tasA基因克隆及功能分析［J］. 上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2014，32（5）：48-52，56.

［16］Tariq M，Khan A，Asif M，et al. Biological control：a sustainable and practical approach for plant disease management［J］. Acta Agriculturae Scandinavica（Section B：Soil amp; Plant Science），2020，70（6）：507-524.

［17］ben Abdallah D，F(xiàn)rikha-Gargouri O，Tounsi S. Rizhospheric competence，plant growth promotion and biocontrol efficacy of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum strain 32a［J］. Biological Control，2018，124：61-67.

［18］Shafi J，Tian H，Ji M S. Bacillus species as versatile weapons for plant pathogens：a review［J］. Biotechnology amp; Biotechnological Equipment，2017，31（3）：446-459.

［19］Sha Y X，Zeng Q C，Sui S T.Screening and application of Bacillus strains isolated from nonrhizospheric rice soil for the biocontrol of rice blast［J］. The Plant Pathology Journal，2020，36（3）：231-243.

［20］Zhang W J，Guo P，Liu M，et al. Isolation，identification，and optimal cultivation of a marine bacterium antagonistic to Magnaporthe grisea［J］. Genetics and Molecular Research，2016，15（2）：15028646.

［21］Chen Z，Zhao L，Chen W Q，et al. Isolation and evaluation of Bacillus velezensis ZW-10 as a potential biological control agent against Magnaporthe oryzae［J］. Biotechnology amp; Biotechnological Equipment，2020，34（1）：714-724.

［22］Dong Y L，Li H，Rong S H，et al. Isolation and evaluation of Bacillus amyloliquefaciens Rdx5 as a potential biocontrol agent against Magnaporthe oryzae［J］. Biotechnology amp; Biotechnological Equipment，2019，33（1）：408-418.

［23］Ali G S，El-Sayed A S A，Patel J S，et al. Ex vivo application of secreted metabolites produced by soil-inhabiting Bacillus spp.efficiently controls foliar diseases caused by Alternaria spp［J］. Applied and Environmental Microbiology，2015，82（2）：478-490.

［24］Ma Z W，Zhang S Y，Sun K，et al. Identification and characterization of a cyclic lipopeptide iturin A from a marine-derived Bacillus velezensis 11-5 as a fungicidal agent to Magnaporthe oryzae in rice［J］. Journal of Plant Diseases and Protection，2020，127（1）：15-24.

［25］Zhu Z Y，Peng Q，Man Y L，et al. Analysis of the antifungal properties of Bacillus velezensis B-4 through a bioassay and complete-genome sequencing［J］. Frontiers in Genetics，2020，11：703.

［26］Dehghanifar S，Keyhanfar M，Emtiazi G. Production and partial purification of thermostable bacteriocins from Bacillus pumilus ZED17 and DFAR8 strains with antifungal activity［J］. Molecular Biology Research Communications，2019，8（1）：41-49.

［27］Liu Y F，Chen Z Y，Ng T B，et al. Bacisubin，an antifungal protein with ribonuclease and hemagglutinating activities from Bacillus subtilis strain B-916［J］. Peptides，2007，28（3）：553-559.

［28］Zhu H M，Pan Y Z. A novel antimicrobial protein of the endophytic Bacillus amyloliquefaciens and its control effect against Fusarium chlamydosporum［J］. BioControl，2019，64（6）：737-748.

［29］Zhu J X，Tan T M，Shen A R，et al. Biocontrol potential of Bacillus subtilis IBFCBF-4 against Fusarium wilt of watermelon［J］. Journal of Plant Pathology，2020，102（2）：433-441.

收稿日期：2023-07-18

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號：2018MS03074、2022MS03049）。

作者簡介：魏浩卓（1998—），女，內(nèi)蒙古通遼人，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)。E-mail：wee74893@163.com。

通信作者：李靜泉，博士，講師，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)。E-mail：ljq198327@163.com。