耐輻射球菌PprI 基因腺病毒載體的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析

摘 要：PprI 基因?qū)τ跍p輕中子對(duì)哺乳動(dòng)物的損傷和γ 射線急性放射對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的損傷具有明顯的預(yù)防和治療作用。本研究利用非復(fù)制型腺病毒載體系統(tǒng)AdMax 包裝系統(tǒng)，將PprI 基因定向克隆到穿梭質(zhì)粒pADVmCMV-MCS-3xFLAG 中，再與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293 細(xì)胞中， 然后同源重組， 獲得重組腺病毒pAdMax-PprI 并進(jìn)行鑒定和PprI 蛋白的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明：重組腺病毒pAdMax-PprI 中的PprI 插入片段與目的基因片段大小相符，測(cè)序一致;插入的PprI 蛋白分子量約45 kDa，有免疫原性。生信分析顯示PprI 基因編碼一個(gè)由328 個(gè)氨基酸殘基組成的親水性蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞膜內(nèi)，沒有信號(hào)肽和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，有13 個(gè)抗原決定簇，二級(jí)結(jié)構(gòu)包含無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊3 種形式， 以無規(guī)則卷曲（ 占46. 73%） 和α 螺旋結(jié)構(gòu)（ 占28. 83%） 為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致，為進(jìn)一步研究PprI 的功能及其抗輻射相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：腺病毒;耐輻射球菌;PprI 基因

中圖分類號(hào)：Q784 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

耐輻射球菌（deinococcus radiodurans，DR） 是迄今為止地球上存在的輻射抗性最強(qiáng)的生物之一，可以承受一系列環(huán)境壓力，例如高劑量的電離輻射、紫外線輻射、氧化、絲裂霉素C 和長時(shí)間干燥[1] 。穩(wěn)定生長的耐輻射球菌可以耐受大約15kGy 的輻射劑量，大腸桿菌的輻射抗性只有其二百五十分之一，而人類僅僅為其三千分之一，因此耐輻射球菌成為研究DNA 修復(fù)與基因組完整性和穩(wěn)定性關(guān)系的首選模型[2-5] 。

2004 年，華躍進(jìn)等[6] 發(fā)現(xiàn)了一株電離輻射異常敏感的KH8401 菌株，且其突變株子代由于插入了一個(gè)耐輻射球菌DNA 修復(fù)的一個(gè)不可或缺的開關(guān)基因，使得這些子代菌株的電離輻射敏感性可以穩(wěn)定遺傳，并將這個(gè)基因命名為PprI。高冠軍等[7] 發(fā)現(xiàn)在NCBI 數(shù)據(jù)庫中沒有與PprI 顯著同源的類似物，表明PprI 基因可能是耐輻射球菌所特有的。因此，PprI 成為研究耐輻射球菌抗輻射特性，以及在未來各領(lǐng)域充分利用其輻射抗性極其重要的關(guān)鍵基因。賀特等[8] 通過果蠅顯微注射技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因果蠅模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因果蠅中的PprI 基因能正常表達(dá)并提高轉(zhuǎn)基因果蠅的抗氧化能力和對(duì)輻射的耐受能力。高冠軍等[3] 采用化學(xué)發(fā)光法探究了補(bǔ)償PprI 后的大腸桿菌清除活性氧自由基的能力差。結(jié)果表明，補(bǔ)償PprI 后的大腸桿菌清除自由基能力和對(duì)H2 O2 的抵抗能力均明顯高于對(duì)照組。研究還發(fā)現(xiàn)，PprI 蛋白在腫瘤的放療和抗腫瘤藥物的研究以及細(xì)胞衰老的研究具有重要意義[9-11] 。

為了解耐輻射球菌PprI 基因?qū)π∈蠹毙暂椛鋼p傷的作用，本研究擬構(gòu)建PprI 基因的重組腺病毒表達(dá)載體，并使用生物信息學(xué)軟件對(duì)PprI 基因編碼的蛋白進(jìn)行分析，為研究PprI 基因的結(jié)構(gòu)與功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1. 1 材料

