王冰林 李媛媛 韓太利

（1.濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊，261061；2.濰坊學(xué)院生物工程學(xué)院）

我國蘿卜分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀與前景展望

王冰林1李媛媛2韓太利1

（1.濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊，261061；2.濰坊學(xué)院生物工程學(xué)院）

概述了分子標(biāo)記、基因克隆、基因定位、常用分子生物學(xué)技術(shù)體系優(yōu)化等在蘿卜研究中的應(yīng)用進(jìn)展，并對現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在蘿卜遺傳改良應(yīng)用中存在的主要問題和應(yīng)用前景進(jìn)行了討論。

蘿卜 分子生物學(xué) 分子標(biāo)記 基因克隆 基因定位

蘿卜起源于中國，在中國已有2 700多a的栽培歷史。我國蘿卜種質(zhì)資源豐富，收集保存的蘿卜資源達(dá)2 000余份，各生態(tài)區(qū)域均有適合本地消費(fèi)習(xí)慣和不同生長季節(jié)的傳統(tǒng)地方品種。蘿卜可菜用、生食和加工，主要食用部位為膨大的肉質(zhì)根，富含多種維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物、粗纖維、木質(zhì)素、淀粉酶及芥子油等有益成分，具有祛痰、利尿、止瀉等藥用功效，是我國人們喜愛的營養(yǎng)保健蔬菜之一，在蔬菜栽培和供應(yīng)中占有重要地位，近年消費(fèi)量呈明顯上升趨勢。長期以來，我國已在蘿卜品種選育、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)配套栽培技術(shù)、生理生化、組織培養(yǎng)、病蟲害防治等領(lǐng)域取得了顯著成績，但在現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方面則相對滯后。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在植物研究中的廣泛應(yīng)用，我國在蘿卜分子標(biāo)記技術(shù)、基因克隆、基因定位、常用分子生物學(xué)技術(shù)體系優(yōu)化等方面取得了一定進(jìn)展。

1 DNA分子標(biāo)記技術(shù)

DNA分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富、遺傳穩(wěn)定、便于操作等特點(diǎn)，并且能對各個(gè)發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、組織、器官甚至細(xì)胞進(jìn)行檢測，既不受環(huán)境影響，也不受基因表達(dá)與否的限制，所以建立在DNA基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種中。近年來，分子標(biāo)記技術(shù)研究在蘿卜種質(zhì)資源遺傳多樣性、種子純度與體細(xì)胞雜種鑒定等方面取得較大進(jìn)展。2004年，孔秋生等[1]利用12個(gè)隨機(jī)引物，對來源于不同國家和地區(qū)的有代表性的56份蘿卜種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了RAPD分析，共擴(kuò)增出109條帶，其中多態(tài)性帶72條，占62.9%。2005年，孔秋生等[2]又利用篩選出的8對引物對56份蘿卜種質(zhì)的親緣關(guān)系進(jìn)行了AFLP分析，共擴(kuò)增出327條帶，其中多態(tài)性帶 128條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率39.1%，表明栽培蘿卜種質(zhì)資源存在較豐富的遺傳多樣性，為蘿卜種質(zhì)資源的收集、保存、創(chuàng)新和有效利用提供了相關(guān)依據(jù)。分子標(biāo)記還應(yīng)用于蘿卜品種純度鑒定，2005年，任雪松等[3]利用80個(gè)隨機(jī)引物對胭脂蘿卜及雜株進(jìn)行了RAPD分析，發(fā)現(xiàn)引物S50可在胭脂蘿卜和雜株的RAPD圖譜中形成多態(tài)性差異，可將其用于胭脂蘿卜種子的純度檢測。2007年，趙麗萍等[4]應(yīng)用SRAP與AFLP兩種分子標(biāo)記方法進(jìn)行了蘿卜品種鑒定分析，供試材料均可被這兩種標(biāo)記準(zhǔn)確鑒定。另外，經(jīng)過改良的AFLP技術(shù)——甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）被用于金屬鎘脅迫處理后蘿卜基因組DNA甲基化程度的變化研究，為從DNA水平上揭示重金屬毒害機(jī)理與植物對重金屬脅迫的反應(yīng)機(jī)制提供了理論依據(jù)[5]。

2 基因克隆與異源表達(dá)

