林　松　江　平　喬建國

（武漢大學(xué) 中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071）お

摘 要：目的：研究他莫昔芬對人肝癌細胞Hep3B增殖、凋亡以及雌激素受體（ER）表達的影響。方法：按他莫昔芬濃度分別為7.5、15、30mol/L分為3組，對照組為空白培養(yǎng)基，每組設(shè)10個平行孔，每孔加入細胞濃度為1×105個/mL的細胞懸液0.1mL，分別培養(yǎng)24、48及72h。采用MTT法測定OD值，計算細胞增殖抑制率；用RT-PCR方法在mRNA水平檢測p21WAF1以及流式細胞術(shù)來觀察細胞凋亡情況；用免疫組化方法觀察他莫昔芬對Hep3B細胞雌激素受體表達的影響。結(jié)果：他莫昔芬抑制人肝癌細胞Hep3B增殖（P<0.05），并隨其濃度及處理時間的增加而抑制率增加；他莫昔芬提高細胞凋亡率；他莫昔芬抑制雌激素受體的表達（P<0.05），促進p21WAF的表達。結(jié)論：他莫昔芬通過影響肝癌細胞ER和p21WAF的表達抑制肝癌細胞增殖。

關(guān)鍵詞：肝癌；他莫昔芬；雌激素受體；凋亡；p21WAF

中圖分類號：R735.7文獻標識碼：A文章編號：1673-2197（2009）03-0007-03

他莫昔芬（tamoxifen，TAM）又稱為三苯氧胺，為非甾體類雌激素受體拮抗劑，此前主要應(yīng)用于成人乳腺癌的預(yù)防及治療，在肝癌的治療上有一定的療效，但存在很多爭議^[1]。本課題通過觀察人肝癌細胞Hep3B細胞在他莫昔芬作用前后增殖活性和細胞凋亡情況的變化，雌激素受體（ER）陽性表達以及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物（CKI）之一p21WAF基因水平表達的變化，來研究他莫昔芬在肝癌治療中的可行性及可能的作用機制。

1 材料及方法

1.1 材料

人肝癌細胞Hep3B由武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病毒學(xué)研究所提供；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；試驗用他莫昔芬，即用型鼠抗人ER單克隆抗體及MTT購自美國Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青公司；青霉素購自華北制藥公司；RT-PCR試驗引物由上海生工合成，SP試劑盒及聯(lián)苯二胺顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法

（1）細胞培養(yǎng)。將人肝癌細胞Hep3B細胞株常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中（加入10%胎牛血清及濃度為100U/mL的青霉素），置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中。

（2）分組。按他莫昔芬濃度為7.5、15、30μmol/L分為3組，對照組不加入他莫昔芬，每組設(shè)10個平行孔。

（3）MTT試驗。取培養(yǎng)穩(wěn)定的對數(shù)生長期Hep3B細胞，用1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度為1×105個/mL，加入96孔培養(yǎng)板，每孔加入0.1mL，置入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中24h，鏡下觀察細胞大部分貼壁后，棄去培養(yǎng)液分別加入含不同濃度他莫昔芬的培養(yǎng)液每孔各0.1mL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72h，然后每孔加入MTT10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，振蕩約15min，于492nm讀取OD值，并計算抑制率。抑制率（%）=（1-試驗孔OD值/對照孔OD值）×100%。

（4）ER免疫組化染色。將蓋玻片置入六孔板的培養(yǎng)孔，取對數(shù)生長期的細胞傳代后加入培養(yǎng)孔中，加入含不同濃度他莫昔芬的培養(yǎng)液，置入37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72h后，將蓋玻片放入4℃甲醇∶丙酮（1∶1）中約20min固定，用PBS液清洗玻片3×3min，甩干后于每張蓋玻片上滴加50μL的非免疫性動物血清封閉，置入37℃溫箱孵育30min。用SP法進行免疫組化染色，每張蓋玻片上滴加50μL即用型鼠抗人雌激素受體單克隆抗體，4℃過夜，然后每孔加入50μL生物素標記的二抗，37℃孵育1h，每孔加入50μL鏈親和素-過氧化物酶也即三抗，37℃孵育40min，每孔加入聯(lián)苯二胺100μL顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分色，梯度濃度的乙醇液脫水干燥，二甲苯透明處理，最后用中性樹膠封片。

（5）流式細胞儀檢測。使用武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院Beckmann流式細胞儀對樣品進行檢測。收集經(jīng)不同濃度他莫昔芬作用24、48、72h的細胞，常規(guī)用胰蛋白酶消化，離心收集后用預(yù)冷的濃度為70%的乙醇液固定，-20℃過夜，100μLRNA酶（100mg/L）消化，常規(guī)PI（50mg/L）染色，4℃避光30min后上機檢測，激發(fā)波長為488nm，分析結(jié)果后計算凋亡率。

