卟啉類化合物和游離鐵對雞胸肉肌原纖維蛋白理化特性的影響

收稿日期：2024-01-16

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32372406）；江蘇省科技計劃項目（BK20231391）

作者簡介：舒麗枝（1999-），女，安徽安慶人，碩士研究生，研究方向為肉品加工與質(zhì)量控制。（E-mail）18110676526@163.com

通訊作者：張牧焓，（E-mail）zhangmh06@sina.com

摘要： 為了解卟啉鐵及其產(chǎn)生的原卟啉和游離鐵對雞胸肉肌原纖維蛋白（MP）和肉品品質(zhì)的影響，本研究分別用原卟啉（PPIX）、卟啉鐵（Hemin）和游離鐵（FeCl3）結(jié)合加熱處理雞胸肉，并測定雞胸肉肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的變化。結(jié)果表明，卟啉鐵、游離鐵和原卟啉會使MP的溶解度顯著降低（Plt;0.05），濁度增加，平均粒徑從空白加熱組的531 nm分別增加到1 280 nm、955 nm和712 nm，說明雞胸肉肌原纖維蛋白發(fā)生了交聯(lián)聚集；卟啉鐵和游離鐵能促進(jìn)蛋白質(zhì)羰基的生成（Plt;0.05），而原卟啉處理對蛋白質(zhì)羰基含量沒有顯著改變（Pgt;0.05），但三者均可引起蛋白質(zhì)疏水性提高；卟啉類化合物和游離鐵處理能顯著降低蛋白質(zhì)分子間氫鍵和離子鍵含量，提高疏水相互作用力和二硫鍵含量，減弱肌動蛋白和肌球蛋白的相互作用，促使肌動蛋白-肌球蛋白發(fā)生解離；卟啉鐵和游離鐵對蛋白質(zhì)理化特性的改變破壞了蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)，降低了蛋白質(zhì)的黏度、彈性模量和黏度損耗模量。本研究為明確卟啉類化合物對肌原纖維蛋白特性和肉品品質(zhì)的影響提供了參考，為調(diào)控雞肉嫩度提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 原卟啉；卟啉鐵；游離鐵；嫩度；肌原纖維蛋白

中圖分類號： TS251.5"" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）10-1952-10

Effect of porphyrins and free iron on physicochemical properties of myofibrillar protein of chicken breast muscle

SHU Lizhi^1，2， SHI Miaomiao^1，2， ZHANG Muhan¹， BIAN Huan¹， XU Weimin^1，2， WANG Daoying^1，2

（1.Institute of Agricultural Product Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： To understand the effects of ferroporphyrins and protoporphyrin IX （PPIX） produced by ferroporphyrins and free iron on myofibrillar protein （MP） of chicken breast muscle and meat quality， chicken breast muscles were incubated with PPIX， hemin and free iron （FeCl3） combined with thermal treatment respectively， and the changes of the structure and physicochemical properties of MP from chicken breast muscle were determined. The results showed that ferroporphyrin， free iron， and protoporphyrin IX could significantly reduce the solubility of MP （Plt;0.05） and increase its turbidity. The average particle size increased from 531 nm in the blank heating group to 1 280 nm， 955 nm， and 712 nm， respectively， indicating that the cross-linking and aggregation happened in the MP of chicken breast muscle. Ferroporphyrin and free iron could promote the generation of protein carbonyl groups （Plt;0.05）， while protoporphyrin IX treatment did not significantly change the content of protein carbonyl groups （Pgt;0.05）， but the three compounds could cause an increase in protein hydrophobicity. Porphyrin compounds and free iron treatments could significantly reduce contents of hydrogen bond and ionic bond between protein molecules， increase hydrophobic interactions and disulfide bond content， weaken the interaction between actin and myosin， and promote the dissociation of actin-myosin. The changes of physical and chemical properties of protein caused by Hemin and free iron destroyed the structure of protein gel， and reduced the viscosity， storage modulus and loss modulus of protein. This study lays the foundation for clarifying the effects of porphyrin compounds on myofibrillar protein properties and meat quality， and provides a theoretical basis for regulating chicken tenderness.

