仲崇翔　陳　建　喬　靜　楊益眾

摘要灰飛虱既是傳播水稻條紋葉枯病毒的媒介昆蟲，也是我國水稻上的主要害蟲。Wolbachia是存在于飛虱等多種昆蟲體內(nèi)的一類共生菌，它們能通過多種機制調(diào)節(jié)寄主的生殖，包括誘導(dǎo)細胞質(zhì)不親和、孤雌生殖和遺傳上的雄性雌性化等。目前對這類微生物的研究已取得了重要進展。本文綜述了Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布、傳播方式及其對灰飛虱種群的影響，并初步探討了利用其生物防治的可能性。

關(guān)鍵詞灰飛虱；Wolbachia；生物學(xué)；生物防治

中圖分類號S 435．131．49

沃爾巴克氏體(Wolbachia)是存在于節(jié)肢動物體內(nèi)的一種立克次氏體細菌，其分類地位屬原核生物界、細菌門、變形菌綱的。亞綱、立克次氏體目、立克次氏體科、Wolbachia族、Wolbachia屬，在宿主中通過細胞質(zhì)遺傳傳給下一代。據(jù)統(tǒng)計，目前有15％～20％的昆蟲感染了這類細菌，遍及昆蟲綱的10多個目。除此外，Wolbachia還普遍寄生于甲殼動物、蛛形綱類、螨類、絲狀線蟲體內(nèi)，是分布最廣、豐度最大的共生細菌類群。這類微生物可以改變宿主的生殖行為，導(dǎo)致細胞質(zhì)不親和(cytoplasmic in—compatibility，CI)、誘導(dǎo)雌性化(feminization)和孤雌生殖(parthenogenesis inducing，PI)、殺雄(malekilling)現(xiàn)象等，這些現(xiàn)象并能通過Wolbachia垂直傳遞。農(nóng)作物上許多重要的、甚至傳播家畜和人類疾病的害蟲都能感染W(wǎng)olbachia)。所以，有學(xué)者提出利用Wolbachia侵染害蟲，導(dǎo)致寄主生殖力變化來控制甚至消滅對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及人類健康有重要影響的害蟲。

水稻條紋葉枯病是由灰飛虱(Laodelphaxstri—atellus)傳播的一種水稻病毒病害，近些年在長江中下游稻區(qū)肆虐。進入21世紀(jì)后，該病的發(fā)生范圍和損害度逐年擴大，已成為江淮稻區(qū)水稻生產(chǎn)上最主要的病害之一。調(diào)查顯示：2000年和2001年江蘇省條紋葉枯病的發(fā)病面積分別為67萬hm²和100萬hm²，到了2004年，該省220萬hm²的水稻有近90％的面積發(fā)病，涉及全省2／3縣(市)。其中偏重發(fā)病(病株率為10％～30％)和重發(fā)成災(zāi)(病株率>30％)的面積分別占17．1％、3．6％，另有近0．5％的水稻面積只好毀苗改種其他作物。據(jù)一些專家的保守估計，2004年僅灰飛虱引起的條紋葉枯病一項，就給江蘇地區(qū)的經(jīng)濟造成了近百億元的損失。

對灰飛虱的防治，目前主要有農(nóng)業(yè)防治、生物防治、化學(xué)防治等。這些方法雖然都有一定的效果，但遠遠沒有達到人們的期望值，同時在防治灰飛虱和條紋葉枯病過程中也暴露出亂用濫用化學(xué)農(nóng)藥和環(huán)境污染等問題。而Wolbachia是灰飛虱體內(nèi)普遍存在的一類共生菌，所以有些專家設(shè)想：利用基因工程方法即媒介昆蟲一共生菌技術(shù)轉(zhuǎn)化這些共生菌，讓共生菌攜帶、表達和釋放對病原微生物有專性的毒蛋白(對昆蟲和共生菌沒有副作用)，這樣病原微生物在昆蟲體內(nèi)被殺死，疾病的傳播也就被終止了。因此，探討Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布及作用機制對防治灰飛虱和控制水稻條紋葉枯病都具有極其重要的意義。

1Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布與檢測

探討灰飛虱與Wolbachia之間的關(guān)系是對灰飛虱傳播水稻條紋葉枯病進行媒介昆蟲一共生菌防治技術(shù)研究的基礎(chǔ)。因此，了解Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布及如何檢測對防治水稻條紋葉枯病有實際指導(dǎo)意義。

1．1Wolbachia在灰飛虱體內(nèi)的分布

由于Wolbachia經(jīng)卵傳遞，而且它與生殖類型有關(guān)，所以人們最初把對Wolbachia的研究都集中在宿主生殖組織中，忽視了Wolbachia在非生殖組織中的分布狀況。自從1997年Min等發(fā)現(xiàn)一些果蠅被Wolbachia感染后會導(dǎo)致宿主生命周期下降，越來越多的注意力開始集中到Wolbachia在非生殖組織即宿主體細胞中的分布。研究表明，Wolbachia在節(jié)肢動物體內(nèi)的廣泛分布均是在非生殖組織中。

