張國華　朱一力　賀道遠(yuǎn)　曾凡星

摘要：目的：研究不同時間一次性運(yùn)動大鼠腓腸肌AMP、ATP含量及AMPK活性，旨在闡明不同時間運(yùn)動AMPK的變化特點(diǎn)及機(jī)制。方法：62只雄性SD大鼠分為4大組：安靜對照組（n=8）、30 min運(yùn)動組（n=18）、60 min運(yùn)動組（n=18）、90 min運(yùn)動組（n=18），其中運(yùn)動組又各分為3小組（n=6），分別在運(yùn)動后即刻、1 h和6 h取材。運(yùn)動速度18 m/min，坡度10%。結(jié)果：和安靜組相比，各組ATP運(yùn)動后無顯著改變；AMP在60和90 min運(yùn)動后即刻顯著升高（0.183，0.212 Vs 0.158，P<0.05），AMP/ATP比值在60、90 min顯著升高（0.048，0．053 Vs 0.037, P<0.05，0.01），1 h回到安靜水平；各組AMPK在運(yùn)動后即刻均顯著升高（4.16，4.79，5.26 Vs 3.18, P<0.05，0.01，0.01），其中60、90 min組至1h仍保持升高，6 h回到安靜水平。結(jié)論：骨骼肌AMPK在運(yùn)動中的激活具有時間依賴性，其機(jī)制與AMP/ATP比值升高有關(guān)。

關(guān)鍵詞：AMPK；AMP/ATP比值；運(yùn)動時間；骨骼肌

中圖分類號：G804.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-3612(2008)06-0776-03

5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（5′-AMP activated protein kinase , AMPK）稱為細(xì)胞能量感受器，對運(yùn)動骨骼肌能量代謝發(fā)揮著重要調(diào)控作用［1-2］。本實(shí)驗(yàn)研究不同時間運(yùn)動AMP/ATP比值的變化特點(diǎn)及與AMPK活性的關(guān)系，探討AMPK活性變化的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)假設(shè)運(yùn)動能以時間依賴方式激活骨骼肌AMPK，其機(jī)制與AMP/ATP比值的升高有關(guān)。

1材料與方法

お1.1動物分組62只8周齡健康雄性SD大鼠，購進(jìn)時平均體重(187±14)g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供。晝夜節(jié)律人工控制光照（光照時間為07：00-19：00），環(huán)境溫度(23±2)℃，自由飲食。

大鼠隨機(jī)分為4大組：安靜對照組（n=8）、30 min運(yùn)動組(n=18)、60 min運(yùn)動組(n=18)、90 min運(yùn)動組(n=18)。除安靜組外，其余各組又分為3個小組，每小組各6只，分別在運(yùn)動后即刻(0 h)、1 h、6 h取材。取材前動物用烏拉坦腹腔麻醉（0.8 mL/100 g體重）后，速取右后肢腓腸肌的白肌部分（位于腓腸肌外側(cè)淺層）投入液氮中保存。

1.2運(yùn)動方案┰碩動物先進(jìn)行6 d適應(yīng)性訓(xùn)練，方法如下：前三天分別以10 m/min、15 m/min、20 m/min的強(qiáng)度和10 min、20 min、30 min的時間進(jìn)行遞增負(fù)荷和時間跑臺運(yùn)動，后3 d固定于20 m/min的強(qiáng)度和30 min的時間進(jìn)行運(yùn)動，坡度均為10%，每天一次，在上午9:00-10:00進(jìn)行，周日休息。適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后，動物進(jìn)行一次性運(yùn)動。速度18 m/min，坡度10%，相當(dāng)于65%V·O2max強(qiáng)度，時間分別為30、60、90 min。

1.3測試方法AMP、ATP含量測定使用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。樣品前處理過程：稱取肌組織100 mg，剪碎后加入0.9% NaCl（內(nèi)含0.5 mM EDTA-2Na）制成10%勻漿液，取0.5 mL勻漿液加入0.5 mL 3% HClO4，4℃下沉淀蛋白，3 000轉(zhuǎn)/min4℃離心10 min，取上清液0.5 mL加入20% KOH 40 μL， 4℃靜置30 min，11 000轉(zhuǎn)/分5 min離心，取上清200 μL -80℃保存待測。色譜條件為：日本Dikma公司ODS-3反相柱(250×4.6 mm) ，流動相為50 mmo1/L磷酸鉀緩沖液，調(diào)pH至6.5，等比洗脫，流速為1.2 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫20℃，進(jìn)樣量20 μL。

AMPK活性的測定采用放射性同位素方法。即根據(jù)AMPK使特異性肽底物SAMS（氨基酸序列為HMRSAMSGLHLVKRR）磷酸化的原理，以［γ-32P］ATP作為磷供體檢測酶的活性。按照Shin Terada［3］和Seung Hun Cha［4］提供的方法進(jìn)行。AMPK活力單位： 30℃條件下，每分鐘將1 nmol磷催化轉(zhuǎn)入SAMS的酶量即1個單位酶活。

