劉　限　郭培磊　高增貴　趙　巖

摘要：研究不同木霉菌轉(zhuǎn)化體對(duì)番茄灰霉病防治效果及機(jī)理，為木霉菌生物防治的合理利用奠定基礎(chǔ)。利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)基因整合技術(shù)(restriction enzyme mediated integration，REMI)，通過(guò)插入線性化質(zhì)粒DNA獲得了生物防治番茄灰霉病(Botrytis cinerea)效果優(yōu)于出發(fā)菌T21菌株(出發(fā)菌)的3個(gè)木霉菌轉(zhuǎn)化體Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55，對(duì)侵染花器和葉片的灰霉病防效分別比原生物防治木霉菌株提高了16.9％和8％。木霉菌轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)孢能力、分生孢子的萌發(fā)率、對(duì)碳氮源的利用能力及對(duì)高溫的抵抗能力都有所提高；木霉菌轉(zhuǎn)化體本身產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶的活性均比出發(fā)菌高，因此通過(guò)REMI技術(shù)可以獲得新的有益木霉菌轉(zhuǎn)化體，在一定程度上提高了生物菌株防治番茄灰霉病的水平。說(shuō)明REMI技術(shù)可以用于改良生防木霉菌株的功能，提高生物防治效果。

關(guān)鍵詞：限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合技術(shù)；木霉菌轉(zhuǎn)化體；番茄灰霉?。簧罊C(jī)理

中圖分類(lèi)號(hào)：S 482．2．92，S 436．412．13

保護(hù)地的高濕、適溫條件為番茄灰霉病(Botry-tis cinerea Pers.ex Tris.)的發(fā)生創(chuàng)造了適宜的環(huán)境，因而該病害成為國(guó)內(nèi)外工廠化高效農(nóng)業(yè)番茄生產(chǎn)中的主要障礙。由于目前生產(chǎn)上仍缺少抗病品種，多數(shù)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種對(duì)灰霉病高度感病，且灰霉病菌已對(duì)多種化學(xué)殺菌劑(多菌靈等)產(chǎn)生了明顯的抗藥性，嚴(yán)重制約了番茄的安全生產(chǎn)。因此構(gòu)建對(duì)保護(hù)地蔬菜各種逆境均具有明顯抗性，同時(shí)又能提高對(duì)番茄灰霉病抗性的工程菌株具有重要意義，也是今后木霉菌能否成為蔬菜葉部病害無(wú)公害防治有效手段的關(guān)鍵。本文以生物防治番茄灰霉病菌的木霉菌(Trichoderma sp.)T21菌株為對(duì)象，探索利用REMI技術(shù)改良的生物防治菌株對(duì)番茄灰霉病的防治效果及可能的生防機(jī)理，為我國(guó)生物農(nóng)藥工程菌株創(chuàng)建提供新技術(shù)，為番茄灰霉病的生物防治提供高效菌株。

1材料與方法

1.1材料

番茄品種為L(zhǎng)402。

供試木霉菌為野生菌株T21和轉(zhuǎn)化體Ttrm31、Ttrm34、Ttrm55?；颐共【缮蜿?yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物免疫室生物工程中心保存。

1.2方法

1.2.1活體植株防病效果測(cè)定

選擇發(fā)育齊一的番茄植株，接種前澆足水。選擇3株離體條件下抑病效果較好的木霉菌轉(zhuǎn)化體(Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55)，采用孢子懸浮液噴霧的方法接種。每處理10株，30株噴孢子懸浮液150 mL，然后采用隨機(jī)擺放的方法將3個(gè)處理擺放于人工氣候室中，用補(bǔ)濕器補(bǔ)濕，將濕度保持在90％以上，24 h后接種灰霉病菌，7 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.2木霉菌轉(zhuǎn)化體的孢子萌發(fā)

將5％葡萄糖的瓊脂平鋪在無(wú)菌的載玻片上，凝固后將調(diào)整到一定濃度(10³個(gè)／mL)的孢子懸浮液滴加到瓊脂上，在無(wú)菌的條件下吹干后，將載玻片放在含有水分的濾紙上，于培養(yǎng)皿中25℃下培養(yǎng)12～15 h后，在顯微鏡下調(diào)查孢子的萌發(fā)情況。

1.2.3木霉菌轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)孢能力

將含有木霉菌孢子的菌片轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基的中央，在28℃下培養(yǎng)7 d后，用10 mL無(wú)菌水將孢子洗至試管中，充分振蕩使孢子分散均勻，然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子的數(shù)量，從而計(jì)算孢子懸浮液的濃度，確定不同轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)孢能力。