Key words： protoporphyrin IX;ferroporphyrin;free iron;tenderness;myofibrillar protein

雞肉是中國人的主要食用肉類之一，富含大量優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)并且脂肪、膽固醇含量低。其中肌原纖維蛋白（MP）占總蛋白質(zhì)含量的50%以上，是一類具有重要生物學(xué)功能特性的結(jié)構(gòu)蛋白^[1]。MP因具有水結(jié)合能力、凝膠能力以及乳化特性等，在肉品的保水性、嫩度、色澤等最終品質(zhì)形成過程中具有關(guān)鍵作用^[1]。

肌紅蛋白是肉品中主要的呈色物質(zhì)，其狀態(tài)決定宰后肉品色澤變化。肉類在貯藏和加熱過程中，肌紅蛋白極易變性降解，引起卟啉鐵（Hemin）脫落，卟啉鐵在氧化劑的作用下進(jìn)一步被破壞，形成原卟啉（PPIX）和游離鐵離子^[2-3]。肌紅蛋白、卟啉鐵和游離鐵已被證實對蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)氧化具有促進(jìn)作用，對肉品的嫩度、保水性和色澤均有顯著影響^[4]。前期的研究結(jié)果顯示，卟啉鐵和游離鐵可引起肌原纖維蛋白發(fā)生氧化、聚集，影響凝膠的強度和保水性^[5]。我們在用原卟啉及卟啉鐵對雞胸肉進(jìn)行處理時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)卟啉鐵和原卟啉處理后，雞胸肉的嫩度得以改善^[6]。但卟啉鐵和原卟啉對雞胸肉嫩度的作用機制和對肌原纖維蛋白的影響還未有深入研究。

因此，本研究擬采用原卟啉、卟啉鐵和游離鐵協(xié)同加熱處理雞胸肉，提取肌原纖維蛋白，分別測定肌原纖維蛋白理化特性的變化，研究卟啉類物質(zhì)和游離鐵對雞胸肉肌原纖維蛋白的影響，明確其引起雞胸肉品質(zhì)變化的機制，以期為加工過程中肉品嫩度的調(diào)控提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮雞胸肉從當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I，取樣時間為宰后10～12 h，pH為6.40～6.45。原卟啉（純度≥95%，2～8 ℃保存）、氯化血紅素（純度98%，避光，2～8 ℃保存）購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；氯化鐵、氯化鈉、氯化鎂、乙二醇雙四乙酸（EGTA）等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司產(chǎn)品），M124A電子分析天平 （意大利BEL公司產(chǎn)品），T-25數(shù)顯勻漿機（德國IKA公司產(chǎn)品），UniCen MR冷凍離心機 （德國Herolab公司產(chǎn)品），Gen5多功能酶標(biāo)儀（美國Biotek公司產(chǎn)品），Zeta-sizer Nano ZSE電位儀（上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品），HI-9125酸度計（意大利Hanna公司產(chǎn)品），Tanon-1600全自動凝膠成像分析儀（上海天能儀器有限公司產(chǎn)品），Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳（美國Bio-Rad公司產(chǎn)品），Jasco 1500圓二色譜儀（日本Jasco公司產(chǎn)品），Nicolet iS-5型傅里葉變換紅外色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific產(chǎn)品），MCR302流變儀（奧地利安東帕有限公司產(chǎn)品），Discovery HR10混合流變儀（美國TA儀器公司產(chǎn)品）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及肌原纖維蛋白的提取 將生鮮雞胸肉分割成大小形狀一致的肉樣（約120 g）備用。將肉樣分別浸泡在溶解了0.5 mmol/L原卟啉、血紅素或六水合三氯化鐵的三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）緩沖液（10 mmol/L，pH 7.0）中，其中新鮮的肉樣為Fresh組，100 ℃加熱1 h的肉樣為Heat組，用Tris-HCl緩沖液處理并于100 ℃加熱1 h的肉樣為Tris組，用0.5 mmol/L原卟啉處理并于100 ℃加熱1 h的肉樣為PPIX組，用0.05 mmol/L血紅素處理并于100 ℃加熱1 h的肉樣為Hemin組，用0.05 mmol/L六水合三氯化鐵處理并于100 ℃加熱1 h的肉樣為FeCl3組。加熱后用冰水冷卻并進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。取30 g碎肉樣品于100 mL離心管中，分別添加4倍體積的肌原纖維蛋白分離緩沖溶液（成分為0.1 mol/L NaCl，2.0" mmol/L MgCl2，1.0" mmol/L EGTA，6.1 mmol/L Na2HPO4，3.9 mmol/L NaH2PO4·H2O；pH" 7.0，4 ℃），在冰浴中以10 000 r/min的速度均質(zhì)60 s，然后進(jìn)行離心（2 000 g，15 min，4 ℃），去除上清液并收集沉淀物。以上過程重復(fù)2次。然后將沉淀物與8倍體積的緩沖液B（成分為0.1 mol/L NaCl，1.0 mmol/L NaN3；pH 6.0）混合，在冰浴中均質(zhì)（10 000 r/min，60 s），再次離心（2 000 g，15 min，4 ℃）并去除沉淀物。將沉淀物通過4層紗布過濾，將濾液離心得到純化的肌原纖維蛋白，將其溶解在適量的PB緩沖液（0.6 mol/L KCl，10 mmol/L K2HPO4）中待用。

