糧食中霉菌毒素檢測技術(shù)的研究進展

摘要：糧食在儲藏過程中可能會因儲存不當(dāng)被真菌感染，從而被霉菌毒素污染。霉菌毒素對人和動物的生命健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響，并在一定程度上對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟造成損失。我國作為糧食生產(chǎn)大國，保證糧食安全關(guān)乎未來國家發(fā)展，如何確保糧食儲藏過程中的安全是科研人員一直在探究的問題。為了滿足高效、同時檢測多種霉菌毒素的迫切需求，目前已開發(fā)出了多種霉菌毒素的檢測方法。本文主要介紹了常見的霉菌毒素及其危害、霉菌毒素的傳統(tǒng)的檢測方法以及當(dāng)下霉菌毒素檢測的新興技術(shù)，對它們的原理、優(yōu)缺點進行了全面綜述，以期為糧食檢測提供參考。

關(guān)鍵詞：糧食 霉菌毒素 檢測技術(shù) "我國是農(nóng)業(yè)大國，糧油作物種植面積巨大。2024年，我國糧食播種面積約119319千公頃，全國糧食總產(chǎn)量70650萬噸。此外，根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國糧食在儲藏、運輸和加工等過程中每年的損失量達700億斤以上[1]。從上述數(shù)據(jù)來看，我國穩(wěn)住了糧食“量”的安全。那么，如何進一步穩(wěn)住糧食的“質(zhì)”的安全，是需要持續(xù)關(guān)注的問題。

糧食從田間到餐桌這一過程中的每一環(huán)節(jié)，都可能被污染，包括機械雜質(zhì)污染、微生物污染、化學(xué)性污染以及鼠蟲害污染等。其中，微生物污染通常是真菌，如霉菌產(chǎn)生的霉菌毒素對糧食的污染。霉菌毒素極易殘留在糧食中，隨著食物鏈進入到人和動物體內(nèi)，嚴(yán)重威脅著人類和動物的健康安全。因此，對糧食進行霉菌毒素檢測，對保障人們的飲食健康、確保糧食的儲藏安全和保障國家的糧食安全具有重要意義。

一、常見的霉菌毒素及其危害

（一）黃曲霉毒素

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）是主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有致癌性、致突變性和遺傳毒性[2]。目前，已經(jīng)確定的黃曲霉毒素有20種，根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC），黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）和黃曲霉毒素G2（AFG2）均對人體有致癌作用，AFB1在1993年被列為一類致癌物。賀亞如等[3]對榆林市2021-2022年監(jiān)督抽檢的小米、高粱樣品進行污染程度和安全狀況進行分析，結(jié)果顯示共監(jiān)測的60批次小米、16批次高粱中AFB1均有檢出，但檢出率較低。

（二）赭曲霉毒素

赭曲霉毒素（Ochratoxins）是由曲霉屬和青霉屬霉菌所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，常見的包括赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、赭曲霉毒素B（Ochratoxin B，OTB）、赭曲霉毒素C（Ochratoxin C，OTC）。其中，OTA具有最強的毒性，具有肝毒性、腎毒性以及三致作用，被IARC列入2B類致癌目錄[4]，其危害性僅次于黃曲霉毒素，我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定OTA在谷物及其制品中的限量為5 μg/kg（GB 2761-2017）。趙畢等[5]對浙江省5大類食品中OTA進行了檢驗檢測，結(jié)果表明OTA主要暴露在谷物及其制品中，燕麥制品中OTA檢出率最高可達16.1%，其余谷物中OTA檢出率在3.2%-16.1%不等；小米，稻谷等谷物中均有不同程度的檢出。

（三）伏馬菌素

伏馬菌素（Fumonisin，F(xiàn)B）是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)類似的次級代謝產(chǎn)物，其類似物在15種以上。最重要的是B系列伏馬菌素，包括伏馬菌素B1（FB1）、伏馬菌素B2（FB2）、伏馬菌素B3（FB3）和伏馬菌素B4（FB4）[6]。其中，F(xiàn)B1的毒性最強并具有致癌性，被IARC列為2B類致癌物。FB主要存在于谷物和谷物食品中，尤其是玉米及玉米制品，人體攝入含有FB的食物，易導(dǎo)致肝毒性和腎毒性，對人體健康造成嚴(yán)重?fù)p傷[7]。呂宗浩等[8]對寧夏固原市肉牛養(yǎng)殖場飼料的伏馬毒素的污染狀況進行了調(diào)查，結(jié)果表明在玉米、青貯、麩皮等飼料中均檢出伏馬菌素，其中在玉米中的檢出率最高可達66.67%，最高含量可達3.82 mg/kg。

