Ａｎｇ－１對高糖中培養(yǎng)的ＲＦ／６Ａ的影響

左中夫　王軼晶　馮　闖　劉學(xué)政

【摘要】 目的 探討血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）對高濃度葡萄糖中培養(yǎng)的猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（RF/6A）的保護(hù)作用。方法 RF/6A分3組培養(yǎng)：對照組（DMEM培養(yǎng)基含25 mmol/L葡萄糖）、高糖組（DMEM培養(yǎng)基含40 mmol/L葡萄糖）、Ang-高糖組（DMEM培養(yǎng)基含40 mmol/L葡萄糖+0.25 mg/L Ang-1）。利用臺盼蘭染色法及MTT比色法檢測體外培養(yǎng)的各種RF/6A存活率及細(xì)胞活力，利用western-blotting法檢測各組suivivin表達(dá)。結(jié)果 1 d時各組細(xì)胞存活率及活力無差異。3、5、7 d時高糖組和Ang-高糖組細(xì)胞存活率及細(xì)胞活力均較正常組下降（P<0.05），高糖組細(xì)胞存活率及細(xì)胞活力低于Ang-高糖組（P<0.05）。5 d時，Ang-高糖組survivin表達(dá)明顯較其他兩組增多（P<0.05）。 結(jié)論 高糖能降低RF/6A的存活率和活力，而Ang-1能明顯增強(qiáng)高糖環(huán)境中RF/6A的存活率和活力,其機(jī)制可能與Ang-1上調(diào)凋亡抑制基因survivin的表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 血管生成素-1；高糖； survivin表達(dá)

Effects of angiopoietin-1 on RF/6A in high glucose environment

ZUO Zhong-fu,WANG Yi-jing,FENG Chuang,et al.Department of Pathophysiology,Liaoning Medical University,Jinzhou City,Liaoning 121001,China

【Abstract】 Objective To explore the damage of high glucose on rhesus macaque choroids-retinal endothelial cell（RF/6A）and also evaluate the protective effect and mechanisms of Angiopoietin-1(Ang-1) on RF/6A in this environment.Methods RF/6A were divided into 3 groups to be cultured:(1) control group (DMEM containing 25 mmol/L glucose); (2) high glucose group (DMEM containing 40 mmol/L glucose); (3) Ang-high glucose group (DMEM containing both 40 mmol/L glucose and 0.25 mg/L Ang-1).Each group were evaluated by measurement of MTT,trypan blue dye exclusion method at the 1 st,3rd,5th and 7th day respectively,and evaluated by western-blotting at the 5th day to determine the expression of survivin.Results At the 3rd,5th and 7th day,lower cell proliferation and livability in high glucose group and Ang-high glucose group were showed,compared with control group (P<0.05),the same tendency was observed in high glucose group compared with Ang-high glucose group (P<0.05).The western-blotting showed the expression of survivn in Ang-high glucose group was significantly higher than other two groups (P<0.05).Conclusion High glucose can decrease the proliferation and livability of RF/6A while Ang-1 limits these damages in high glucose environment may by way of up regulating the expression of survivin.

【Key words】 Angiopoietin-1; High glucose; Expression of surviving

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最為常見和最為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致患者視力下降甚至完全失明。該病發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，EC)和周細(xì)胞(pericyte)的凋亡加速在DR的發(fā)展中起到了重要作用。血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang-1）參與調(diào)節(jié)血管成熟，維持EC穩(wěn)定，是決定血管退行萎縮或者滲漏增殖的重要因素［1-4］。雖然目前對Ang-1的生理作用研究較多，但是對于Ang-1在高糖環(huán)境中對EC的影響的研究鮮有報道。本研究以RF/6A這種EC對此進(jìn)行了初步的探討，以期為Ang-1應(yīng)用于臨床治療DR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫），DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司），survivin抗體（Santa Cruz公司），臺盼藍(lán)（sigma公司），MTT（sigma公司），酶標(biāo)儀（北京普郎克公司）超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所,92-Ⅱ型),Kodak電泳圖象分析系統(tǒng)(Kodak公司，EDAS290型)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 實(shí)驗分組 將RF/6A以DMEM高糖完全培養(yǎng)基（含丙酮酸鈉，2 mmol/L L-谷胺酰胺，15%胎牛血清，100 U/ml青霉素,0.1 mg/ml 鏈霉素），于37℃，5%CO₂，飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶底的90%后，以0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，按照1∶2~1∶4進(jìn)行傳代分組培養(yǎng)：對照組（DMEM培養(yǎng)基含25 mmol/L葡萄糖）、高糖組（DMEM培養(yǎng)基含30 mmol/L葡萄糖）、Ang-高糖組（DMEM培養(yǎng)基含30 mmol/L葡萄糖+0.25 mg/L Ang-1）。

1.2.2 臺盼蘭檢測細(xì)胞存活率 調(diào)整細(xì)胞濃度,以1×10⁴/孔的密度接種于96孔板，每孔200 μl。檢測前4 h換成相應(yīng)的無血清培養(yǎng)基，每孔再加入MTT（5 mg/ml）20 μl，37℃孵育4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入150 μl二甲基亞砜，振蕩15 min使結(jié)晶物充分溶解。以空白孔調(diào)零，570 nm波長檢測，630 nm波長校正，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值（A值），按公式計算實(shí)驗組的細(xì)胞存活比例：細(xì)胞存活率=檢測組A值/對照組A值×100%。

