陳麗靜　李天來(lái)　李君明　宋　燕　王玉昆　王孝宣　徐合金

摘要根據(jù)番茄葉霉病高抗基因Cf-9的基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)特異擴(kuò)增引物，以近等基因系和本組的多重PCR檢測(cè)材料為試材，擴(kuò)增cf-9基因1～2867bp之間的單拷貝片段，3對(duì)引物分別擴(kuò)增出560bp，1 000bp，1 080bp的特異片段。分別用限制性內(nèi)切酶TaqI，HindⅢ，HinfⅠ，EcorⅠ酶切，限制性內(nèi)切酶Taq工酶切特異引物SCARl擴(kuò)增的560特異片段具有酶切多態(tài)性，抗病品種酶切出450 bp，330 bp，290 bP的特異片段，感病品種酶切出450 bp，290bp的特異片段。初步建成番茄葉霉病高抗基因cf-9的CAPS標(biāo)記，經(jīng)近等基因系及其雜交種檢驗(yàn)，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于番茄cf-9抗病基因輔助選育。

關(guān)鍵詞番茄；葉霉??；C9基因；CAPS標(biāo)記

中圖分類號(hào)S 432．23

番茄是全世界產(chǎn)量最高的30種農(nóng)作物之一，其年產(chǎn)量除馬鈴薯外遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出其他蔬菜作物。每年由于病蟲危害，經(jīng)常造成全世界番茄大面積減產(chǎn)。番茄生產(chǎn)上經(jīng)常發(fā)生的病害已達(dá)40多種，其中番茄葉霉病[Fuluia fulva(Cook)]就是一種番茄生產(chǎn)中普遍發(fā)生的病害。葉霉病對(duì)保護(hù)地番茄生產(chǎn)危害尤為突出。隨著保護(hù)地番茄種植面積的擴(kuò)大及連作時(shí)間的延長(zhǎng)，該病的危害也日趨嚴(yán)重。番茄葉霉病發(fā)病率很高，此病一旦出現(xiàn)，迅速傳播蔓延。番茄葉霉病給番茄生產(chǎn)帶來(lái)了不可低估的影響。1883年，英國(guó)首次報(bào)道了番茄葉霉病的發(fā)生。從此以后，世界各國(guó)的科學(xué)工作者已對(duì)番茄葉霉病的特征特性，抗源的篩選、抗病遺傳及抗性機(jī)制等諸多方面進(jìn)行了較為全面的研究。抗病基因是抗病育種的基礎(chǔ)，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們應(yīng)用遺傳圖譜和分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)番茄抗葉霉病基因進(jìn)行定位和遺傳學(xué)研究，已有多個(gè)抗性基因被克隆出來(lái)，部分基因的結(jié)構(gòu)、功能和抗病機(jī)制已明確，有的已經(jīng)被利用在分子育種上，這為生產(chǎn)上有效控制番茄葉霉病提供了一條新途徑。本文根據(jù)已發(fā)表Genbank中Cf—9基因的基因序列，創(chuàng)建了番茄葉霉病高抗基因Cf-9的CAPS標(biāo)記，可用于番茄Cf—9抗病基因輔助選育。

1材料與方法

1．1試材

本試驗(yàn)所用番茄Moneymaker、Motelle、Movi-one、Mobaci、Moperou、Mospomor、Mogeor等試材由法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院(INRA)蔬菜果樹遺傳研究所提供，它們均是以Moneymaker為遺傳背景含有不同抗病基因的近等基因系，其中對(duì)番茄葉霉病的抗性基因型詳列于表1。2000年秋，利用上述材料配制了MotelleXMovione、Mogeor×Movione和Mogeor×Motelle等3個(gè)雜交組合。LA3047是從美國(guó)番茄遺傳中心(TGRC)引入的含有CF-9基因的材料。番茄CLN2037E試材是從亞洲蔬菜研究發(fā)展中心(AVRDC)引入的含有抗晚疫病Ph-3基因的新材料，AilsaCraig是從美國(guó)番茄遺傳中心(TGRC)引入的番茄試材，92155為本組選育出的優(yōu)良加工類型新品系，00383X 92155為從保加利亞遺傳研究所引入的含有雄性不育ps-2基因的新材料與本組92155雜交得到的雜種一代。