1.4統(tǒng)計處理數(shù)據(jù)分析均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。計量資料的組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平取P<0.05，非常顯著性水平取P<0.01。AMPK活性和AMP/ATP比值的關(guān)系采用Pearson單相關(guān)分析。

2結(jié)果

お2.1不同時間運(yùn)動腓腸肌AMPK活性的變化與安靜組相比， 各組運(yùn)動后即刻顯著升高（P<0.01），其中，60、90 min組1 h仍顯著或非常顯著高于安靜水平（P<0.05，P<0.01）；與30 min相比，90 min組在運(yùn)動后即刻和1 h有顯著性差異（P<0.05）(表2)。

2.2不同時間運(yùn)動腓腸肌AMP含量的變化┯氚簿滄橄啾齲60、90 min組運(yùn)動后即刻顯著升高（P<0.05），90 min組與30和60 min組相比亦有顯著性差異（P<0.05），1 h回到安靜水平(表3)。

2.3不同時間運(yùn)動腓腸肌ATP含量的變化各組間比較均無顯著性差異(表4)。

2.4不同時間運(yùn)動腓腸肌AMP/ATP比值的變化與安靜組相比，60 min組運(yùn)動后即刻顯著升高（P<0.05）；90 min組運(yùn)動后即刻非常顯著地升高（P<0.01），且非常顯著高于30 min組（P<0.01），1 h均恢復(fù)到安靜水平(表5)。

2.5不同時間運(yùn)動后即刻AMPK活性與AMP/ATP比值相關(guān)分析┙峁見圖1。

3討論與分析

お

有關(guān)運(yùn)動時間對AMPK活性影響的研究甚少。Fugii等以45% V·O2max強(qiáng)度長時間運(yùn)動至力竭導(dǎo)致AMPKα2活性增高，但若以該強(qiáng)度運(yùn)動時間較短時則不升高［5］。Stephens TJ等發(fā)現(xiàn)，受試者以62.8%±1.3% V·O2max強(qiáng)度蹬自行車運(yùn)動時，第5 minα2活性增加2倍，到第30 min上升到3倍，同時ACCβ磷酸化分別增加18倍和36倍［6］（ACCβ常作為AMPK活性變化的間接指標(biāo)）。以上文獻(xiàn)只研究了α2亞基，迄今尚未見有關(guān)α1與運(yùn)動時間關(guān)系的報道，所以，AMPK信號與運(yùn)動時間的關(guān)系目前尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)采用總AMPK活性研究AMPK的激活與運(yùn)動時間的關(guān)系，結(jié)果表明，運(yùn)動30、60、90 min運(yùn)動均能激活腓腸肌AMPK，隨著運(yùn)動時間的延長，AMPK活性持續(xù)升高，提示AMPK的激活具有時間依賴性。最近對2型糖尿病患者的研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)40 min的中等強(qiáng)度運(yùn)動（70%V·O2max），運(yùn)動第10 min和40 min分別進(jìn)行肌肉活檢，發(fā)現(xiàn)對照組（健康消瘦者）α1活性不改變，而α2活性持續(xù)升高［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論與之相同，因?yàn)槎叩倪\(yùn)動強(qiáng)度和時間都較為相近。一般認(rèn)為，α1和α2在運(yùn)動中的激活不完全一致。由于總AMPK的活性主要取決于α2亞基（骨骼肌尤其如此），所以，α2亞基活性在不同時間中的變化特點(diǎn)應(yīng)該與總AMPK活性基本一致，我們的研究對此予以了證實(shí)，從而表明α1亞基活性對總AMPK活性而言可能并不重要。

實(shí)驗(yàn)對調(diào)控AMPK活性的主要分子機(jī)制AMP/ATP比值在不同時間中的變化同步進(jìn)行了研究。三組ATP在運(yùn)動后即刻均無顯著下降。AMP在30 min運(yùn)動無顯著增加，60和90 min運(yùn)動出現(xiàn)顯著性增加，相應(yīng)地，AMP/ATP比值在運(yùn)動后60和90 min有顯著升高。對不同時間運(yùn)動AMPK與AMPATP比值相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動后即刻呈顯著正相關(guān)（r=0.67）。以上結(jié)果表明不同時間運(yùn)動AMPK的激活主要由AMP/ATP比值升高所調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)30 min運(yùn)動AMP的增加，Matthew報道人體以60%V·O2max強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動，在第10 min骨骼肌游離AMP（AMPfree）即由安靜時的(0.32±0.12)mol/kg D.M升至(2.51±1.08)mol/kg D.M，并在隨后的時間中持續(xù)增加［8］。本研究與之出現(xiàn)差異的原因可能與測試指標(biāo)不同有關(guān)，總AMP的變化沒有AMPfree的變化敏感。