（6）RT-PCR檢測P21WAF1。收集經(jīng)不同濃度他莫昔芬作用不同時間的細胞，經(jīng)異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取細胞總RNA。Oligo（dT）18為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以合成的cDNA為模板，用P21基因及β-actin內(nèi)參照進行半定量PCR擴增。實驗條件為：變性94℃ 60s，退火60℃ 60s，延伸72℃ 60s，30個循環(huán)，P21基因擴增帶為316bp，β-actin擴增帶為500bp。引物序列：P21上游引物5-CCACATGGTCTTCCTCTGCTG-3，下游引物5-GATGTCCGTCAGAACCCATG-3；β-actin上游引物5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3，下游引物5-CTCCTTAATGCACGCACGATTTC-3。

2 結(jié)果

2.1 他莫昔芬對人肝癌細胞增殖的影響

TAM對人肝癌細胞Hep3B的抑制作用隨作用時間延長而不斷增強，24、48、72h組之間相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；隨TAM濃度增加作用也增強，不同濃度TAM組肝癌細胞抑制率均較對照組高（P<0.05），30μmol/L組72h抑制率最高，如表1所示。

2.2 他莫昔芬對人肝癌細胞ER陽性表達的影響

TAM對人肝癌細胞ER陽性表達的抑制作用隨作用時間延長而不斷增強，24、48、72h組ER陽性率下降并有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；不同濃度TAM對ER陽性表達均有抑制作用，且隨濃度增加抑制作用增強，各組肝癌細胞ER陽性率均較對照組明顯降低（P<0.05），30μmol/L組72hER陽性率最低，如表2所示。

2.3 他莫昔芬對人肝癌細胞凋亡的影響

（1）流式細胞儀檢測結(jié)果。肝癌細胞的凋亡率隨TAM濃度的增加和作用時間的延長而提高。肝癌細胞生長阻滯于細胞周期的G0/G1期，S期比例減少，細胞增殖指數(shù)下降。與對照組比較各組均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），如圖1所示。

（2）RT-PCR檢測結(jié)果。P21基因mRNA的表達在TAM作用24h后與對照組比較即有增加，并隨TAM濃度的增高及作用時間的延長而表達進一步增高，30μmol/L組作用72h最為明顯，與肝癌細胞凋亡過程基本一致，如圖2所示。

3 討論

肝癌是一種雌激素依賴型腫瘤，相關(guān)研究表明，雌激素水平的上調(diào)可導(dǎo)致肝癌發(fā)病率升高^[2]。人肝細胞表達高親和性的ER，而肝癌細胞ER表達較正常肝細胞更高^[3]，雌激素通過ER介導(dǎo)的信號通路來誘導(dǎo)肝細胞基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，從而誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生^[4]。此外雌激素尚可通過激活蛋白激酶C來促進人肝癌細胞的增殖^[5]。

TAM為一種非甾體抗雌激素類藥物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素相似，故可在雌激素作用的各人體靶器官內(nèi)與雌激素競爭ER，減少胞漿內(nèi)的ER含量，阻止細胞核內(nèi)雌激素生成基因的轉(zhuǎn)錄和ER的再合成。TAM還通過作用于信號傳導(dǎo)MAPK通路，阻斷蛋白激酶C，從而激活TGF-β、p21、p27等的表達來抑制腫瘤細胞的生長^[6]，目前已廣泛應(yīng)用于臨床乳腺癌的預(yù)防及治療。

然而將TAM應(yīng)用于臨床肝癌治療目前尚存在爭議。體外實驗發(fā)現(xiàn)TAM對肝癌細胞增殖有抑制作用，呈時間-濃度依賴性^[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著TAM濃度的增加和作用時間的延長，其對肝癌細胞Hep3B增殖的抑制作用不斷增強，以濃度為30μmol/L的TAM作用72h的抑制作用最強，ER的陽性表達率最低，流式細胞儀檢測顯示細胞增殖指數(shù)最低，RT-PCR產(chǎn)物電泳顯示p21基因mRNA表達水平最高。實驗的結(jié)果說明TAM可以抑制肝癌細胞生長，它通過與雌激素競爭性結(jié)合ER，阻斷蛋白激酶C，降低端粒酶活性^[8]，上調(diào)p21、p27的表達^[9]，影響Ca2+通路^[10]等來抑制肝癌細胞的增殖及促進其凋亡。

綜上所述，相關(guān)研究證明，TAM對人肝癌細胞的增殖有抑制作用，這為TAM應(yīng)用于臨床肝癌的內(nèi)分泌治療提供了理論依據(jù)，而且因TAM價格較低，易于推廣，故顯示出了很好的應(yīng)用前景。而雌激素水平對于TAM抑制肝癌細胞增殖的影響尚待進一步研究。

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（責(zé)任編輯：陳涌濤）