1.3.2 肌原纖維蛋白濁度、溶解度和粒徑的測定 用PB緩沖溶液將MP溶液質(zhì)量濃度調(diào)整為1 mg/mL，取適量1.3.1節(jié)中提取的肌原纖維蛋白溶液，檢測其在600" nm處的吸光度，以PB緩沖溶液作為空白對照，此時的OD值為MP的濁度。

取2 mL肌原纖維蛋白溶液于冷凍離心機中離心（1 500 g，20 min，4 ℃）。之后取上清液，測定肌原纖維蛋白濃度，溶解度為上清液與原肌原纖維蛋白溶液中蛋白質(zhì)濃度的比值，即為MP的溶解度。

將MP溶液經(jīng)過不同處理后，用Zeta電位儀對MP的粒徑進(jìn)行測定，每個處理組測量3次。得出肌原纖維蛋白的粒徑分布圖。

1.3.3 肌原纖維蛋白羰基含量的測定 樣品經(jīng)處理后，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測定MP上清液中的蛋白質(zhì)濃度，測定步驟以及肌原纖維蛋白羰基含量的計算根據(jù)羰基測定試劑盒說明書進(jìn)行。羰基衍生物則可與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成2，4-二硝基苯腙衍生物，該衍生物在387 nm處有強吸收。

1.3.4 總巰基和游離巰基含量的測定 總巰基含量的測定：用磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 7.0）調(diào)整肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度為5 mg/mL。將0.5 mL肌原纖維蛋白溶液與4.5 mL的尿素-十二烷基硫酸鈉（SDS）（8.0 mol/L尿素，30 g/L SDS，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液， pH 7.0）混合，然后加入0.5 mL Ellman試劑[0.1% 5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB），0.2 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.5]混合。在4 ℃條件下孵育24 min后，在412 nm處測量上清液的吸光度（A）。

游離巰基含量的測定：取0.5 mL MP溶液樣品（質(zhì)量濃度為5 mg/mL）與4.5 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液[10 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na），2% SDS，pH 7.5]，然后加入0.5 mL Ellman試劑（0.1% DTNB，0.2 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）混合，在4 ℃條件下孵育1 h后測定吸光度。按以下公式進(jìn)行計算：

巰基含量[mmol/（g·L）]=p×n×A樣品-A對照e×103

式中，n：稀釋倍數(shù)；p：肌原纖維蛋白樣品的濃度；e：摩爾消光系數(shù)[13 600 L/（mol·cm）]；A樣品：樣品的測定值；A對照：對照的測定值。

1.3.5 表面疏水性的測定 取1 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MP溶液，加入200 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液（BPB）。攪拌均勻，離心（6 800 g、15 min），然后取上清液在595 nm處對目標(biāo)樣品進(jìn)行吸光度的測定，測定值記為A1?？瞻讓φ沼昧姿猁}緩沖液的吸光度來表示，測定值記為A2。以溴酚藍(lán)與肌原纖維蛋白表面疏水性氨基酸的結(jié)合量來反映表面疏水性（μg）的大小，計算公式如下所示：

表面疏水性=A1-A2A1×200

1.3.6 肌動蛋白提取和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析 將處理后的2 g肉糜樣品置于20 mL的Weber-Edsall提取液（成分為0.60 mol/L KCl、0.01 mol/L Na2CO3、0.04 mol/L NaHCO3， pH 7.2）中，于冰浴中15 000 r/min勻漿3 次（每次30 s，間隔30 s）。將勻漿液置于4 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中振蕩24 h后，加入40 mL蒸餾水稀釋，使提取液中KCl的終濃度為0.20 mol/L，4 ℃搖床振蕩60 min后將溶液進(jìn)行離心分離，離心條件為：4 ℃、15 000 g，20 min；棄去上清液后，重新加入20 mL Weber-Edsall提取液，再加入40 mL蒸餾水稀釋，用2層尼龍網(wǎng)過濾以棄去不溶物質(zhì)后，4 ℃搖床振蕩60 min后再進(jìn)行離心（4 ℃、15 000 g，20 min）分離，棄去上清液，將沉淀溶解于5 mL KCl-Tris溶液（0.6 mol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2）中。接著用蒸餾水將沉淀稀釋到KCl的濃度為0.20 mol/L，提取肌動蛋白。

