臺蓮梅　許艷麗　閆鳳云

摘要引起大豆根腐病的尖孢鐮刀菌粗毒素不僅能使大豆根部產(chǎn)生類似病菌侵染引起的癥狀，而且能抑制大豆幼根的生長和對大豆幼苗具有致萎作用；用毒素濾液處理大豆胚根和幼根，測定大豆不同品種抗病性，用盆栽土壤作對照，試驗結(jié)果基本一致。利用毒素濾液測定不同品種對大豆根腐病的抗病性，可應用于大量的初篩工作。

關(guān)鍵詞尖孢鐮刀菌；毒素；大豆；抗病性

中圖分類號S 432．23

大豆根腐病是大豆的重要病害之一，是一種分布較廣、危害較重、防治困難的土傳病害。我國大豆根腐病主要分布于黃淮地區(qū)的夏大豆和北方春大豆生產(chǎn)區(qū)，其中黑龍江省東北部地區(qū)發(fā)生較重。根腐病使大豆常年減產(chǎn)10％～30％，重病地區(qū)可減產(chǎn)60％。尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)是引起大豆根腐病的主要致病菌，目前對該病的防治主要是通過藥劑拌種，防效期一個月左右，而且只能防幼苗時期，防治效果不是十分理想。應用抗病品種控制該病是首選的措施，但常規(guī)的抗性鑒定耗時費工，易受環(huán)境條件影響。在研究了尖孢鐮刀菌產(chǎn)毒條件的基礎上，進一步研究用該毒素鑒定大豆品種抗病性，試圖探索出一種快速、簡便鑒定品種抗性的方法。

1材料與方法

1．1供試菌株

供試菌株從大豆病株上分離，并經(jīng)柯赫氏法則驗證。

1．2供試品種

由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院大豆研究所、綏化所、合江所、東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所、黑龍江八一農(nóng)墾大學科研所等提供品種。

1．3大豆不同品種抗性鑒定

1．3．1病原菌擴繁

菌株在PSA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7d左右，再將病原菌接種到玉米砂培養(yǎng)基上進行擴繁，于25℃培養(yǎng)25d左右，用作接菌。

1．3．2土壤接種

取田間自然土壤經(jīng)過篩后，用50倍的福爾馬林液進行土壤消毒，1 m²澆1 000mL。

將三角瓶的玉米砂培養(yǎng)菌倒出，攪碎混勻，然后和無菌土按質(zhì)量比4：30的比例充分混合配成菌土。將接好菌的土裝人口徑15 cm的花盆內(nèi)，每盆土壤的量保持一致，播種前預先灌水保濕2～3 d，每盆播種10粒大豆種子，每一品種處理3盆。

1．3．3發(fā)病調(diào)查

在幼苗二出復葉展開時進行病害調(diào)查。從土壤中取出苗，將根部沖洗干凈，調(diào)查病情指數(shù)。

病情分級標準為，0：幼苗莖基部和主、須根均無病斑；1：莖基部和主根上有少量病斑；2：莖基及主根上病斑較多，病斑面積占莖和根總面積的1／4—1／2；3：莖基部及主根上病斑多且較大，病斑面積占莖基部和根總面積的1／2～3／4；4：莖基部或主根上病斑連片，形成繞莖現(xiàn)象，但根系并未死亡；5：根系壞死，地上部萎蔫或死亡。

1．4毒素培養(yǎng)濾液制備及提取

菌株移接在PSA平板培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)7d，沿菌落邊緣打出直徑為8cm菌片，接人裝有100mL培養(yǎng)液的250mL三角瓶內(nèi)，每瓶接4片，置25～30℃下光照培養(yǎng)15d。培養(yǎng)液經(jīng)過濾，再高溫滅菌20min，濾液保存在4℃冰箱內(nèi)，供測試用。毒素的提取采用炭吸附法提取。

1．5粗毒素的毒性測定

1．5．1毒素對大豆根部的致病性

挑選大小一致的大豆種子，用漂白粉浸種10min，進行表面消毒。用無菌水清洗3遍后，加水置25℃恒溫箱浸泡4—5 h，然后于25℃下催芽，待胚根長4～5cm時，置于加有10mL毒素原液直徑為11 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，皿內(nèi)底部鋪一張濾紙，大豆上蓋一張濾紙，在25℃下恒溫處理48h，進行癥狀觀察。另外，用菌絲塊接種于大豆胚根上，觀察發(fā)病情況。

1．5．2毒素對大豆胚根生長的影響

采用抑制胚根生長測定法。將供試的大豆種子用清水洗凈，用漂白粉溶液(1：14)浸種10 min，進行表面消毒。用無菌水沖洗3遍后加水置25℃恒溫箱浸泡4—5 h，然后于25℃下催芽(待芽長2—3 mm為宜)，然后將大豆種子胚芽向下置于加有5mL濾液的培養(yǎng)皿內(nèi)，皿內(nèi)鋪一張無菌濾紙。以空白培養(yǎng)液處理為對照。25℃黑暗下培養(yǎng)，48 h后測定并計算胚根生長抑制率。每處理30粒種子，3次重復。

