徐德順　沈月華　程平慶

（浙江省湖州市疾病預防控制中心， 浙江 湖州313000）

摘要 [目的] 利用特異性熒光探針為特點的TaqMan熒光定量PCR技術，建立大腸桿菌O157:H7污染的快速敏感特異的檢測方法。[方法] 以大腸桿菌O157H7的rfbE基因作為靶序列，設計一對引物和探針，以大腸桿菌O157H7菌株提取核酸DNA作為模板，優(yōu)化引物和探針的濃度比和Mg2+濃度，以大腸桿菌O157:H7和10種相7關細菌考核檢測體系的靈敏性、穩(wěn)定性和特異性。[結(jié)果] 本研究建立的反應體系在引物和探針的濃度為0.6μmoL/L、0.8μmoL/L；Mg2+濃度為4 mmoL/L時，具有良好的特異性和敏感性。在10株相關菌株的檢測中，除大腸桿菌O157:H7出現(xiàn)很好的陽性外，其余菌株均為陰性。在純菌條件下，定量檢測低限17cfu/mL。穩(wěn)定性分析表明：同一樣品重復檢測3次Ct值的變異系數(shù)均小于5％。檢測樣品結(jié)果顯示Real-time PCR方法較傳統(tǒng)方法敏感、快捷、簡便。[結(jié)論] 該方法特異性強，穩(wěn)定性高，操作簡便快捷，適應食品微生物檢驗發(fā)展需要，具有較大的推廣及應用價值。

[關鍵詞] 熒光定量PCR；TaqMan探針；大腸桿菌O157:H7

Construction and primary application of a TAQMAN PCR detection method for detection of escherichia coli O157H7

DE Shun-XuYUE Hua-Shen CHENG Ping-Qing (Huzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention，Huzhou 313000, China)

Abstract[Objective] To establish a rapid sensitive and specific detection method of Escherichia coli O157:H7 with TaqMan PCR. [Methods] To design a pair of primers and probe depending on rfbE gene by way of target sequence of Escherichia coli O157:H7, and apply Escherichia coli O157:H7 of standard bacterium strain for template to appraise Escherichia coli O157:H7. The best Mg2+ concentration. primer and probe ratio were optimized. Specificity，sensitivity and stability analysis test were performed by Escherichia coli O157:H7 and 10 other associated bacteria strains. [Results] The best Mg2+ concentration was 4mmoL/L. Concentretion of primer s and probe was 0.6μmoL/L, 0.8μmoL/L.Test showed that the probe were highly conservative and specific. The results of all 10 bacteria strains were negative except of strains of Escherichia coli O157:H7.The quantitative detection Limit of the method was 17cfu/mL in pure cultured broth . Stability test show that Co-efficient Variables were all less than 5% in 4 different concentrations. The results show that real-time PCR method is more sensitive, more easier and more faster than conventional culture method for detection of Escherichia coli O157:H7.[Conclusion] Real-time PCR method has high sensitivity and specialty . The real-time PCR is a handy and rapid method. That can be used in food microorganism examination and has great value in practical work.

Key words: Real-time PCR; TaqMan-based probe; Escherichia coli O157:H7；

腸出血性大腸桿菌(Entero Hemorrhagic E，coli) O157:H7是近10年來認識的一種引起人類出血性結(jié)腸炎(Hemorrhagic colitis HC)和溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremie syndrom HUS)的腸道致病菌[1]。O157:H7 感染劑量極低，食入不足5個細菌就可引起疾病，病情發(fā)展快，死亡率高，近年在歐美、日本等國已多次爆發(fā)流行，對人類的健康構(gòu)成了重大的威脅[2]。我國1986年已發(fā)現(xiàn) O157:H7感染病人，并在安徽、江蘇等地爆發(fā)了該菌引起的食物中毒[3]。1999年和2001年先后在浙江省杭州和寧波地區(qū)從腸道門診腹瀉患者糞便中分離到O157:H7菌株。我國目前對O157:H7等病原體大多數(shù)是傳統(tǒng)的細菌學檢測，不僅耗時耗材，而且檢出率很低，要快速檢測出O157:H7 等病原體引起的爆發(fā)有不足之處[4]。 因此建立特異、靈敏及快速的O157:H7檢測方法顯得尤為重要。實時熒光PCR（Real-time PCR）是近幾年興起的分子生物學檢測技術。其檢測靈敏性高，特異性好且操作簡便，出結(jié)果快。在眾多現(xiàn)代檢測技術中脫穎而出，成為檢測領域中重要的一種快速檢測手段。我們針對大腸桿菌O157:H7的重要屬特異性基因rfbE基因設計引物和探針，優(yōu)化該菌的TaqMan PCR反應條件，建立了大腸桿菌O157:H7實時熒光PCR檢測方法，獲得了滿意的結(jié)果，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 儀器與試劑實驗所需儀器有7300型熒光定量PCR儀（美國ABI公司產(chǎn)品）、No:11175674型高速冷凍離心機[Thermo公司(上海)產(chǎn)品]、220/224型臺式高速離心機（美國Thermo公司產(chǎn)品）。實驗所需試劑有Real-time PCR反應試劑盒（大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的TaKaRa Ex Taq產(chǎn)品）、細菌培養(yǎng)用顯色培養(yǎng)基[法國科瑪嘉（鄭州博賽生物技術研究所）產(chǎn)品]、增菌培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)）。