腺病毒AdMax 包裝系統(tǒng)、Ecoli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、HEK 293 細(xì)胞。限制性內(nèi)切酶EcoR I 和BamH I（TakaRa）、T4 DNA 連接酶（MBI）;TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0（ 上海華舜生物工程有限公司）;LipofectamineTM 2000、DMEM （ Gibco ）; EndoFreeMaxi Plasmid Kit（北京天根）、AxyPrep 質(zhì)粒DNA小量試劑盒（ 杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司）、Premix TagTM（TaKaRa TaqTM Version 2. 0 plus dye）、PrimeSTAR HS DNA Polymerase。

1. 2 方法

1. 2. 1 線性化表達(dá)載體pADV-mCMV-PprI -3xFLAG 的構(gòu)建

（1）PprI 基因的（擴(kuò)增）合成

根據(jù)GenBank （ NCBI： DR - 0167） 中發(fā)表的PprI 基因的序列，使用Vector NT 1 軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和序列的合成（987 bp，上海生物工程有限公司合成）。上游5’端含EcoR I 限制酶切位點(diǎn)及起始密碼，下游5’端含BamH I（表1）。

（ 2） 線性化表達(dá)載體pADV-mCMV-MCS -3xFLAG 的制備

表達(dá)載體pADV-mCMV-MCS-3xFLAG 用限制性內(nèi)切酶EcoR I 和BamH I 進(jìn)行酶切，37 ℃ 水浴鍋中孵育2 h 以上。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和膠回收。

（3） 線性化表達(dá)載體pADV-mCMV-PprI 的構(gòu)建

將鑒定正確的PprI 基因片段和線性化載體pADV-mCMV-MCS-3xFLAG 以2 ∶ 1 加入EP 管中進(jìn)行重組反應(yīng)，熱激法轉(zhuǎn)化于DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子重懸于10 μL LB 培養(yǎng)液中，取1 μL 作為模板進(jìn)行菌落PCR 鑒定，菌落鑒定得到的陽性克隆，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果并分析。

1. 2. 2 重組腺病毒pAdMax-PprI 的包裝

轉(zhuǎn)染前1 d，將HEK 293 細(xì)胞按2. 5×105 個(gè)細(xì)胞/ 孔接種到六孔板中，控制細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)的密度為70% ～ 80%，培養(yǎng)基為高糖DMEM + 10% FBS，置37 ℃ 、5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;轉(zhuǎn)染前1 h取出細(xì)胞培養(yǎng)板，去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，加入1. 5mL 的Opti-MEM 培養(yǎng)基，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱;將待轉(zhuǎn)染的病毒載體質(zhì)粒4 μg（ 骨架質(zhì)?！?穿梭質(zhì)粒= 1 ∶ 1） 溶于Opti-MEM 培養(yǎng)基，總體積為250μL，輕輕混勻;將轉(zhuǎn)染試劑溶于Opti-MEM 培養(yǎng)基，總體積為 250 μL，輕輕混勻;將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加到質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊輕輕混勻后在室溫放置20 min，使DNA 和轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合體;取出細(xì)胞培養(yǎng)板，將上述配好的 DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，做好標(biāo)記，放回培養(yǎng)箱;6 h 后吸去培養(yǎng)液，PBS 洗一次， 加入2 mL 新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)（ 高糖DMEM+5% FBS） 繼續(xù)培養(yǎng)。之后每3 d 換液一次，大概7～15 d 左右出現(xiàn)病毒空斑，待完全病變后收集上清液。同時(shí)設(shè)正常培養(yǎng)的HEK 293 細(xì)胞為對(duì)照。