影響Wolbachia在宿主體內(nèi)分布的因素是多方面的。胚胎發(fā)育過程是最主要的影響因素之一，但其影響程度在不同物種之間不盡相同。對灰飛虱的研究表明，灰飛虱的早期發(fā)育已決定了Wolbachia在其體內(nèi)的分布部位，在灰飛虱的頭、胸、腹、唾液腺、消化道及生殖組織中都存在著Wolbachia，而在脂肪體、腸細胞、一些腺體及輸精管中沒有觀察到。

1．2 Wolbachia的檢測技術(shù)

大多數(shù)立克次氏體無法在寄主體外進行培養(yǎng)，所以對Wolbachia的檢測很難用傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法。目前的檢測方法主要是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子檢測。在此之前人們還運用過DAPI染色法(用非特異性的DNA-blinding熒光染料DAPI染色，然后在熒光顯微鏡下觀察)和電鏡分析技術(shù)對Wolbachia進行定性檢測。電鏡分析技術(shù)中透射電鏡觀察的結(jié)果與超薄切片的質(zhì)量密切相關(guān)。由于許多昆蟲組織制樣的不易操作性，使得切片質(zhì)量不夠理想。分子生物學(xué)方法的快速發(fā)展，尤其是PCR技術(shù)的發(fā)展和分子系統(tǒng)學(xué)方法的應(yīng)用使得這些細胞內(nèi)微生物的鑒別有了重大突破。

Wolbachia的分子檢測一般選取wsp基因(外膜蛋白基因)、ftsZ基因(細胞分裂基因)、16SrDNA和23SrDNA等設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，其中以wsp基因最為常用。研究表明，wsp基因比ftxZ基因的進化速度快，因而利用wsp基因能揭示W(wǎng)olbachia更為詳細的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。但PCR作為一種檢測手段也有一定的局限性，采用PCR和Western雜交等方法聯(lián)合檢測，可以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2Wolbachia在灰飛虱種群內(nèi)的傳遞

通過對宿主生殖系統(tǒng)的解剖，發(fā)現(xiàn)Wolbachia能夠有效地侵入宿主群體，而不需要通過感染或其他方式的傳播途徑。在Wolbachia擴散的同時，它能夠帶動與之相關(guān)聯(lián)的其他細胞質(zhì)因子，如線粒體等在宿主群體中傳播。這一遺傳模式導(dǎo)致了感染W(wǎng)olbachia的雌性個體的增加。但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Wolbachia在同種宿主的不同個體間也有水平傳遞。

2．1影響Wolbachia在灰飛虱群體內(nèi)擴散的因素

影響Wolbachia在昆蟲群體內(nèi)擴散的因素有3個：一是Wolbachia的傳遞率，即宿主將Wobachia傳遞給后代的比率；二是細胞質(zhì)不親和(CI)的表達強度，即Wobachia引起的宿主細胞質(zhì)親和的水平；三是Wolbachia對宿主生殖力的影響。極端高溫、

抗生素、昆蟲的遷飛和非適齡交配等也會影響Wol—bachia在昆蟲群體內(nèi)的擴散。

研究表明，室內(nèi)飼養(yǎng)感染的灰飛虱種群比室外的更易將Wolbachia傳遞給后代。這說明自然界可能存在一些抑制Wolbachia的因素，如高溫和抗生素，它們可消除Wolbachia或降低其密度，而Wolbachia需達到一定密度后才能穩(wěn)定遺傳給后代。

2．2 Wolbachia的水平傳遞

長期以來，人們都認為Wolbachia是垂直傳遞的，但最近發(fā)現(xiàn)Wolbachia存在著水平傳遞的可能性。雖然目前對水平傳遞的機制還不太清楚，并且還沒有直接證據(jù)證明天然水平傳遞是否存在，但在實驗室內(nèi)人們已通過跟蹤損傷和暴露的血淋巴或通過Wolbachia的顯微注射發(fā)現(xiàn)了水平傳遞”門。Werren等于1995年首次報道了Wolbachia在不同昆蟲種間的水平傳遞；Heath等人在實驗室條件下，利用不同種間的寄主昆蟲傳播Wolbachia獲得了成功。甘波誼等以PCR方法檢測了來自不同地域稻田的3種稻飛虱，發(fā)現(xiàn)灰飛虱、褐飛虱(Nilapar—ratalugens)、白背飛虱(Sogatellafurci／fre)均被Wolbachia所感染，進一步的分析證實了這些飛虱為同種或極為相近的Wolbachia感染。同時發(fā)現(xiàn)能寄生于上述3種飛虱的稻虱紅螯蜂(Haplogonalo—pusjaponicus)也受同種Wolbachia感染。這些都暗示了Wolbachia的水平傳播。

3WoJbachia對灰飛虱生殖的影響

Wolbachia對灰飛虱生殖的影響主要包括細胞質(zhì)不親和，誘導(dǎo)孤雌生殖，雌性化以及殺雄性等多個方面，其中研究最多、最深入的當(dāng)屬細胞質(zhì)不親和。