1．2引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已發(fā)表的Cf-9基因的基因序列(GenBankaccessionnumberUl5936)，該基因全長(zhǎng)2 867 bp，利用DNAMANversion 4．0(Primer 3．0)軟件設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增的3對(duì)PCR特異引物，擴(kuò)增Cf-9基因1—2867bp之間的單拷貝片段，3對(duì)引物分別為SCARlR： ATCCAACAAGATGATTGTGAGA-GA， SCARlF： CAAACTGGTTGC,GATAC-CTATTTC；SCAR2R：ATCCAACAAGATGATT—GTGAGAGA， SCAR2F：ACTAAACCACTT-GAATGC~AGTAT；SCAR3R：GTGGTCAACT—-CAATATCCAGCA，SCAR3F：TGGTTGAGAG——GAACGAATACCT；引物序列及不同基因型材料的特異性擴(kuò)增片段詳見表2。引物均由上海生物工程技術(shù)公司合成。

1．3DNA提取

所有試材播種于溫室，待幼苗長(zhǎng)出2～3片真葉時(shí)取葉片提取DNA。提取方法參照Williamson等(1994)方法，由CTAB法提取，瓊脂糖電泳法檢測(cè)DNA濃度，然后貯備在-20℃的冰箱中備用。用于PCR反應(yīng)的全部藥品購(gòu)自上海普洛麥格生物技術(shù)工程有限公司。

1．4PCR擴(kuò)增體系

PCR反應(yīng)總體系為25μL，包括Buffer 2．5 μL、dNtPs各0．1mmol／L、Mg²⁺的濃度為1．5mmol／L、引物0．2tanol／L、Tap酶1．0U、模板DNA為20ng,終體積用水加至25μL。用于擴(kuò)增含有cf9基因的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃變性3min然后92℃ 30s、56℃1min，72℃30s循環(huán)30次；最后72℃延伸8min，擴(kuò)增產(chǎn)物貯藏在4℃保存。PCR產(chǎn)物用1．5％瓊脂糖凝膠在5v／cm電壓條件下電泳2h，終結(jié)果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)成像顯示。

1．5限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)

1．5．1TaqI酶切反應(yīng)20／μL體系，7μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、2μL bufferE，1μL TaqI(Promage)，0．2bLl％BSA，用ddH20補(bǔ)足體積。65‘C保溫1．5～2．0h，然后加入loadingbuffer終止反應(yīng)，用1．5％瓊脂糖凝膠在5V／cm電壓條件下電泳2h，終結(jié)果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)顯示。

1．5．2HindⅢ酶切反應(yīng)

20rtl體系，7μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、2 μL buff—erM，lμL HindⅢ(Promage)，0．2 μL l％BSA，用ddH₂O補(bǔ)足體積。37℃保溫4．0～6．0h，然后加入loading buffer終止反應(yīng)，用1．5％瓊脂糖凝膠在5 V／cm電壓條件下電泳2 h，終結(jié)果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)顯示。

1．5．3HinfI酶切反應(yīng)

20lμL體系，7μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、2 μL buff—err，1μL HinfI(Promage)，0．2μL 1％BSA，用ddH₂O補(bǔ)足體積。37℃保溫4．0～6．0h，然后加入loadingbuffer終止反應(yīng)，用1．5％瓊脂糖凝膠在5v／cm電壓條件下電泳2 h，終結(jié)果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)顯示。

1．5．4EcorI酶切反應(yīng)

20μL體系，7μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物、2rtlbuffe—rO，l taL EcorI(Promage)，0．2 rtl 1％BSA，用ddH20補(bǔ)足體積。37℃保溫4．0～6．0h，然后加入loadingbuffer終止反應(yīng)，用1．5％瓊脂糖凝膠在5V／cm電壓條件下電泳2 h，終結(jié)果用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)顯示。

2結(jié)果與分析

2．1特異引物的擴(kuò)增結(jié)果

以15個(gè)含不同抗性基因的番茄葉霉病鑒別寄主品種總基因組DNA為模板，用本研究設(shè)計(jì)并合成的3對(duì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所有的材料分別擴(kuò)增出條帶，3對(duì)引物無(wú)論是抗病材料還是感病材料分別擴(kuò)增出560bp，1 000 bp，1 080 bp的特異片段，3個(gè)片段大小分別與Cf-9基因中兩對(duì)應(yīng)引物之間的片段大小吻合，因此可以推斷引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增程序是可行的，所擴(kuò)增的應(yīng)該是Cf-9基因或其等位基因的單拷貝片段。