1. 2. 3 重組腺病毒pAdMax-PprI 的鑒定

將生長良好的HEK 293 細(xì)胞接種到24 孔板，消化好細(xì)胞后把細(xì)胞濃度調(diào)為1×105 個(gè)/ mL，按500 μL/ 孔加入（保證第2 d 進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì)胞匯合率介于30% ～ 50% 之間）， 培養(yǎng)基為高糖DMEM+10% FBS，置37 ℃ 、5%CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;轉(zhuǎn)染前1 h 取出細(xì)胞培養(yǎng)板，更換細(xì)胞培養(yǎng)基（高糖DMEM+5% FBS）后取上述收集保存的病毒上清液50 μL 接種于細(xì)胞，之后的4 h 內(nèi)間隔15～20 min 搖晃一次培養(yǎng)板，增加感染效果，整個(gè)感染過程使用無血清培養(yǎng)基。4 h 后棄去上清，換5%血清的培養(yǎng)基置37 ℃ 、5% CO2 的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后分別收集細(xì)胞和上清液進(jìn)行WB和PCR 檢測(cè)。

1. 2. 4 重組腺病毒pAdMax-PprI 的擴(kuò)增、純化

將HEK 293 細(xì)胞鋪于30 ～ 40 個(gè)25 cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長至70% ～ 80%;更換不含血清的新鮮培養(yǎng)基，加入合適滴度的病毒（20 ～ 50 μL）感染細(xì)胞;待細(xì)胞全部病變后（3 ～ 5 d），每個(gè)培養(yǎng)瓶加入約500 μL 10% Nonidet P 40（NP40）以裂解細(xì)胞;用CsCl 密度梯度法純化病毒，收集病毒后的病毒，于-80 ℃ 保存。

1. 3 重組蛋白的生物信息學(xué)分析

利用在線數(shù)據(jù)庫及分析軟件對(duì)PprI 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、二三級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原決定簇等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果

2. 1 線性化表達(dá)載體pADV-mCMV-PprI 的構(gòu)

以 pMD18-T-PprI 為模板，擴(kuò)增耐輻射球菌PprI 基因的DNA 片段，大小約1 kb，結(jié)果與預(yù)期相符（圖1）。重組穿梭質(zhì)粒pADV-mCMV-PprI 經(jīng)EcoR I 和BamH I 雙酶切處理后，得到2 個(gè)片段，一個(gè)約為1 000 bp 的目的基因PprI 條帶，一個(gè)約為4 000 bp 的穿梭載體pADV-mCMV-MCS-3xFLAG 條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖2）。測(cè)序鑒定證實(shí)重組穿梭載體pADV-mCMV-PprI 中插入的片段與目的基因一致（圖3）。

2. 2 重組腺病毒pAdMax-PprI 的包裝和鑒定

2. 2. 1 重組腺病毒pAdMax-PprI 的包裝

將腺病毒骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒pADV-mCMVPprI-3xFLAG 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)特征性的細(xì)胞病變反應(yīng)（CPE），感染第8 d 細(xì)胞開始出現(xiàn)腫脹、圓縮等明顯致病變效應(yīng)（ 圖4B）;至第11 d 感染細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE，成串珠樣或葡萄串樣，并大部分發(fā)生脫落（圖4C）。

2. 2. 2 重組腺病毒pAdMax-PprI 的PCR 鑒定

對(duì)感染后出現(xiàn)明顯病變效應(yīng)的HEK293 細(xì)胞，進(jìn)行PprI 基因檢測(cè)，擴(kuò)增得到大小約1 000 bp的基因條帶，與預(yù)期目的基因大小相符（圖5）。

2. 2. 3 重組腺病毒pAdMax-PprI 表達(dá)PprI 蛋白的SDS-PAGE、Western Blot 鑒定

由Western Blot 檢測(cè)明顯可見，重組腺病毒pAdMax-PprI 中表達(dá)出現(xiàn)一條大小約為45 kDa 的蛋白條帶，與預(yù)期相符（圖6）。

2. 3 PprI 蛋白的生物信息學(xué)分析

2. 3. 1 蛋白的理化性質(zhì)分析

ProtParam 軟件分析結(jié)果顯示：PprI 蛋白的相對(duì)分子量為17 335. 42，分子式為C753H1208N216O245S4，理論等電點(diǎn)為5. 38，脂肪族氨基酸指數(shù)為70. 80，不穩(wěn)定指數(shù)為49. 59，總平均親水性為-0. 410，屬于不穩(wěn)定類親水性蛋白，具體結(jié)果列于表2。