1.3.7 對肌原纖維蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析 分別取100 μL不同處理組的肌原纖維蛋白溶液，質(zhì)量濃度均為10 mg/mL，向其中加入25 μL的蛋白上樣緩沖液（2% SDS、0.1%溴酚藍(lán)、10%甘油、Tris-HCl緩沖液），充分混勻后，在干浴鍋中進(jìn)行干燥處理（95 ℃、5 min）。取出并冷卻至室溫后，進(jìn)行離心（25 ℃、12 000 g、5 min），離心后分別取10 μL的上清液用于SDS-PAGE分析（分離膠濃度和濃縮膠濃度分別為12%和5%）。凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色15～30 min，之后于搖床上均勻脫色，用全自動凝膠成像分析儀對脫色凝膠進(jìn)行成像分析。

1.3.8 分子間作用力的測定 分子間作用力的測定參考Tan等^[7]的方法并稍作修改。取2 g經(jīng)過原卟啉、卟啉鐵和游離鐵處理后的雞胸肉，分別與10 mL的SA、SB、SC、SD、SE溶液（其中，SA為0.05 mol/L的氯化鈉溶液；SB為0.60 mol/L的氯化鈉溶液；SC為SB與1.50 mol/L尿素溶液相混合的溶液；SD為SB與8.00 mol/L尿素溶液相混合的溶液；SE為SD與1.50 mol/L β-巰基乙醇溶液相混合的溶液）混合均勻。然后將混合后的溶液在高速勻漿機上進(jìn)行勻漿（4 000 r/min、3～5 min、4 ℃），使肉樣與試劑充分反應(yīng)，于4 ℃靜置1 h，取出后在離心機中進(jìn)行離心（15 000 g，10 min，4 ℃），然后測定上清液中肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度，用SA、SB、SC、SD、SE來表示，并按下式計算分子間作用力的大?。?/p>

離子鍵含量（mg/mL）=SB-SA

氫鍵含量（mg/mL）=SC-SB

疏水相互作用力（mg/mL）=SD-SC

二硫鍵含量（mg/mL）=SE-SD

式中，SA、SB、SC、SD、SE表示肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.9 表觀黏度的測定 采用MCR302流變儀對經(jīng)過原卟啉、卟啉鐵和游離鐵處理后的肌原纖維蛋白溶液的表觀黏度進(jìn)行測定。參數(shù)設(shè)定：直徑40 mm；板間距1 mm，剪切速率0.01～100.00 s^-1。試驗在常溫下進(jìn)行。記錄此過程中剪切應(yīng)力和表觀黏度隨剪切速率的變化，并繪制相應(yīng)的曲線。

1.3.10 動態(tài)流變學(xué)特性的測定 模擬肌原纖維蛋白加熱過程中的變化，采用經(jīng)原卟啉、卟啉鐵和游離鐵處理后的肌原纖維蛋白溶液（質(zhì)量濃度為10 mg/mL），進(jìn)行肌原纖維蛋白動態(tài)流變學(xué)特性的測定。流變儀夾具的測試參數(shù)設(shè)置為25 mm，上下板的間隔設(shè)定為1 000 μm，頻率為1.0 Hz，應(yīng)變?yōu)?%，溫度以2 ℃/min的速率從20 ℃升高到80 ℃，記錄此過程中彈性模量（G′）和黏度損耗模量（G″）隨溫度的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗，Plt;0.05表示差異顯著。所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin Pro 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 卟啉類化合物和游離鐵對肌原纖維蛋白聚集特性的影響