1.2.4木霉菌轉(zhuǎn)化體對(duì)碳氮源的利用能力

以葡萄糖20 g，天冬氨酸2 g，KH₂PO₄1 g，Mg-SO₄·4H₂O 0.05 g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01 g，MnSO₄·4H₂O 3.2 mg，ZnSO₄·7H₂O 1.8 mg，瓊脂20 g，水1 000 mk，分別用等量的蛋白胨、硝酸鈉和尿素代替天冬氨酸，制成不同氮源的培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)化體的菌片轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿的中央，于28℃下培養(yǎng)，48 h測(cè)量菌落半徑。

以葡萄糖20 g，天冬氨酸2 g，KH₂PO₄1 g，Mg-SO₄·4H₂O 0.05 g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.01 g，MnSO₄·4H₂O 3.2 mg，ZnSO₄·7H₂0 1.8 mg，瓊脂20 g，水1 000 mL，分別用等量的蔗糖、淀粉、麥芽糖代替葡萄糖，制成不同碳源的培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)化體的菌片轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿的中央，于28℃下培養(yǎng)，每隔48 h測(cè)量菌落半徑。

1.2.5高溫對(duì)轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)的影響

將培養(yǎng)3～4 d的轉(zhuǎn)化體和T21木霉菌菌片放置到PDA培養(yǎng)基上，在50℃條件下放置1～2 h，然后再轉(zhuǎn)移到正常溫度(25℃)下培養(yǎng)，30～40 h后測(cè)量菌落半徑。

1.2.6木霉菌轉(zhuǎn)化體幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的測(cè)定

幾丁質(zhì)酶的測(cè)定參照顧向陽(yáng)、陳捷等方法，略加改進(jìn)。β-1，3-葡聚糖酶活測(cè)定參照杜良成的方法，以葡聚糖為底物，根據(jù)從葡聚糖中釋放出葡萄糖的量來(lái)測(cè)定酶活性。

2結(jié)果與分析

2.1木霉菌轉(zhuǎn)化體對(duì)番茄灰霉病防治效果

采用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合(REMI)技術(shù)，獲得木霉菌轉(zhuǎn)化體并應(yīng)用于番茄灰霉病防治，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)和離體葉片試驗(yàn)篩選出3株對(duì)灰霉病菌生防效果好的木霉菌轉(zhuǎn)化體菌株Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55。然后將此3株菌株在整株番茄上進(jìn)行了對(duì)番茄灰霉病的防治試驗(yàn)。結(jié)果表明，所有番茄均已發(fā)病，發(fā)病率都達(dá)到了35％以上。轉(zhuǎn)化體菌株Ttrm31、TtRm34和Ttrm55的發(fā)病率明顯低于野生菌株T21和對(duì)照。發(fā)病率最低的為轉(zhuǎn)化體菌株Ttrm34，發(fā)病率為36.9％。所有木霉菌轉(zhuǎn)化體對(duì)番茄灰霉病的防效比野生菌株T21的防效都有所提高，其中轉(zhuǎn)化體菌株Ttrm31對(duì)番茄灰霉病的防效是最好的，其病情指數(shù)為41.1，但是該菌株和菌株Ttrm34和Ttrm55的防效差異不明顯，菌株Ttrm34和Ttrm55的病情指數(shù)均為42.5；而野生菌株T21的病情指數(shù)為50.4；對(duì)照的病情指數(shù)為593。從中可以看出，木霉菌轉(zhuǎn)化體對(duì)番茄灰霉病的防效有了明顯的提高(圖1)。

2.2木霉菌轉(zhuǎn)化體生防活性機(jī)理的研究

2.2.1不同木霉菌轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)孢情況

由圖2看出，不同轉(zhuǎn)化體產(chǎn)孢能力的差異達(dá)到

了極顯著水平。Ttrm34產(chǎn)孢能力最高，極顯著高于野生菌株T21，而轉(zhuǎn)化體Ttrm31和Ttrm55的產(chǎn)孢能力基本上與野生菌株T21一致，都達(dá)到了10⁹個(gè)／mL。說(shuō)明REMI技術(shù)插入的位點(diǎn)不同，從而影響了轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)孢能力。

2.2.2木霉菌轉(zhuǎn)化體分生孢子的萌發(fā)

由圖3看出，不同轉(zhuǎn)化體的分生孢子萌發(fā)率有極顯著(P=0.01)的差異，相對(duì)于野生菌株T21，轉(zhuǎn)化體的孢子萌發(fā)率發(fā)生了很大變化，其中Ttrm31分生孢子的萌發(fā)率最高，達(dá)到了94％，顯著高于T21；而Ttrm55和Ttrm34的分生孢子的萌發(fā)率分別為91％和90％，與野生菌株T21(90％)基本一致。