2. 3. 2 跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析

SignalP 5. 0 Server 和TMHMM Server 在線軟件分析表明，PprI 蛋白無信號(hào)肽（圖7） 和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，全部位于膜內(nèi)（圖8），預(yù)測(cè)PprI 蛋白為非跨膜和非分泌蛋白。

2. 3. 3 抗原決定簇預(yù)測(cè)

Predicting Antigenic Peptides 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，PprI 蛋白序列長度為328 個(gè)氨基酸，平均抗原決定簇傾向?yàn)?. 026 3，預(yù)測(cè)序列中有13 個(gè)抗原決定簇（圖9）。

3 討論

2006 年，研究發(fā)現(xiàn)PprI 基因可以調(diào)節(jié)recA 基因的表達(dá)，并且其缺失將導(dǎo)致耐輻射球菌對(duì)輻射的敏感性。為了進(jìn)一步揭示PprI 基因在耐輻射球菌耐輻射中的功能作用和調(diào)節(jié)途徑，眾多學(xué)者從蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度進(jìn)行了大量的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)暴露于低劑量γ 輻射后，數(shù)種蛋白質(zhì)被PprI 明顯上調(diào)，這些蛋白質(zhì)參與包括DNA 復(fù)制和修復(fù)、應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等。另外，關(guān)于PprI 突變株與野生型的研究發(fā)現(xiàn)，210 個(gè)基因在輻照的野生型耐輻射球菌中被誘導(dǎo)表達(dá)，這些基因的一部分直接受PprI 調(diào)節(jié)，一部分為間接調(diào)控;與蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果一致，這些基因參與DNA 復(fù)制和修復(fù)、應(yīng)激反應(yīng)等各種途徑。

提高生物體的抵抗力具有重要意義，特別是在極端環(huán)境中生長的工業(yè)微生物和作物。除了突變體選擇外，過表達(dá)異源基因（如來自耐輻射球菌的全球調(diào)節(jié)因子PprI） 可以幫助提高生物體對(duì)環(huán)境脅迫的抵抗力。例如，在大腸桿菌中表達(dá)Dr-PprI，導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)輻射、鹽、滲透、活性氧（ROS）和其他脅迫的耐受性增強(qiáng)，且增強(qiáng)了其對(duì)DNA 損傷、pH 應(yīng)激以及滲透和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)。PprI 的轉(zhuǎn)導(dǎo)在真核生物中也有效，將pEGFP-c1 載體中克隆的PprI 引入小鼠和人類細(xì)胞，其表達(dá)通過調(diào)節(jié)Rad51 的表達(dá)減輕了急性輻射誘導(dǎo)的不同器官損傷，并使存活率提高了近30%。到目前為止，PprI 如何影響其他生物的應(yīng)激耐受性的詳細(xì)機(jī)制仍然未知。研究人員推斷，PprI 除了作為蛋白酶來抑制轉(zhuǎn)錄以響應(yīng)DNA 損傷外，還具有其他功能。進(jìn)一步的研究將有助于更好地揭示其功能機(jī)制，并可應(yīng)用于各種人類生產(chǎn)活動(dòng)。