圖1顯示了原卟啉（PPIX處理組）、卟啉鐵（Hemin處理組）和游離鐵（FeCl3處理組）對雞胸肉肌原纖維蛋白聚集特性的影響。由圖1A可知，與空白加熱組（Heat組）和Tris處理加熱組（Tris組）相比，PPIX處理組、Hemin處理組和FeCl3處理組雞胸肉肌原纖維蛋白的溶解度均顯著降低（Plt;0.05）。而相較于PPIX處理組，Hemin和FeCl3處理組對濁度的影響更大。溶解度降低、濁度增大均可反映肌原纖維蛋白發(fā)生了一定程度的交聯(lián)聚集。從肌原纖維蛋白粒徑大小的分布圖中也可以直觀地看出肌原纖維蛋白的聚集和降解狀態(tài)。由圖2可知，經(jīng)FeCl3、Hemin、PPIX處理后，3個處理組的肌原纖維蛋白平均粒徑大小依次為955 nm、1 280 nm、712 nm，而Heat處理組肌原纖維蛋白分子的平均粒徑為531 nm，說明經(jīng)Hemin、PPIX和FeCl3處理后，肌原纖維蛋白分子的粒徑均顯著增大（Plt;0.05），且Hemin處理組的變化最為明顯。這與Nawaz等^[8]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)，不同的氧化系統(tǒng)可引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)，導(dǎo)致不同程度的聚集。

2.2 卟啉類化合物和游離鐵對肌原纖維蛋白氧化特性的影響

蛋白質(zhì)的氧化程度可根據(jù)羰基含量來判斷，羰基含量越高，代表蛋白質(zhì)受到的氧化損傷越大。由圖3A可知，與Heat處理組和Tris處理組相比，經(jīng)過FeCl3、Hemin孵育后的雞胸肉肌原纖維蛋白羰基含量顯著增加（Plt;0.05）。但經(jīng)PPIX孵育后，與Heat處理組和Tris處理組相比，羰基含量未見顯著增加。我們前期的研究結(jié)果表明，血紅素鐵和非血紅素鐵都是肉品中脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化的催化劑，且血紅素鐵對促進(jìn)蛋白質(zhì)氧化更有效^[5]。Wang等^[9]的研究結(jié)果表明血紅素蛋白對肌原纖維蛋白的氧化速率要高于游離鐵。本研究中，Hemin和FeCl3都能引起蛋白質(zhì)氧化，而PPIX的加入對羰基含量影響不大，可能是因為PPIX本身并不含有能引起氧化反應(yīng)的鐵離子。

表面疏水性可用來評價蛋白質(zhì)表面疏水性氨基酸殘基的暴露程度。由圖3B可知，與Heat組、Tris組相比，經(jīng)原卟啉、卟啉鐵和游離鐵處理后，肌原纖維蛋白的表面疏水性顯著增加（Plt;0.05）。Hemin和PPIX處理對雞胸肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響更大。說明當(dāng)這3種化合物作用于MP時，肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)被充分打開，被掩埋的疏水性基團(tuán)暴露，使表面疏水性基團(tuán)含量顯著增加。其中Hemin和FeCl3的氧化作用可能導(dǎo)致肌原纖維蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得非極性氨基酸暴露，表面疏水性增加，這與Fu等^[10]的研究結(jié)果一致。

巰基含量也可作為檢測蛋白質(zhì)氧化程度的指標(biāo)。由圖3C和圖3D可知，與Heat處理組和Tris處理組相比，經(jīng)FeCl3、Hemin、PPIX處理的肌原纖維蛋白的總巰基含量和活性巰基含量均呈下降的趨勢。說明這3種化合物有助于將巰基轉(zhuǎn)化為分子間的二硫鍵^[11-12]。PPIX雖不含鐵離子，但對巰基含量有顯著影響，可能是由于PPIX可與肌原纖維蛋白相互作用，引起肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的改變^[13]。

2.3 卟啉類化合物和游離鐵對肌原纖維蛋白分子間作用力的影響

由表1可知，與Heat處理組和Tris處理組相比，經(jīng)Hemin、PPIX和FeCl3處理后雞胸肉肌原纖維蛋白的離子鍵含量顯著降低（Plt;0.05）。有研究結(jié)果顯示，離子鍵維持著肌原纖維蛋白的三級結(jié)構(gòu)，離子鍵被破壞意味著肌原纖維蛋白發(fā)生聚集^[14]。氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的重要作用力，可維持蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)，氧化會使蛋白質(zhì)的氫鍵和α-螺旋結(jié)構(gòu)受到破壞^[15]。與Heat組相比，各處理組蛋白質(zhì)氫鍵含量也有所降低，但FeCl3處理組的變化比Hemin處理組和PPIX處理組小。