3．1細胞質(zhì)不親和(CI)的作用原理

CI是存在于多種昆蟲種群體內(nèi)的一種胚胎發(fā)育異?，F(xiàn)象。研究表明，當(dāng)感染了Wolbachia雄性個體與非感染的雌性個體交配時，通常不產(chǎn)生或者產(chǎn)生極少量的子代。而如果雌性個體感染了Wol—bachia，與任何雄性個體交配均能產(chǎn)生正常數(shù)量的子代。這樣，感染了Wolbachia的宿主與非感染的同種昆蟲相比較在生殖量上就明顯不同。進一步的研究認為，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于Wolbachia結(jié)合了宿主的某種生殖細胞特異染色體蛋白并在隨后的精子發(fā)生過程中將這種蛋白質(zhì)攜至精細胞外，從而影響了受精后的第1次有絲分裂過程。

3．2CI在灰飛虱體內(nèi)的表達強度

對灰飛虱的研究表明，Wolbachia引起的CI現(xiàn)象廣泛存在于灰飛虱體內(nèi)。當(dāng)灰飛虱在室內(nèi)適齡交配的情況下，其CI表達強度接近100％。自然界中由于存在著隨機交配，使得CI的表達強度有所降低，例如已經(jīng)感染W(wǎng)olbachia的雄蟲與沒有感染W(wǎng)olbachia的雌蟲交配是親和的，但可降低CI的表達強度。Hiroakiet等對灰飛虱和白背飛虱的研究表明，宿主的CI表達水平與雄性個體體內(nèi)Wol—bachia的含量呈正相關(guān)。

3．3Wolbachia對灰飛虱生殖力的影響

對灰飛虱生殖力的研究發(fā)現(xiàn)，Wolbachia的存在能提高宿主的生殖力。Wolbachia+灰飛虱能產(chǎn)生更多的子代，且和正常灰飛虱相比差異顯著。雖然此特性對控制灰飛虱的種群暴發(fā)也許不利，但從另一方面看，Wolbachia灰飛虱所表現(xiàn)出的明顯生殖優(yōu)勢倒為媒介昆蟲一共生菌技術(shù)的研究提供了新的思路：即將Wolbachia導(dǎo)人一些中性昆蟲或天敵昆蟲體內(nèi)，如果也能表現(xiàn)出生殖優(yōu)勢，則為媒介昆蟲一共生菌技術(shù)的應(yīng)用提供了材料；如果利用工程技術(shù)讓灰飛虱體內(nèi)的Wolbachia攜帶能控制條紋葉枯病毒的毒蛋白，媒介昆蟲一共生菌技術(shù)也同樣發(fā)揮了應(yīng)有的作用。

4利用Wolbachia控制灰飛虱

4．1CI在灰飛虱生物防治上的可能性

研究指出，Wolbachia既能相對穩(wěn)定地遺傳，又能通過外界因素去除，這些都有利于對它的利用。對于如何利用CI，人們曾設(shè)想進行抗體基因的轉(zhuǎn)化，再放回到昆蟲體內(nèi)，利用CI的特性使工程昆蟲的種群在自然界中擴大，抗體基因得以表達，介體昆蟲的傳毒能力就被逐漸削弱，最終達到阻斷這類害蟲傳播病毒的目的。例如，有人就曾設(shè)想利用果蠅特異的Wolbachia超感染灰飛虱，并使之穩(wěn)定地遺傳，在超感染的Wolbachia中轉(zhuǎn)入抗病的目的基因，通過超感染傳播進行種群取代，將抗病基因在灰飛虱群體中不斷地擴散，從而為水稻蟲媒病毒病害的防治提供新的解決途徑。不過，利用Wolbachia引起的CI防治灰飛虱，必須解決引起CI的生化機制、Wolbachia的分布范圍及體外培養(yǎng)等問題，這樣才能將抗病的外源基因直接轉(zhuǎn)入Wolbachia中，然后將Wolbachia導(dǎo)人事先用抗生素處理過的灰飛虱體內(nèi)，Wolbachia就可通過CI帶動抗病基因在群體中擴散并逐漸占優(yōu)勢。

4．2PI在灰飛虱生物防治上的潛能

Wolbachia所誘導(dǎo)的孤雌生殖也有可能應(yīng)用于生物防治。Stouthamer提出了這種潛在利用的價值””。因為孤雌生殖將有更高的種群增殖率和更多的產(chǎn)卵量。如果將Wolbachia移植到對生產(chǎn)上有重要意義的昆蟲天敵體內(nèi)，使其大量繁殖，就能達到控制害蟲的目的。當(dāng)然，灰飛虱傳毒是一個復(fù)雜的過程，而且不同地區(qū)的灰飛虱與病毒的親和力、病毒在介體內(nèi)的循回期均不同，灰飛虱種群還存在生物型和生態(tài)型分化等現(xiàn)象，因此，如何利用工程灰飛虱防治水稻條紋葉枯病，還需要不斷探索和實踐。另外，在釋放轉(zhuǎn)基因昆蟲前，還需要進行介體昆蟲的群體遺傳學(xué)試驗和安全性測定，以便釋放的轉(zhuǎn)基因昆蟲對環(huán)境是安全的。