本研究利用非復(fù)制型腺病毒AdMax 系統(tǒng)構(gòu)建了能夠表達(dá)PprI 基因的重組腺病毒，并成功地在HEK 293 細(xì)胞中表達(dá)出了PprI 蛋白，且表達(dá)的PprI 蛋白具有免疫原性。生信分析以及預(yù)測(cè)結(jié)果提示，PprI 蛋白的相對(duì)分子量為17 335. 42，由328個(gè)氨基酸組成，屬于不穩(wěn)定類親水性蛋白;由于沒有發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽的存在，預(yù)測(cè)其為非跨膜和非分泌蛋白，可能不發(fā)生跨膜轉(zhuǎn)移，只于合成處發(fā)揮作用。PprI 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，其二級(jí)結(jié)構(gòu)包含無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊3 種形式，并且以無規(guī)則卷曲和α 螺旋這兩種結(jié)構(gòu)為主流。并且，其中α 螺旋結(jié)構(gòu)為保守序列，在DNA結(jié)合基序中發(fā)揮著重要作用，而無規(guī)則卷曲多含有B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位，有利于蛋白質(zhì)與抗體的嵌合;三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致，包含無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊3 種形式。抗原決定簇是抗原物質(zhì)分子表面或其它部位能與其相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)?？乖瓫Q定簇分析結(jié)果表明，PprI 蛋白含有13 個(gè)抗原決定簇，且Western Blot 結(jié)果表明表達(dá)的PprI 蛋白有免疫原性，可通過激活機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮抗輻射作用，并作為優(yōu)勢(shì)抗原用于抗輻射相關(guān)研究。后期將進(jìn)行重組腺病毒pAdMax-PprI 對(duì)于小鼠急性輻射損傷的抗性試驗(yàn)，進(jìn)一步分析PprI 蛋白在抗輻射損傷中的作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了耐輻射球菌PprI 基因的重組腺病毒，HEK 293 細(xì)胞中表達(dá)的PprI 蛋白的分子量約為45 kDa，具有免疫原性。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明PprI 基因編碼一個(gè)由328 個(gè)氨基酸殘基組成的親水性蛋白質(zhì)，沒有信號(hào)肽和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，有13 個(gè)抗原決定簇，二級(jí)結(jié)構(gòu)包含無規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊3 種形式，以無規(guī)則卷曲（占46. 73%）和α 螺旋結(jié)構(gòu)（占28. 83%）為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致，為進(jìn)一步研究PprI 基因?qū)φ婧思?xì)胞和哺乳動(dòng)物的抗輻射作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] Adnerson A W， Nordan H C， Cain R F， et al. Studies on a radio-resistant micrococcus. I. Isolation， morphology， culturalcharacteristics， and resistance to gamma radiation[J]. Food Techno1， 1956， 10： 575-578.

[ 2 ] Cox M M， Battista J R. Deinococcus radiodurans-the consummate survivor[J]. Nature Reviews. Microbiology， 2005， 3（11）： 882-892.

[ 3 ] 高冠軍. 耐輻射球菌DNA 修復(fù)開關(guān)基因pprI 的研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2005.

[ 4 ] 喬惠萍. 耐輻射球菌pprI 基因在酵母菌中的表達(dá)及其蛋白抗放作用與機(jī)理的研究[D]. 蘇州： 蘇州大學(xué)， 2014.

[ 5 ] White O， Eisen J A， Heidelberg J F， et al. Genome sequence of the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans R1[J]. Science， 1999， 286（5444）： 1571-1577.

[ 6 ] 華躍進(jìn)， 高冠軍. DNA 修復(fù)開關(guān)“PprI”的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展[C] / / 中國原子能農(nóng)學(xué)會(huì)第七次代表暨學(xué)術(shù)研討會(huì). 杭

[ 7 ] 趙忠朝， 張玉秀， 周正富， 等. 耐輻射異常球菌抗氧化保護(hù)機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展， 2013， 3（2）： 109-114.

[ 8 ] 陳立， 董俊興. 耐輻射奇球菌抗輻射作用的研究進(jìn)展[J]. 癌變·畸變·突變， 2008， 20（4）： 334-336.

[ 9 ] Zahradka K， Slade D， Bailone A， et al. Reassembly of shattered chromosomes in Deinococcus radiodurans[J]. Nature，2006， 443（7111）： 569-573.

[10] 賀特. pprM / PprI 轉(zhuǎn)基因果蠅模型構(gòu)建及其輻射抗性研究[D]. 湖南： 南華大學(xué)， 2019.

[11] Longtin R. Deinoccocus radiodurans： getting a better fix on DNA repair[J]. Journal of the National Cancer Institute，2003， 95（17）： 1270-1271.