（四）玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）最初在患有赤霉病的玉米中被發(fā)現(xiàn)，也存在于大麥、小麥和水稻等谷物中，主要的產(chǎn)毒菌為鐮刀菌屬真菌[9]。ZEA的熱穩(wěn)定性強，在食品加工過程中不易被破壞，伴隨食物進入體內(nèi)易對人體造成損傷。相關(guān)文獻顯示，ZEA具有免疫毒性、肝毒性、血液毒性、致畸性和致癌性[10]，被IARC列為三類致癌物。

（五）脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），又名為嘔吐毒素，屬于B型單端孢霉烯族毒素，主要產(chǎn)自鐮刀菌屬，尤其是禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌[11]。DON主要存在于小麥、玉米、燕麥等谷物及其制品中，污染率較高。人和動物暴露于DON后，可能會出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，如食欲不振、嘔吐、腹瀉，嚴(yán)重甚至死亡；DON還具有細(xì)胞毒性、免疫毒性、遺傳毒性和潛在的致癌作用，被IARC列為三類致癌物。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品類DON含量不允許超過1000 μg/kg。張莉等[12]對2016-2022年河南省駐馬店市182份小麥粉及其制品中的DON及其衍生物污染水平進行了調(diào)查并評估其膳食風(fēng)險，結(jié)果顯示小麥粉及制品樣本中DON總檢出率為87.4%，濕面條超標(biāo)率最高10.9%，這表明小麥粉及其制品中的DON污染較為普遍。

二、霉菌毒素的檢測方法

糧食中存在的各類霉菌毒素對人類和動物的健康帶來了嚴(yán)重威脅，因而各國以及糧農(nóng)組織制定的霉菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)、檢測標(biāo)準(zhǔn)越來越嚴(yán)格。但這嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)有利于提高人們對霉菌毒素危害性的認(rèn)識，以保證人和動物的生命健康。同時還有利于推動霉菌毒素檢測方法和技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展，不斷提高檢測效率。霉菌毒素的常規(guī)檢測方法主要包括超高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、膠體金免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附法等。

（一）常規(guī)檢測法

1. 超高效液相色譜法。超高效液相色譜法（Ultra-High Performance Liquid Chromatography，UHPLC）的工作原理同高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）一致。兩種方法均是以液體為流動相，在高壓輸液系統(tǒng)中將帶有分析物的流動相泵入色譜柱中，分析物中的各種成分在色譜柱中被分離，然后進入到檢測器中進行檢測，通過保留時間、峰面積實現(xiàn)分析物的定性、定量檢測。不同的是，UHPLC在運行時具有更高的系統(tǒng)壓力，色譜柱中的固定相的粒徑更小，且UHPLC具有更高的分離度和更快的分析速度，該方法節(jié)約了樣品分析的時間，提高了檢測效率。UHPLC雖具有顯著的優(yōu)勢，但其設(shè)備更加精密，耗費的成本更高，對樣品前處理的要求也更高。李丹娜等[13]通過磁性離子液體復(fù)合材料固相萃取富集植物油中的DON，并采用超高效液相色譜法對其進行測定，結(jié)果顯示DON在0.05-2.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，平均加標(biāo)回收率在86.5%～89.4%，檢出限和定量限分別為3.3 μg/kg和10 μg/kg。

2. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid chromatography/tandem mass spectro

metry，LC-MS/MS）是將液相色譜的分離系統(tǒng)與質(zhì)譜的分析系統(tǒng)相結(jié)合的一種檢測技術(shù)。與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）的工作原理一致，目標(biāo)分析物在液相系統(tǒng)中被分離后，進入質(zhì)譜中進行質(zhì)量分析。不同的是，LC-MS為單級質(zhì)譜，分析物在液相系統(tǒng)中分離后，直接進入質(zhì)譜中被分析。而LC-MS/MS具有兩個串聯(lián)的質(zhì)譜，分析物在被分離后，首先通過第一級質(zhì)譜被離子化和分析，然后選擇特定的離子進行碎裂，產(chǎn)生的離子碎片再進入到第二級質(zhì)譜中被分析。LC-MS/MS具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用于痕量物質(zhì)和未知物質(zhì)的分析。張養(yǎng)冬等[14]采用優(yōu)化的LC-MS/MS檢測了2015年度4省市10個奶牛場的14個全株青貯玉米樣品，結(jié)果顯示10個奶牛場全株青貯玉米樣品中全部檢出的霉菌毒素種類為DON、AFB2和ZEA和麥角醇，含量由高到低依次為DON、ZEA、AFB2、麥角醇，均未超過國家限量。