早在1992年，王燕平等[6]對心里美蘿卜抗病毒干擾素誘生劑有效成分dsRNA進(jìn)行了克隆，并應(yīng)用cDNA雜交法檢測了不同變種蘿卜dsRNA的親緣性。目前，蘿卜基因克隆及誘導(dǎo)表達(dá)研究主要體現(xiàn)在抗病相關(guān)基因上，并通過在大腸桿菌中異源表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證?？咕氖且活愋滦偷目咕镔|(zhì)，可以保護(hù)植物組織和種子不受真菌侵害。侯路珍等[7]采用RT-PCR方法，從蘿卜葉子中克隆到抗菌肽基因AFP，并在大腸桿菌中得以誘導(dǎo)表達(dá)，表明該基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中能夠正常表達(dá)。2006年，劉金亮等[8]從表現(xiàn)紅心病的濰坊蘿卜塊根上得到一蕪菁花葉病毒分離物，通過RT-PCR獲得了該分離物的外殼蛋白基因，將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET-22b（+）中，在大腸桿菌BL21中表達(dá)出分子量為38 kD的融合蛋白，Western blotting分析證明該基因在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)。近年來，還有關(guān)于蘿卜雄性不育相關(guān)基因——細(xì)胞色素P450 CYP86MF基因、花粉發(fā)育相關(guān)基因RsMF2的克隆及其結(jié)構(gòu)特征分析的報(bào)道[9～10]。

3 基因定位

蘿卜基因定位研究起步較早，但進(jìn)展較慢。早在1989年，為了確定葉綠體DNA與花粉育性有關(guān)的特異片段位置，王虹等[11]利用蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系401A及其同核保持系401B為材料研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜葉綠體DNA花粉育性相關(guān)的3個(gè)差異片段位于rRNA基因所在的葉綠體基因組反向重復(fù)區(qū)。1997年，熊玉梅等[12]對蘿卜葉綠體DNA進(jìn)行了限制性酶切分析，將Rubisco大亞基基因（rbcL）定位在E11片段上，并構(gòu)建了ctDNA EcoRⅠ基因文庫，為進(jìn)一步研究rbcL基因的表達(dá)和篩選其他目的基因奠定了基礎(chǔ)。2008年，張紹松等[13]與德國合作，將野生油蘿卜抗甜菜胞囊線蟲基因定位于d染色體上，并且發(fā)現(xiàn)油蘿卜的9條染色體附加到油菜中后，其遺傳穩(wěn)定性因附加的染色體而異，有的能穩(wěn)定遺傳，有的在自交后代中丟失1條或2條。

4 常用分子生物學(xué)技術(shù)體系優(yōu)化

PCR以及在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的RAPD、ISSR分子標(biāo)記和mRNA差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR）等是常用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在動植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、基因圖譜構(gòu)建、標(biāo)記輔助選擇和基因差異表達(dá)等領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用。近年來，這些技術(shù)在蘿卜中也逐漸得以應(yīng)用并不斷優(yōu)化。張建軍等[14]以蘿卜基因組DNA為模板進(jìn)行了RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究，將正交試驗(yàn)用于條件優(yōu)化試驗(yàn)以獲得優(yōu)良反應(yīng)體系。宋賢勇等[15]對影響PCR反應(yīng)的主要因子——模板DNA、引物、dNTPs和Mg2+濃度進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適合于蘿卜基因組DNA的RAPD和ISSR反應(yīng)體系。隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星多態(tài)性（RAMP）是一種RAPD和SSR相結(jié)合的新型分子標(biāo)記，龔義勤等[16]對蘿卜基因組RAMP分析體系中的Mg2+，dNTPs和引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化，并對7個(gè)蘿卜品種的遺傳多樣性和品種鑒定進(jìn)行了RAMP標(biāo)記分析。DDRT-PCR是一種鑒定基因差異表達(dá)的常用分析方法，2008年，賈晉等[17]以蘿卜幼嫩薹葉及花蕾為試材，探索了快速、高效的RNA提取方法；并以蘿卜花蕾為材料，對影響DDRT-PCR體系的5個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行了優(yōu)化，得到了重復(fù)性好、適用范圍較廣的mRNA差異顯示反應(yīng)體系。以上分子生物學(xué)技術(shù)體系的優(yōu)化為從分子水平上研究蘿卜種質(zhì)資源評價(jià)利用、品種鑒定、種子純度檢測、雄性不育遺傳機(jī)制與分子育種提供了重要的技術(shù)支撐。