與Heat處理組和Tris處理組相比，經(jīng)Hemin、PPIX和FeCl3處理后肌原纖維蛋白的疏水相互作用力顯著增強（Plt;0.05），并且Hemin的作用效果最好。卟啉類物質(zhì)具有疏水特性，它們的加入引起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中疏水性基團(tuán)的變化^[16]。此外，與Heat組、Tris組相比，經(jīng)原卟啉（PPIX）、卟啉鐵（Hemin）和游離鐵（FeCl3）孵育后的雞胸肉二硫鍵含量顯著增加，并且Hemin的作用效果最好，與其他處理間差異顯著（Plt;0.05）。這表明原卟啉、卟啉鐵及游離鐵均會引起巰基氧化成二硫鍵，這與巰基含量的變化結(jié)果一致。

2.4 卟啉類化合物和游離鐵對肌動蛋白-肌球蛋白解離的影響

圖4顯示了經(jīng)Hemin、PPIX和FeCl3處理后肌動蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，它可以直觀地反映肌動蛋白的含量和肌動球蛋白的解離情況。Hemin、PPIX和FeCl3處理后，蛋白質(zhì)條帶在相對分子量40 000附近有明顯加深現(xiàn)象，說明肌動蛋白-肌球蛋白發(fā)生了明顯的解離現(xiàn)象，并且Hemin組尤為明顯。目前國內(nèi)外研究認(rèn)為肌原纖維結(jié)構(gòu)弱化是肉品嫩度改善的主要原因，肌球蛋白和肌動蛋白作為肉中主要的結(jié)構(gòu)蛋白，它們之間相互結(jié)合力的減弱與肌肉微觀結(jié)構(gòu)的瓦解和嫩度的改善密切相關(guān)^[17]。肌球蛋白頭部主要通過疏水相互作用與肌動蛋白結(jié)合，卟啉類物質(zhì)可能屏蔽肌動蛋白-肌球蛋白結(jié)合位點的疏水結(jié)構(gòu)域，從而抑制肌動蛋白和肌球蛋白的相互作用^[18]。

2.5 卟啉類化合物和游離鐵對肌原纖維蛋白流變特性的影響

圖5顯示了卟啉類化合物和游離鐵對肌原纖維蛋白表觀黏度的影響。由圖5A可知，所有處理組的剪切應(yīng)力均隨著剪切速率的增加而逐漸增加，但與Fresh和Heat組相比，卟啉鐵、游離鐵和原卟啉處理組的剪切應(yīng)力變化較為緩慢。由圖5B可知，隨著剪切速率的增加，各處理組肌原纖維蛋白溶液的表觀黏度均呈現(xiàn)先升高后下降，最后趨于平穩(wěn)的趨勢，屬于非牛頓流體。在0.1～1.0 s^-1剪切速率范圍內(nèi)，不同處理組的表觀黏度大小依次為Fresh處理組gt;Heat處理組gt;Hemin處理組gt;Tris處理組gt;FeCl3處理組gt;PPIX處理組；Hemin處理組、FeCl3處理組和PPIX處理組的表觀黏度均減小，可能是因為蛋白質(zhì)間的分子間作用力減小，加快了其流動速度。當(dāng)剪切力增大到一定值后，肌原纖維蛋白溶液體系間的分子運動達(dá)到動態(tài)平衡并趨于穩(wěn)定^[19]。

圖6顯示了Hemin、FeCl3和PPIX作用于肌原纖維蛋白時，對蛋白質(zhì)形成凝膠過程中彈性模量（圖6A）和黏度損耗模量（圖6B）的影響。彈性模量（G′）可用來評估蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的彈性，G′的大小可顯示蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性^[20]。G″表示加熱過程中黏性的變化，表示物質(zhì)受到外力作用時的變形程度^[21]，可以反映肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的折疊和聚集情況。圖6中G′和G″的變化趨勢相似。由圖6可知，在20～80 ℃，F(xiàn)eCl3和Hemin處理組的G′和G″幾乎沒有變化，而PPIX處理組的G′和G″在40～55 ℃逐漸上升，隨后在55～60 ℃下降，最后在60～80 ℃又呈現(xiàn)上升趨勢，此時可能形成了持續(xù)的不可逆的交聯(lián)肌球蛋白絲^[22]。與其他組相比，F(xiàn)resh組的G′和G″變化最大，G′和G″的峰值均高于加入卟啉類化合物和游離鐵孵育的肌原纖維蛋白的G′和G″。