3. 膠體金免疫層析法。膠體金免疫層析法（Colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）的原理是基于抗原-抗體的特異性相互作用，是一種將膠體金標(biāo)記與免疫層析相結(jié)合的快速檢測技術(shù)。通過還原法合成的膠體金為紅色或紫紅色，帶有負(fù)電荷，可以與帶有正電荷的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電相互作用，因此不會破壞蛋白質(zhì)的生物特性。GICA由于操作簡單、成本低、檢測速度快、能夠現(xiàn)場檢測以及結(jié)果肉眼可讀被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品檢測等領(lǐng)域。但GICA具有免疫分析法的通病，極易導(dǎo)致假陽性或假陰性的結(jié)果。此外，GICA多用于定性分析的場合，用于定量檢測還需要結(jié)合其他技術(shù)。例如，賀麗麗[15]采用膠體金免疫層析技術(shù)結(jié)合德國拜發(fā)集團的RIDA SMART APP讀數(shù)儀對谷物中的AFs、ZEA、DON進行快速檢測。結(jié)果顯示，其回收率基本控制在80%-120%，變異系數(shù)小于15%。在實際樣品檢測中，產(chǎn)品檢測值和國標(biāo)方法檢測值的偏離度控制在±20%范圍之內(nèi)，說明該產(chǎn)品可以用于谷物及其他樣品中的霉菌毒素含量的現(xiàn)場篩查。

4. 酶聯(lián)免疫吸附法。酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的工作原理與GICA相似，均是基于抗原-抗體的特異性相互作用。不同的是，ELISA中的標(biāo)記物為酶，需要催化特定的底物進行顯色來實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測。ELISA具有操作簡單、高通量、可視化以及靈敏度高等優(yōu)點，在醫(yī)療、食品安全以及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域受到青睞。徐加兵等[16]采用UPLC-MS/MS（超高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法）和ELISA兩種方法測定了胖大海中黃曲霉毒素的含量，結(jié)果表明UPLC-MS/MS和ELISA兩種方法得到測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.46%-7.43%范圍內(nèi)，與UPLC-MS/MS相比，ELISA在測定AFB1和總量時，其差異更小，且未出現(xiàn)假陽性的情況?？偟膩碇v，ELISA方法是目前檢驗真菌毒素的一種非常常用的方法，其準(zhǔn)確性較高，相較于色譜質(zhì)譜等方法，具有快速簡便，高靈敏性等特點。然而，ELISA試劑盒制備復(fù)雜、操作程序耗時、易受環(huán)境干擾、酶易失活，這些缺陷限制了ELISA的進一步應(yīng)用。

（二）新興檢測法

霉菌毒素的常規(guī)檢測法具有儀器設(shè)備精密昂貴、檢測有限和靈敏度欠缺、操作程序復(fù)雜等局限性。因此，開發(fā)出新的檢測方法，解決上述缺陷是亟待解決的問題。許多研究報道了一些新興霉菌毒素檢測技術(shù)，如表面增強拉曼光譜、電化學(xué)傳感器、比色傳感器以及表面等離子體共振等。這些新技術(shù)不僅能夠達到要求的靈敏度和檢測限，同時也提高了檢測速度，具有廣闊的發(fā)展前景。

1. 表面增強拉曼光譜。表面增強拉曼光譜（Surface Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）是一種表面?zhèn)鞲屑夹g(shù)，通過電磁增強和化學(xué)增強機制，增強吸附在貴金屬（如金、銀、銅等）納米結(jié)構(gòu)表面的分子的拉曼散射光譜。據(jù)研究報道，電磁增強在SERS過程中起主導(dǎo)作用，而化學(xué)增強機制的貢獻較小[17]。近年來，SERS因其具有高靈敏度、光漂白少、檢測速度快、目標(biāo)分子的獨特指紋和窄光譜帶的優(yōu)點，成為一種非常有前景的檢測技術(shù)，在食品科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。Zhang Y等[18]提出了一種基于SERS的納米傳感器，該方法可快速提取并根據(jù)金納米顆粒獨特的光譜指紋圖譜可鑒定吸附的霉菌毒素。此外，樣品的預(yù)處理只需簡單地過濾，整個分析過程能在1 h內(nèi)完成，節(jié)省了大量的分析時間?？傮w而言，該方法在食品中霉菌毒素的多重快速檢測中具有重要意義，應(yīng)用前景廣闊。但SERS在選擇性上可能存在一定的問題，即食品基質(zhì)中的各種交叉行為，疏水性等都可能影響SERS的選擇性[17]。如何在復(fù)雜的食品基質(zhì)中實現(xiàn)對多種霉菌毒素的快速和準(zhǔn)確檢測是亟待解決的問題。目前采用金或銀膠體納米材料可以較好改善SERS的選擇性，但納米材料在傳感器上的不均勻分布或受試樣本在納米材料上的不均勻分布都可能會削弱霉菌毒素檢測的靈敏度[19]。