5 其他

近年來，蘿卜分子生物學(xué)研究還體現(xiàn)在功能基因表達(dá)載體構(gòu)建、調(diào)控序列分析等方面。2004年，馬春花等[18]利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含有幾丁質(zhì)酶、1，3-葡聚糖酶和蘿卜抗真菌蛋白的三價(jià)植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌直接轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，獲得陽性重組農(nóng)桿菌工程菌株。蘿卜磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶基因（RsPHGPx）編碼一個(gè)有生理功能的過氧化物酶，為深入了解該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，2005年，楊曉東等[19]采用DNA印跡、常規(guī)PCR與染色體步行法相結(jié)合的方法闡明了RsPHGPx基因的結(jié)構(gòu)及其上游調(diào)控序列，這是首個(gè)關(guān)于植物PHGPx基因結(jié)構(gòu)和上游調(diào)控序列的系統(tǒng)報(bào)道。

6 存在的問題與研究展望

目前，我國在蘿卜分子標(biāo)記、基因克隆、基因定位等現(xiàn)代分子生物學(xué)研究領(lǐng)域已取得了一定進(jìn)展，但尚處于起步階段，許多問題還有待于進(jìn)一步研究和解決。例如，蘿卜分子標(biāo)記技術(shù)多限于種質(zhì)資源遺傳多樣性、種子純度與體細(xì)胞雜種鑒定等方面，而重要農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記輔助選擇研究尚未深入開展，某些技術(shù)體系還處于探索階段；雖然基因克隆與基因定位研究較早，但進(jìn)展緩慢，基因功能只能通過大腸桿菌異源表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，而關(guān)于蘿卜遺傳轉(zhuǎn)化體系與功能基因?qū)嵸|(zhì)性驗(yàn)證等研究還未見報(bào)道。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論與技術(shù)在不同物種、不同研究領(lǐng)域的快速發(fā)展與廣泛運(yùn)用，今后在蘿卜遺傳改良和實(shí)際應(yīng)用中可加強(qiáng)以下研究：應(yīng)用DNA分子標(biāo)記進(jìn)行重要性狀輔助選擇；高密度遺傳圖譜的構(gòu)建和重要性狀的基因定位；基因工程技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新利用；基因組研究；常規(guī)育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)有機(jī)結(jié)合促進(jìn)優(yōu)質(zhì)、抗性育種研究等。高密度遺傳圖譜構(gòu)建和重要性狀基因的精確定位，能夠促進(jìn)蘿卜分子標(biāo)記輔助選擇育種發(fā)展。利用植物基因工程技術(shù)，可以打破物種間界線，改良現(xiàn)有蘿卜品種和提供優(yōu)異變異種質(zhì)，加速優(yōu)質(zhì)、高抗蘿卜新品種選育。以上研究將提高蘿卜遺傳育種的目的性、精確性，縮短育種周期，提高育種效率。

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[16]龔義勤，李培，王明霞，等.蘿卜基因組DNA的RAMP-PCR體系優(yōu)化[J].植物研究，2006，26（1）：93-97.

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[18]馬春花，周鵬，王華.幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶與蘿卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因三價(jià)表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌工程菌株的重組[J].西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（4）：570-577.

[19]楊曉東，劉進(jìn)元.蘿卜磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶基因結(jié)構(gòu)及其調(diào)控序列分析[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2005，32（7）：649-655.

Progress and Prospect of Molecular Biology in Radish in China

WANG Binglin1,LI Yuanyuan2,HAN Taili1
(1.Weifang Academy of Agricultural Sciences,Shandong 261061; 2.College of Biological Engineering,Weifang University)

The progress of molecular marker,gene cloning,gene mapping,and the system of molecular biotechnology in radish was reviewed in this paper.Meanwhile,the major problems and outlook about the applications of molecular biotechnology to genetic improvement in radish were discussed.

Radish;Molecular biology;Molecular marker;Gene cloning;Gene mapping

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.08.001

山東省中青年科學(xué)家科研獎勵基金（2007BSA07009）

王冰林（1972-），男，博士，副研究員，副院長，主要從事蔬菜遺傳育種與生物技術(shù)研究，電話：0536-2118661，13583610349。E-mail:binglinwang@126.com

2008-11-13