2.2.3木霉菌轉(zhuǎn)化體對(duì)碳氮源的利用能力

由圖4可以看出，木霉菌轉(zhuǎn)化體對(duì)不同氮源的利用能力不同。Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55可以很好地利用各種氮源，在尿素為氮源的培養(yǎng)基上12 h時(shí)就可以生長(zhǎng)，而野生菌株T21菌株則不能生長(zhǎng)；在硝酸鈉、蛋白質(zhì)和天冬氨酸為氮源的培養(yǎng)基上Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55的生長(zhǎng)速度大于野生菌株T21。另外木霉菌利用有機(jī)氮源的能力較強(qiáng)，而對(duì)無(wú)機(jī)氮源的利用能力較弱?？傮w來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)化體對(duì)各種氮源的利用能力好于野生菌株T21，說(shuō)明RE-MI插入引起了轉(zhuǎn)化體對(duì)氮源利用的差異。不同木霉菌菌株對(duì)碳源的利用能力也不同，在各種糖類(lèi)為碳源的培養(yǎng)基上，3株木霉菌轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)速度都快于野生菌株T21，說(shuō)明Ttrm31、Ttrm34和Ttrm55能夠充分利用各種碳源，生長(zhǎng)速度快，說(shuō)明REMI插入引起了轉(zhuǎn)化體對(duì)碳源的利用能力不同。另外木霉菌對(duì)不同碳源的利用能力也不同，能夠很好地利用麥芽糖、葡萄糖和蔗糖，而對(duì)淀粉的利用能力較弱。

另外從菌絲的稀疏度也可以看出不同菌株對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)的利用存在差異(表1)。不同菌株在相同的培養(yǎng)基上菌絲的稀疏度存在差異，如，在葡萄糖作為碳源的情況下，Ttrm55的菌絲比較稀疏，而其他木霉菌轉(zhuǎn)化體和野生菌株的菌絲則正常；在以天冬氨酸為氮源的情況下，個(gè)trm55的菌絲比較密，而其他木霉菌轉(zhuǎn)化體和野生菌株的菌絲則相對(duì)較稀疏。在其他氮源和碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌絲也存在菌株間稀疏度不一樣的現(xiàn)象。說(shuō)明不同菌株對(duì)各種養(yǎng)分利用能力不同，也間接說(shuō)明了轉(zhuǎn)化體是由于質(zhì)粒插入的位點(diǎn)不同造成的，說(shuō)明了有外源的基因插入。

從轉(zhuǎn)化體在各種不同氮源和碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀可以看出，不同轉(zhuǎn)化體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用能力及菌落形態(tài)和顏色均不同。

2.2.4木霉菌轉(zhuǎn)化體對(duì)高溫的耐性變化

試驗(yàn)表明，所有轉(zhuǎn)化體和野生菌株T21在50℃下處理1～2 h后再正常培養(yǎng)，均能保持正常生長(zhǎng)，而且50℃下處理1 h，還能促進(jìn)轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)，但在該溫度下處理2 h以上，轉(zhuǎn)化體和野生菌株T21的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及菌落形態(tài)將受到一定的影響。由于45～50℃下處理時(shí)間不超過(guò)1 h可保證菌株正常生長(zhǎng)，因此在夏天或者春天悶棚中應(yīng)用轉(zhuǎn)化體時(shí)不會(huì)影響生防活性的發(fā)揮(圖5)?？傊诟邷靥幚聿怀^(guò)2 h的情況下，轉(zhuǎn)化體和野生菌株可以生長(zhǎng)，而且轉(zhuǎn)化體在高溫處理1 h時(shí)，生長(zhǎng)速度反而加快了。

2.2.5酶活性的變化

2.2.5.1幾丁質(zhì)酶活性

由圖6可以看出，不同轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶的活性不同，其中Ttrm34的活性最高，其次為T(mén)trm55，野生菌株T21的活性最低。轉(zhuǎn)化體的幾丁質(zhì)酶活性普遍升高，說(shuō)明由于REMI插入的存在，激活轉(zhuǎn)化體幾丁質(zhì)酶基因，使幾丁質(zhì)酶表達(dá)量增加。但是通過(guò)F檢測(cè)，沒(méi)有達(dá)到顯著水平上的差異。