2. 電化學(xué)傳感器。電化學(xué)傳感器（Electroche

mical sensor，ES）是一種將分析物與電化學(xué)換能器相耦合的工作裝置。ES的原理是利用電化學(xué)分析儀將分析物產(chǎn)生的化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為電信號，其一般由電極、電解質(zhì)、信號轉(zhuǎn)換器以及傳輸電路等組成。根據(jù)輸出的電信號與分析物濃度之間的關(guān)系能夠?qū)崿F(xiàn)對分析物進行定性或定量分析。ES的靈敏度高、檢測速度快、操作簡單，并且能夠?qū)崿F(xiàn)利用便攜式設(shè)備進行現(xiàn)場快速檢測，近年來在食品安全檢測、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)療、能源等領(lǐng)域成為持續(xù)的研究熱點。ES在很大程度上依賴于修飾材料的性能，這些材料包括碳納米材料、金屬納米材料、聚合物、生物活性物質(zhì)等，因此，可以根據(jù)待測物的性質(zhì)來選擇電化學(xué)傳感器的修飾材料。ES檢測霉菌毒素的方式有兩種，一是通過修飾材料直接催化霉菌毒素在電解質(zhì)溶液中發(fā)生的氧化還原反應(yīng)來讀取電流響應(yīng)；另一種方式是在電極表面修飾適配體、酶、抗原抗體等生物活性物質(zhì)，通過記錄這些活性物質(zhì)與檢測物結(jié)合前后的探針信號變化來實現(xiàn)定量檢測[20]。Veenuttranon K等[21]構(gòu)建了一種能夠同時快速檢測飼料和食品中的ZEA和OTA的NiO-MWCNT（-COOH）/GCE傳感器，在優(yōu)化條件下，ZEN和OTA在0.01-10.24 μg/mL和0.04-10.24 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性響應(yīng)，檢測限分別為6和15 μg/mL。此外，研究人員同時還制備了基于NiO-MWCNT（-COOH）的絲網(wǎng)印刷電極，制備成本較低，具有較高的商業(yè)化潛力。盡管上述ES具有諸多優(yōu)勢，但其研究仍然停留在實驗室階段，實現(xiàn)商業(yè)化還需做出努力，開發(fā)出高效的識別元件、能夠同時檢測多種物質(zhì)、便攜式的傳感器是未來面臨的一大挑戰(zhàn)。

3. 比色傳感器。比色傳感器是基于比色法原理的一種傳感器，即通過比較待測物質(zhì)溶液的顏色與已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液間的顏色深淺差異，來確定待測物質(zhì)的濃度。其制備簡單、成本低、儀器簡單，具有通量高和便攜性等特點[22]。此外，可以用肉眼直接讀取比色測定以獲得結(jié)果，這非常適合用于開發(fā)便攜式傳感器，對霉菌毒素等有害物質(zhì)進行現(xiàn)場檢測[23]。目前，比色傳感器在檢測霉菌毒素、農(nóng)藥殘留、有害氣體等都具有非常不錯的表現(xiàn)。Liu M L等[24]構(gòu)建了一種鐵-氮-碳單原子酶比色生物傳感器實現(xiàn)了對AFB1的超靈敏檢測，結(jié)果表明在最佳情況下，傳感器的檢測限為1.5×10-7 ng/μL，線性范圍為1×10-6-1 ng/μL，超過大多數(shù)現(xiàn)有的AFB1檢測試劑盒，且檢驗在2 h內(nèi)即可完成。Niu X J等[25]構(gòu)建了一種基于磷酸銀納米顆粒漆酶模擬活性的快速比色傳感器，用于高靈敏、高選擇性地檢測玉米和小麥中的FB1，結(jié)果表明傳感器的檢測限（LOD）低至1.73 μg/L，遠低于歐盟委員會和美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）設(shè)定的FB1最大殘留限量（MRL）。在谷物中FB1檢測的平均回收率為87.8%-104.5%，同時將樣品的顏色變化與智能手機結(jié)合，實現(xiàn)對FB1快速檢測。比色傳感器得到了越來越多的發(fā)展和應(yīng)用，但其也存在一些問題[26]：（1）背景顏色對測定結(jié)果具有一定的影響；（2）基質(zhì)成分復(fù)雜的樣品影響測定結(jié)果，需建立合理的前處理方法；（3）功能材料的穩(wěn)定性有待提高。