胚根生長抑制率＝[(對照胚根生長長度一處理胚根生長長度)／對照胚根生長長度]X100％。

1．5．3毒素對大豆幼苗的致萎性

取一出復葉剛展開的大豆幼苗，根系洗凈后切去一小段根，浸入裝有毒素溶液的試管中，毒素液內(nèi)含有少許鏈霉素，防止細菌污染。

觀察萎蔫情況。植株反應級別分為無反應、輕度反應、中度反應和重度反應。其標準是：無反應，植株正常，葉片無萎蔫；輕度反應，真葉下垂或卷曲，復葉正常；中度反應：真葉、復葉卷曲，重度反應：整個葉片卷曲至枯死。

1．6培養(yǎng)濾液對大豆不同品種胚根生長的影響

方法同1．5．2。

1．7培養(yǎng)濾液對大豆不同品種幼根細胞透性的

影響

將大豆種子表面消毒后，浸種4—5 h，擺于鋪有無菌濾紙的磁盤內(nèi)(35cmX25cm)，置于25℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)3—4d，取長勢一致的幼根用于試驗。

采用電導法測定細胞膜透性。

2結(jié)果與分析

2．1毒素的毒性測定

2．1．1毒素引起大豆根部的癥狀

用粗毒素接種后，毒素對大豆生長發(fā)育具有抑制作用，經(jīng)毒素液處理后的大豆根未形成側(cè)根，胚根變褐，壞死，產(chǎn)生的癥狀與病原菌接種所引發(fā)的癥狀相似。

2．1．2毒素對大豆胚根生長的影響

對毒素的不同濃度進行了測定，當毒素體積分數(shù)分別為10％、25％、50％、75％、100％時，胚根抑制率分別為26．3％、49．2％、61．0％、64．2％、75．9％，表明毒素對大豆胚根生長有明顯的抑制作用，毒素濃度越高，抑制作用越強，見圖1。

2．1．3毒素對大豆幼苗的致萎性

不同的處理對大豆幼苗的致萎作用不同。結(jié)果見表1，處理24h，毒素液體積分數(shù)為100％和50％使大豆植株的真葉下垂，葉緣輕微卷曲，復葉正常；處理48h后，100％毒素液中大豆真葉、一出復葉都卷曲；72h后，100％毒素液中的植株枯死，50％毒素液中大豆真葉、復葉萎蔫。無菌水及10％毒素液處理植株正常。

2．2培養(yǎng)濾液對大豆不同品種胚根生長的抑制

作用

低濃度培養(yǎng)濾液對大豆不同品種胚根抑制率存在著差異。毒素濾液的體積分數(shù)為10％時，對抗病品種的胚根抑制率低于感病品種，抗性品種綏農(nóng)10對病原菌的抗性強，病指為20．8，對毒素也不敏感，培養(yǎng)濾液對它的胚根生長抑制率為28．8％。反之，感病品種對病原菌嚴重感病，病情指數(shù)高，培養(yǎng)濾液對它的胚根抑制率也高；然而隨著濾液體積分數(shù)的提高，胚根抑制率相應增高，品種間差異有縮小的趨勢。說明抗病品種只能忍耐一定濃度范圍的培養(yǎng)濾液毒素(表2)。

2．3培養(yǎng)濾液對大豆不同品種根細胞滲透性的

影響

50％毒素濾液處理不同品種大豆幼根后，根細胞的滲透性有明顯的不同。病菌接種后病情指數(shù)高的品種，用毒素濾液處理后其電導率較大；病情指數(shù)低的品種，毒素濾液處理后其電導率較小。在抗病品種和感病品種之間差異較大時，抗病品種和感病品種根細胞滲透性差異達極顯著水平(表3)。

3結(jié)論與討論

許多研究表明，用病原菌的毒素液進行品種的抗病性鑒定是可行的。用毒素進行品種抗病性鑒定具有快速、簡便、不受季節(jié)限制等特點。大豆根腐病是土傳病害，在田間條件下無法進行人工接種，只能靠田間的自然菌量，其鑒定的結(jié)果常受土壤條件所影響，用盆栽土壤接種法，如大量篩選抗源，工作量非常大。采用尖孢鐮刀菌培養(yǎng)濾液處理大豆胚根測定不同品種的抗性，與盆栽土壤接種法結(jié)果基本一致。因此，此方法可用于抗病育種的大量初篩工作中，具有快速、省工等優(yōu)點。用種子胚根抑制法測定不同品種抗性，要注意一個問題：要選好毒素濾液的濃度，否則誤差較大。

劉惕若等用電導法測定小麥品種對赤霉病菌的抗性差異表現(xiàn)十分明顯，并提出鑒定小麥品種抗性的細胞膜損傷率的合理級別。本試驗應用電導法測定大豆幼根的細胞滲透性大小基本上反映了大豆品種對根腐病的抗性強弱，此法的優(yōu)點是快速、簡便，試驗可在短期內(nèi)重復進行，但它與毒素濾液處理大豆胚根相比，繁瑣一些。由于電導法非常靈敏，因此必須嚴格操作，避免或減少人為誤差，提高測定的準確性。

應用毒素進行品種抗病性鑒定，抗性指標的量化還有待于進一步研究。