1.2.3 MTT比色法檢測細(xì)胞活力 以1×10⁴/孔的密度，將RF/6A接種于96孔板，每孔200 μl。培養(yǎng)至1、3、5、7 d時用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，與濃度為0.4%的臺盼藍(lán)溶液按照1:1比例混勻，室溫下作用3 min后，于15 min內(nèi)于血球記數(shù)板上計數(shù)呈藍(lán)色細(xì)胞。根據(jù)下式計算細(xì)胞活力：（總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù)）/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 western-blotting檢測survivin表達(dá) 實(shí)驗組細(xì)胞培養(yǎng)5 d，去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍，加入裂解液后置于冰上15 min，以細(xì)胞刮收集細(xì)胞于EP管，超聲（200 W）3 s×2次裂解細(xì)胞。以12 000 g，4℃離心2 min。取少量上清液進(jìn)行定量，以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法，于酶標(biāo)儀490 nm下測定光密度值(OD值)，計算提取總蛋白的濃度，將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度上樣（上樣前100℃水浴3 min），以80 V電壓常規(guī)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜，用封閉液(1×TBST，5%脫脂奶粉) 4℃封閉過夜，再用抗體稀釋液(1×TBST，1%脫脂奶粉)1∶250稀釋一抗。與經(jīng)封閉液處理的PVDF膜置于小封口塑料袋內(nèi)37℃孵育2 h。1×TBST液洗膜3次，每次20 min。然后，以同樣方法，1∶4500稀釋二抗、37℃孵育1 h，1×TBST液洗膜3次，每次30 min。將膜置于含BCIP（33 μl）/NBT（66 μl）的染色液10 ml，于室溫下輕輕搖晃，使蛋白條帶逐漸顯影、定影，膠片洗滌干燥，利用Kodak電泳圖象分析系統(tǒng)對圖片各電泳條帶亮度進(jìn)行掃描，對各組電泳條帶的顯影相對強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用（x±s）表示，利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析及LSD-t檢驗，P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測細(xì)胞存活率 1 d時各組之間無差異。3、5、7 d時盡管高糖組和Ang-高糖組的細(xì)胞存活率都低于對照組（P<0.05），但高糖組的細(xì)胞存活率最低，低于Ang-高糖組的高于（P<0.01），見表1。

2.3 western-blotting檢測survivin表達(dá) 分組培養(yǎng)第5天后，western-blotting檢測survivin表達(dá)，并分析其相對顯影強(qiáng)度的結(jié)果顯示，Ang-高糖組survivin表達(dá)量明顯高于其他各組（P<0.05），見圖1，表3。

3 討論

高糖誘導(dǎo)EC功能障礙的機(jī)制尚不十分明確，主要與以下因素有關(guān)［5］：多元醇途徑的激活，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的非酶糖基化，細(xì)胞內(nèi)信號的調(diào)制，一氧化氮產(chǎn)物的改變，自由基增多，DNA功能紊亂，糖酵解增強(qiáng)，產(chǎn)生乙酰Co-A過多。這些機(jī)制可能獨(dú)立或共同參與高糖致EC凋亡的過程。本實(shí)驗對細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率檢測表明，高糖組和Ang-高糖組的細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率都低于對照組，可能與高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和功能障礙有關(guān)。

Ang-1是繼血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子后發(fā)現(xiàn)的又一重要的血管生成因子，與其受體結(jié)合后可通過跨膜的信號傳導(dǎo)路徑激活PI3K/Akt，抑制線粒體酶釋放，上調(diào)凋亡抑制基因survivin的表達(dá)［6］。survivin是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子，其抑制細(xì)胞凋亡的作用遠(yuǎn)大于Bcl-2家族成員［7］，survivin表達(dá)增高可以拮抗正常生理環(huán)境中的EC調(diào)亡，促進(jìn)EC生長［8］。本實(shí)驗中Ang-高糖組survivin表達(dá)明顯高于其他各組，這表明Ang-1也能上調(diào)高糖環(huán)境中EC survivin的表達(dá)。實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，Ang-高糖組的細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率都高于高糖組，可能是由于Ang-1上調(diào)了凋亡抑制基因survivin的表達(dá)，減少了RF/6A的凋亡所致。

參 考 文 獻(xiàn)

［1］ Suri C,Jones PF,Patan S,et al.Requisite role of angiopoietin-1,a ligand for the TIE2 receptor,during embryonic angiogenesis.Cell,1996,87(7):1171-1180.

［2］ Sato TN,Tozawa Y,Deutsch U,et al.Distinct roles of the receptor tyrosine kinases Tie-1 and Tie-2 in blood vessel formation.Nature,1995,376(6535):70-74.

［3］ Thurston G,Rudge JS,Loffe E,et al.Angiopoietin-1 protects the adult vasculature against plasma leakage.Nat Med,2000,6(4):460-463.

［4］ Thurston G,Suri C,Smith K,et al.Leakage-resistant blood vessels in mice transgenically overexpressing angiopoietin-1.Science,1999,286 (5449):2511-2514.

［5］ 王大江,方伯言,伍剛,等.高糖對牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗研究.錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2004,25(3):1-4.

［6］ Procopio WN,Paul IP,Lee WMF,et al.Angiopoietin-1 and-2 Coiled Coil domains mediate distinct homo-oligomerization patterns,but fibrinogen-like domains mediate ligand caativity.J.Bial Chem,1999,274(42):30196-30201.

［7］ Ambrosini G,Adida C，Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin expressed in cancer andlymphoma.Nat Med,1997,3(8):917-921.

［8］ Hadouche R,Hassessian HM,Guo Y,et al.Mechanisms which mediate the antiapoptotic effects of angiopoietin-1 on endothelial cells.Microvasc Res,2002,64(1):135-147.