熱膠凝是蛋白質(zhì)變性的結(jié)果，會導(dǎo)致其分子間共價鍵或非共價鍵的有序形成，從而形成連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)^[23]。相對于Fresh處理組和Tris處理組，本研究中FeCl3處理組和Hemin處理組肌原纖維蛋白的G′和G″降低，表明游離鐵和卟啉鐵能引起肌原纖維蛋白氧化，從而對蛋白質(zhì)凝膠的形成過程產(chǎn)生破壞作用。可能是因為經(jīng)過這2種化合物處理后，肌球蛋白重鏈展開，頭部發(fā)生交聯(lián)，肌球蛋白輕鏈變性和尾部展開，使得凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化^[24]。魏蘇萌等^[25]在研究中發(fā)現(xiàn)氧化能改變肌原纖維蛋白的彈性模量，及其凝膠中蛋白的二級結(jié)構(gòu)和分子間作用力；Ooizumi等^[26]的研究結(jié)果顯示，在氧化體系下，肌球蛋白發(fā)生氧化后彈性模量會降低，與本研究結(jié)果一致。但原卟啉處理組的G′和G″與Tris處理組差別不大，說明其對肌原纖維蛋白的流變性影響較小，相較于游離鐵和卟啉鐵處理組，其更有利于維持肌原纖維蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定?？赡苁且驗樵策旧聿缓芯哂醒趸呋饔玫蔫F離子，不過相關(guān)機制還有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究用卟啉化合物及游離鐵孵育雞胸肉，加熱后提取肌原纖維蛋白，分別測定其聚集特性、氧化特性和流變特性，探究卟啉類化合物影響肉品品質(zhì)的原因。結(jié)果顯示，卟啉鐵和游離鐵使雞胸肉肌原纖維蛋白氧化程度顯著增加，蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集，但原卟啉對肌原纖維蛋白的氧化作用相對較?。辉策?、卟啉鐵和游離鐵可使雞胸肉肌原纖維蛋白的離子鍵和氫鍵含量降低，疏水相互作用力和二硫鍵含量增加；由SDS-PAGE條帶可知，原卟啉、卟啉鐵和游離鐵均可引起肌動球蛋白解離，并且卟啉鐵的作用效果最強；由表觀黏度和動態(tài)流變結(jié)果可知，游離鐵和卟啉鐵處理后雞胸肉肌原纖維蛋白的黏度降低，凝膠結(jié)構(gòu)受到破壞，而原卟啉更有利于維持肌原纖維蛋白穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。卟啉類化合物和游離鐵對肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的改變和對肌動球蛋白的解離作用可能是引起雞肉嫩度改變的原因，但仍需進(jìn)一步明確卟啉類化合物與肌原纖維蛋白相互作用的機制，為貯藏和加工過程中雞肉品質(zhì)的形成提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 韓 格，孔保華. 功率超聲對肌原纖維蛋白功能特性及肉品品質(zhì)的影響研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué)，2022（13）：361-369.

[2] LEE S K， TATIYABORWORNTHAM N， GRUNWALD E W， et al. Myoglobin and haemoglobin-mediated lipid oxidation in washed muscle：observations on crosslinking，ferryl formation，porphyrin degradation，and haemin loss rate[J]. Food Chemistry，2015，167：258-263.

[3] XIONG Q， ZHANG M H， WANG T， et al. Lipid oxidation induced by heating in chicken meat and the relationship with oxidants and antioxidant enzymes activities[J]. Poultry Science，2020，99（3）：1761-1767.

[4] ZHANG Y F， TIAN X J， JIAO Y Z， et al. Free iron rather than heme iron mainly induces oxidation of lipids and proteins in meat cooking[J]. Food Chemistry，2022，382：132345.

[5] ZHANG M H， BIAN H， LI J L， et al. Comparison of biochemical characteristics and gel properties of chicken myofibrillar protein affected by heme-iron and nonheme-iron oxidizing systems[J]. Food Research International，2023，165：112538.

[6] 舒麗枝，張牧焓，徐為民，等. 卟啉類化合物對雞胸肉品質(zhì)的影響[J]. 食品研究與開發(fā)，2023，44（7）：24-29.