對比AMPK與AMP的增加幅度發(fā)現(xiàn)， 二者的增幅相差較大，即AMP的變化相對平緩，AMPK的變化更為急劇。分析出現(xiàn)這種差異的原因可能是：一方面，AMPK對AMP濃度的變化極為敏感，AMP濃度的較小變化都能引起AMPK的明顯變化；另一方面，AMPK活性的變化主要受AMPfree而非總AMP的影響，本實(shí)驗(yàn)測得的總AMP的變化雖然不大，但事實(shí)上，AMPfree的變化可能已經(jīng)很大，總AMP的微小變化不能完全反應(yīng)出AMPfree極大變化的真實(shí)情況，這應(yīng)該是總AMP指標(biāo)的不足之處。另外，也不能排除AMP非依賴性機(jī)制對AMPK的作用。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動后恢復(fù)期AMPK活性下降緩慢，60和90 min運(yùn)動后1 h仍高于安靜水平，6 h才恢復(fù)正常，而AMP/ATP比值下降極為迅速，1h即已完全恢復(fù)，二者的恢復(fù)時程并不一致。分析其原因可能是，一方面AMPK被激活后，其恢復(fù)速度本身慢于AMP/ATP，另一方面，AMP/ATP比值恢復(fù)后其他因素仍在維持AMPK活性，如運(yùn)動后體內(nèi)酸性產(chǎn)物清除較慢、運(yùn)動后過量氧耗等。此外，應(yīng)關(guān)注非AMP/ATP依賴性機(jī)制的作用，如Ca2+/CaMKK信號通路也可以激活A(yù)MPK［9-10］，雖然研究認(rèn)為這一機(jī)制不起主要作用［11］，但在運(yùn)動后恢復(fù)期，隨著AMP/ATP作用的消失，其作用可能反而更為突出，對此尚需進(jìn)一步研究。

運(yùn)動中AMPK的激活應(yīng)該是強(qiáng)度和時間作用效應(yīng)的綜合，在分析時不能將二者割裂開來。本實(shí)驗(yàn)采用的強(qiáng)度是中等強(qiáng)度，相當(dāng)于65%V·O2max。運(yùn)動強(qiáng)度和時間對AMPK活性的影響哪個更重要？結(jié)合前人的研究似乎可以做出某種似乎合理的推測：Stephens TJ讓受試者以62.8%±1.3% V·O2max強(qiáng)度運(yùn)動至第5 min即發(fā)現(xiàn)AMPK活性顯著升高［6］，而Fugii的受試者以45% V·O2max強(qiáng)度運(yùn)動至力竭才觀察到AMPK活性增加［5］，對比兩實(shí)驗(yàn)不難看出運(yùn)動強(qiáng)度較時間對AMPK的影響更大。本課題組在研究AMPK與運(yùn)動強(qiáng)度的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動后即刻二者的相關(guān)系數(shù)為0.89（將另文發(fā)表），高于本研究運(yùn)動時間與AMPK的相關(guān)系數(shù)0.67，似乎也印證了這一判斷。分析其原因，可能是ATP分解的速率主要受強(qiáng)度而不是時間的影響，骨骼肌ATP的變化在一定的強(qiáng)度下，隨時間的延長帶來的積累效應(yīng)可能并不顯著。當(dāng)然，鑒于強(qiáng)度和時間對AMP的影響孰大孰小尚不清楚，畢竟AMP相對ATP而言對AMPK的作用更為關(guān)鍵，所以上述推測還需實(shí)驗(yàn)支持。

本實(shí)驗(yàn)采用30、60、90 min三種運(yùn)動時間進(jìn)行研究，尚不能完整地分析不同運(yùn)動時間對骨骼肌AMPK活性變化影響的規(guī)律。首先，AMPK活性的升高并非隨著運(yùn)動的開始立即顯現(xiàn)，而要經(jīng)過一定時間，盡管此時間可能很短暫［6］。由于本實(shí)驗(yàn)30 min 即見AMPK活性顯著性升高，所以無法得知AMPK活性出現(xiàn)顯著變化的最初時間。其次，隨著時間的持續(xù)，AMPK活性是持續(xù)上升？還是升高到某一水平后穩(wěn)定不變？還是升高到一定的程度后開始下降？目前都還不清楚。Clark報道以45%V·O2max強(qiáng)度運(yùn)動至力竭時，導(dǎo)致α2活性升高［12］，而Mcconell報道長期次最大強(qiáng)度（64%V·O2max）自行車運(yùn)動削弱α1和完全抑制α2活性［13］。當(dāng)然，以上報道都還無法對上述問題給予回答，所以，今后需要進(jìn)一步展開研究。

4結(jié)論

お

骨骼肌AMPK在運(yùn)動中的激活具有時間依賴性，其機(jī)制與AMP/ATP比值升高有關(guān)。由于以65%V·O2max強(qiáng)度進(jìn)行不同時間運(yùn)動未降低骨骼肌ATP含量，所以 AMP/ATP比值的升高僅受AMP升高的影響。運(yùn)動后AMP/ATP的恢復(fù)快于AMPK的恢復(fù)。

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