4. 表面等離子體共振。表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）作為一種相對新穎和簡單的分析方法，已被證明具有快速、靈敏、實時性和樣本量小的特點。SPR的基本原理是利用光在金屬和介質(zhì)界面發(fā)生全內(nèi)反射時產(chǎn)生的衰減波在金屬表面誘導(dǎo)自由電子產(chǎn)生表面等離子體，當(dāng)波的頻率和波數(shù)相等時，兩者產(chǎn)生共振，入射光被吸收，反射光能急劇下降，反射光譜上出現(xiàn)共振峰（即最低反射強度），當(dāng)吸附在金屬表面的分子數(shù)量或該分子的構(gòu)型發(fā)生變化時，可以根據(jù)峰的變化對待測物質(zhì)進行檢測[27]。目前SPR技術(shù)已被用于食品、環(huán)境、醫(yī)學(xué)檢驗檢測等領(lǐng)域，在霉菌毒素檢測中，目前已有多項研究報道了SPR在霉菌毒素檢測中的應(yīng)用。Wu W B等[28]開發(fā)了一種基于適配體的SPR生物傳感器，可以用于同時檢測AFB1和AFB2。SPR生物傳感器對兩種霉菌毒素表現(xiàn)出高度特異性，不受OTA、OTB等其他霉菌毒素的影響。盡管SPR技術(shù)在生物制藥、醫(yī)療診斷、食品安全檢測以及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域都有著豐富的研究，但其仍然還存在一些問題需要突破：（1）受環(huán)境影響大。金屬-介質(zhì)界面附近的任何微小變化都能夠?qū)е抡凵渎拾l(fā)生變化，從而影響測定結(jié)果。這些影響因子，如溶劑成分、pH、離子強度、溫度以及儀器漂移等都會對信號檢測產(chǎn)生影響。（2）成本高，操作復(fù)雜。SPR儀器價格昂貴且體積較大，不利于便攜式現(xiàn)場檢測。

結(jié) 語

由真菌代謝產(chǎn)生的霉菌毒素存在于各類食物原料及其制品中，被攝入體內(nèi)后易對人和動物機體造成急性損傷，甚至可能會導(dǎo)致死亡；殘留在食物中的霉菌毒素隨食物鏈積累，最終到達人體，誘導(dǎo)人體產(chǎn)生慢性疾病。此外，產(chǎn)生的霉菌毒素易污染糧食，導(dǎo)致糧食的營養(yǎng)價值降低，并造成額外的經(jīng)濟損失。因此，密切監(jiān)測和控制糧食在儲藏、加工、運輸?shù)冗^程中的污染狀況至關(guān)重要。實際上，對霉菌毒素百分之百的預(yù)防和控制是很難實現(xiàn)的，那么，建立靈敏、快速、簡單的霉菌毒素檢測方法就為糧食安全提供了保障。傳統(tǒng)的檢測方法，如基于液相色譜、免疫分析等方法雖具有較高的靈敏度、精確度，但存在設(shè)備精密昂貴、需要專業(yè)人員操作、繁瑣的前處理程序以及無法現(xiàn)場檢測等缺點。近年來，一些新興檢測技術(shù)不斷被開發(fā)，它們不僅兼具傳統(tǒng)方法的優(yōu)點，還克服了傳統(tǒng)方法的缺點，并且能更好地實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，這些方法在檢測糧食中的霉菌毒素具有巨大的應(yīng)用潛力。但值得注意的是，這類檢測技術(shù)還不夠完善，許多傳感技術(shù)仍然停留在實驗室階段，沒有大規(guī)模開發(fā)和使用。未來，相關(guān)檢驗部門應(yīng)當(dāng)考慮將這些技術(shù)與智能手機、大數(shù)據(jù)、智能穿戴設(shè)備等先進技術(shù)相結(jié)合，通過機器學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)等算法以實現(xiàn)精確和穩(wěn)定的即時化、商業(yè)化檢測。

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