[7] TAN F J， LAI K M， HSU K C. A comparative study on physical properties and chemical interactions of gels from tilapia meat pastes induced by heat and pressure[J]. Journal of Texture Studies，2010，41（2）：153-170.

[8] NAWAZ A， IRSHAD S， KHAN I A， et al. Protein oxidation in muscle-based products：effects on physicochemical properties，quality concerns，and challenges to food industry[J]. Food Research International，2022，157：111322.

[9] WANG H H， SONG Y Y， LIU Z Q， et al. Effects of iron-catalyzed and metmyoglobin oxidizing systems on biochemical properties of yak muscle myofibrillar protein[J]. Meat Science，2020，166：108041.

[10]FU Q Q， LIU R， WANG H O， et al. Effects of oxidation in vitro on structures and functions of myofibrillar protein from beef muscles[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019， 67（20）：5866-5873.

[11]ZHU X S， SHI X D， LIU S H， et al. Physicochemical properties and gel-forming ability changes of duck myofibrillar protein induced by hydroxyl radical oxidizing systems[J]. Frontiers in Nutrition，2022，9：1029116.

[12]LUND M N， HEINONEN M， BARON C P， et al. Protein oxidation in muscle foods：a review[J]. Molecular Nutrition amp; Food Research，2011，55（1）：83-95.

[13]MCMICKEN B， THOMAS R J， BRANCALEON L. Erratum：photoinduced partial unfolding of tubulin bound to meso-tetrakis （sulfonatophenyl） porphyrin leads to inhibition of microtubule formationin vitro[J]. Journal of Biophotonics，2013，6（11/12）：968.

[14]NUNEZ-FLORES R， CANDO D， BORDERIAS A J， et al. Importance of salt and temperature in myosin polymerization during surimi gelation[J]. Food Chemistry，2018，239：1226-1234.

[15]WANG L M， WANG X， MA J， et al. Effects of radio frequency heating on water distribution and structural properties of grass carp myofibrillar protein gel[J]. Food Chemistry，2021，343：128557.

[16]楊 天，耿文豪，鄭志紅，等. 褐藻寡糖對鰱魚魚糜穩(wěn)定性、分子間作用力及肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響[J]. 肉類研究， 2021， 35（7）：1-8.

[17]ZHANG Y J， LI X， ZHANG D Q， et al. Effects of acetylation on dissociation and phosphorylation of actomyosin in postmortem ovine muscle during incubation at 4 ℃ in vitro[J]. Food Chemistry， 2021， 356（Suppl C）：129696.

[18]XUE C， YOU J， XIONG S B， et al. Myosin head as the main off-odors binding region：key binding residues and conformational changes in the binding process[J]. Food Chemistry，2023，403：134437.

[19]PONGSAWATMANIT R， SRIJUNTHONGSIRI S. Influence of xanthan gum on rheological properties and freeze-thaw stability of tapioca starch[J]. Journal of Food Engineering，2008，88（1）：137-143.

[20]李 可，李 燕，康超娣，等. 常壓等離子體射流對雞肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和流變特性的影響[J]. 食品科學(xué)，2020，41（19）：124-131.

[21]KIM T， LEE M H， YONG H I， et al. Impacts of fat types and myofibrillar protein on the rheological properties and thermal stability of meat emulsion systems[J]. Food Chemistry，2021，346：128930.

[22]VISESSANGUAN W， OGAWA M， NAKAI S， et al. Physicochemical changes and mechanism of heat-induced gelation of arrowtooth flounder myosin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（4）：1016-1023.

[23]許時慧，陳金玉，關(guān)文強，等. 花生分離蛋白酶解物對雞肉肌原纖維蛋白流變性的影響[J]. 食品研究與開發(fā)，2022，43（5）：14-20.

[24]WANG H F， YANG Z， YANG H J， et al. Comparative study on the rheological properties of myofibrillar proteins from different kinds of meat[J]. LWT，2022，153：112458.

[25]魏蘇萌，游 遠(yuǎn)，楊玉玲，等. 氧化對肌原纖維蛋白流變學(xué)特性及結(jié)構(gòu)的影響[J]. 食品工業(yè)科技，2019，40（9）：29-33.

[26]OOIZUMI T， XIONG Y. Hydroxyl radical oxidation destabilizes subfragment-1 but not the rod of myosin in chicken myofibrils[J]. Food Chemistry，2008，106（2）：661-668.

（責(zé)任編輯：陳海霞）