2.2.5.2β-1，3-葡聚糖酶活性

由圖7可以看出，不同轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的β-1，3-葡聚糖酶的比活性不同，其中Ttrm34的活性最高，其次為T(mén)trm55，野生菌株T21的活性最低。轉(zhuǎn)化體的β-1，3-葡聚糖酶活性提高，說(shuō)明轉(zhuǎn)化體中插入了質(zhì)粒pV2，造成β-1，3-葡聚糖酶基因的激活，但是通過(guò)F檢測(cè)，沒(méi)有達(dá)到顯著水平上的差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該酶與幾丁質(zhì)酶具有一定相關(guān)性。

3討論

3.1REMI技術(shù)可作為創(chuàng)造木霉菌變異獲得生物防治新菌株的手段之一

由于限制性內(nèi)切酶消化片段對(duì)染色體的插入是隨機(jī)的，即可能發(fā)生在無(wú)意義序列、調(diào)控序列或閱讀框架內(nèi)的一個(gè)或幾個(gè)識(shí)別位點(diǎn)上，質(zhì)粒依賴(lài)其相容末端插入被切開(kāi)的基因組中。一旦整合于有意義序列，該序列控制的一系列性狀將產(chǎn)生突變。其插入的隨機(jī)性決定著受影響的表型將是多種多樣的。目前REMI技術(shù)主要應(yīng)用于不同植物病原菌致病相關(guān)基因的研究中，且有用于創(chuàng)造木霉菌株變異、篩選新生防菌株的報(bào)道。本文在優(yōu)化木霉菌T21菌株原生質(zhì)制備、再生、轉(zhuǎn)化條件的基礎(chǔ)上，利用REMI技術(shù)將外源質(zhì)粒DNA隨機(jī)插入到木霉菌的染色體中，從而使木霉菌中某些基因激活或者失活，篩選出幾株生防機(jī)理不同的木霉菌轉(zhuǎn)化體。

3.2REMI技術(shù)可改變生物防治菌株的多種機(jī)能

研究中發(fā)現(xiàn)REMI技術(shù)可改變出發(fā)菌T21原來(lái)的一些生物學(xué)特性，如Ttrm34產(chǎn)孢量極顯著增加；Ttrm31分生孢子萌發(fā)率極顯著提高；各突變株利用碳氮源的能力有所提高；菌株對(duì)高溫的抗性也發(fā)生一定的變化，50℃高溫處理1 h可促進(jìn)木霉菌轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)，而出發(fā)菌T21在此溫度下生長(zhǎng)受到了一定的抑制。這些變化對(duì)生防活性的提高都有一定的貢獻(xiàn)，由此看出木霉菌生防活性不是哪一種機(jī)理能達(dá)到的，需要從多方面來(lái)研究?？傊琑EMI技術(shù)如結(jié)合適宜的木霉菌轉(zhuǎn)化體篩選技術(shù)，有希望成為獲得多種生物防治功能菌株或發(fā)現(xiàn)新生物防治機(jī)理的方法。

3.3木霉菌優(yōu)良轉(zhuǎn)化子為生物防治番茄灰霉病提供了新途徑

本文從REMI技術(shù)構(gòu)建的木霉菌轉(zhuǎn)化子中篩選出防效明顯提高的生防菌株，與出發(fā)菌相比轉(zhuǎn)化子對(duì)番茄花器和葉片灰霉病的防效平均提高了16.9％和8.0％。由于在溫室內(nèi)灰霉病對(duì)花器侵染后會(huì)進(jìn)一步侵染果實(shí)，從而影響番茄的產(chǎn)量，因此對(duì)花器侵染的控制，必將降低果實(shí)灰霉病的發(fā)生，對(duì)提高田間防效更有意義。篩選的轉(zhuǎn)化子多代繁殖后仍具有穩(wěn)定的抗潮霉素性能，說(shuō)明REMI技術(shù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)化子在一定條件下能實(shí)現(xiàn)不可逆遺傳改良。這反映出外源基因片段誘發(fā)木霉菌發(fā)生有益變異的潛力較大，為今后進(jìn)一步利用木霉菌插入變異潛力，開(kāi)發(fā)多功能、高效生防因子奠定了新的技術(shù)基礎(chǔ)。當(dāng)然在選擇過(guò)程中需要注意從多方面來(lái)綜合考慮木霉菌對(duì)番茄灰霉病的防治效果，不能只考慮一個(gè)方面。另外，根據(jù)木霉菌轉(zhuǎn)化體生防機(jī)理的不同，可以研究將多種木霉菌轉(zhuǎn)化體混合施用來(lái)提高木霉菌對(duì)番茄灰霉病的防治效果或許能夠改變木霉菌生防制劑活性低和不穩(wěn)定的問(wèn)題。