2．2 Cf-9基因CAPS標(biāo)記的獲得

利用限制性內(nèi)切酶TaqI，HindⅢ，HinfI，Ecorl分別對(duì)該3對(duì)特異引物的擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切，只有限制性內(nèi)切酶TaqI酶切特異引物SCARl擴(kuò)增的560 bp特異片段具有酶切多態(tài)性，而其他組合不具酶切多態(tài)性。利用SCARl正反引物擴(kuò)增全部試材，無(wú)論是抗病材料還是感病材料均擴(kuò)增出560 bp的特異性片斷，經(jīng)TaqI酶切后(圖1a、b)，抗感病材料均存在酶切位點(diǎn)，其中抗病基因型LA3047抗病材料分別產(chǎn)生了450bp、330bp和290 bp大小的特異性片斷，而其余的感病基因型共14份材料分別產(chǎn)生了450 bp和290 bp大小的特異性片斷。經(jīng)近等基因系及其雜交種多次檢驗(yàn)，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于番茄Cf-9抗病基因輔助選育。

3討論

分子標(biāo)記選擇是農(nóng)作物分子育種的關(guān)鍵技術(shù)。在已知基因序列的情況下，要建立簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠的標(biāo)記選擇體系，往往要針對(duì)基因單拷貝或低拷貝的序列進(jìn)行擴(kuò)增，一般情況下，抗病基因之間具有極高的同源性，抗病基因與其等位基因也具有很高的同源性，單用特異引物擴(kuò)增，利用瓊脂糖凝膠電泳，將難以檢測(cè)這些差異，但是同源序列間往往存在一些堿基變異，限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別單個(gè)堿基的差異，利用酶切位點(diǎn)的多態(tài)性即可建立抗病基因的CAPS標(biāo)記。CAPS標(biāo)記作為PCR和酶切技術(shù)相結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù)，可以從單個(gè)的堿基差異進(jìn)行分別，這為創(chuàng)建穩(wěn)定可靠的共顯性標(biāo)記提供了一條捷徑，在標(biāo)記輔助選擇育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。

隨著染色體技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)用于番茄抗病基因定位以來(lái)，有關(guān)葉霉病抗性基因的遺傳及染色體定位研究取得了很大的進(jìn)步。番茄葉霉病抗性受顯性單基因控制，抗病性為顯性，屬于垂直抗性，大多表現(xiàn)為質(zhì)量性狀遺傳。Kerr和Bailey在1964年將Cf-1基因定位于番茄1號(hào)染色體。研究結(jié)果還表明，Cf-4和Cf-9基因緊密連鎖，位于1號(hào)染色體短臂上：9)，C2和Cf-5緊密連鎖，位于6號(hào)染色體臂上。Cf-1，Cf-2，Cf-4，Cf-5及Cf-9的連鎖圖可以在http：／／gerec．ifas．ufl．edu／tgc／newslet—ters／vol42／v422p19．html網(wǎng)址找到。CECP2被定位在1號(hào)染色體上，與Cf-4／Cf-9緊密連鎖。1980年Kanwar等把所有24個(gè)抗葉霉病基因已全部定位于番茄12條不同的染色體，對(duì)這24個(gè)基因在染色體上的定位及分離仍在繼續(xù)進(jìn)行。其中Cf-10，Cf-16，Cf-12，Cf-21這4個(gè)基因在染色體上的位點(diǎn)又有了新的變更。隨著AFLP技術(shù)的出現(xiàn)，Thomas等用BSA(bulked segregant analysis)方法，利用番茄與野生種勻copersiconpennellii種間雜交F，群體發(fā)現(xiàn)42 000條AFLP帶與番茄抗葉霉菌基因Cf-9緊密連鎖，其中3個(gè)標(biāo)記(M1，M2，Ma)與Cf-9基因表現(xiàn)共分離。Laugh等發(fā)現(xiàn)在Cf-9基因片斷附近還存在一個(gè)甚至數(shù)個(gè)對(duì)葉霉病表現(xiàn)抗性的基因，但抗病性比Cf-9弱，這可能是Cf-9基因至今仍未被葉霉病病原菌克服的原因。1993年Cf-9基因被克隆，這一成果為本研究CAPS標(biāo)記的建立奠定了基礎(chǔ)。本研究利用Cf-9基因的Gen—bank基因序列創(chuàng)制分子標(biāo)記，所獲得的CAPS標(biāo)記與抗病基因共分離，選擇的穩(wěn)定性與可靠性將明顯優(yōu)于前者，這將為Cf-9基因的分子標(biāo)記輔助育苗提供高效選擇手段。