1.1.2 菌種大腸桿菌O157:H7由浙江省疾病預防控制中心提供。鴨沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌EIEC、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、單增李斯特菌、福氏志賀氏菌等菌株由湖州是疾病預防控制中心提供。

1.2方法

1.2.1 引物與TaqMan探針設計合成從GenBank中獲取各種不同來源地大腸桿菌O157:H7的rfbE基因序列，應用Primer Express軟件分析基因序列，根據(jù)文獻[5]提供的TaqMan引物和探針設計原則，在這些序列的保守區(qū)域篩選一對引物，并在該引物的擴增區(qū)域內(nèi)設計1條熒光探針（表1）。探針5，端標記的熒光報告基團是FAM，3，端標記熒光淬滅基團是TAMRA，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 細菌培養(yǎng)及計數(shù)將低溫保存的菌種置于室溫下解凍，接種到增菌培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)復蘇，對于常溫保存的菌種，直接接種到各自的增菌肉湯種培養(yǎng)復蘇，復蘇后的菌種分別劃線到各自適宜的培養(yǎng)平板上增殖，取增菌分純后的菌種，用生理鹽水制備成菌懸液備用。菌落計數(shù)以無菌操作將充分混勻的大腸桿菌O157:H7菌株過夜培養(yǎng)液1 mL按10倍遞增稀釋至10-1～10-5濃度，并選擇10-3、10-4、10-53個稀釋度各0.2 mL 涂布于做好的培養(yǎng)皿上，同一稀釋度做3個平行，均勻鋪板后放入37℃恒溫箱中48 h后取出可計數(shù)培養(yǎng)皿計數(shù)其可見菌落數(shù)，即可推算出原液中含的細菌數(shù)。

1.2.3 膜板DNA制備采用熱煮沸法，吸取搖勻的培養(yǎng)液或生理鹽水菌懸液1000μL 于1.5 mL微量離心管中，置于恒溫金屬浴中100℃ 15 min，于4℃冰箱過夜，常溫下13000r/min離心3 min，取上清液備用。

1.2.4 熒光定量PCR擴增條件的優(yōu)化反應條件的優(yōu)化主要包括引物探針濃度比和Mg2+濃度的選擇。為防止Real-time PCR反應混合物中由于引物與探針之間的濃度不當引起非特異性競爭抑制，選擇引物與探針的最佳濃度配比，獲得反應的最低Ct值和最高熒光強度增加值（△Rn），提高反應的擴增效率與敏感度，試驗在以相同濃度陽性核酸為模板的反應體系中，選用引物和探針的濃度分別為0.2μmoL/L、 0.4μmoL/L、0.6μmoL/L、0.8μmoL/L、 1.0μmoL/L，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針最佳濃度。另外，Mg2+會直接影響Taq酶活性的關鍵因素，同時還影響模板與Real-time PCR產(chǎn)物的變性溫度、產(chǎn)物的特異性，Mg2+濃度過低，Taq酶活力降低導致PCR產(chǎn)物量少，易造成假陰性，Mg2+ 的濃度過高，會增加引物二聚體的形成。合適的Mg2+ 的濃度還能在反應中得到較低的CT值，較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。在Real-time PCR反應條件中調(diào)整Mg2+終濃度分別為2mM、2.5mM 、3mM 、3.5mM 、4mM、4.5mM、5mM，用相同濃度陽性核酸為模板進行檢測，以最低Ct值和最高熒光強度增加值（△Rn）為標準進行篩選，確定Mg2+濃度。

1.2.5 熒光定量PCR檢測體系評價以無菌操作將上述10-1～10-5稀釋度菌液分別提取核酸DNA，用本研究建立的熒光定量PCR檢測體系進行檢測，對靈敏性進行評價；選擇已知10株與O157:H7相關的腸道類細菌分別提取核酸DNA進行Real-Time PCR檢測，評價特異性；此外，對4個不同濃度O157:H7菌液作3次重復檢測，通過對實驗結(jié)果Ct值的平均值和變異系數(shù)來評價方法的穩(wěn)定性或可重復性。

1.2.6反應體系與反應參數(shù)本研究所采用的Real-Time PCR反應體系為25μL，體系組成：10xbuffer 2.5μL ,dNTP Mixture(各2.5mM) 2μl ,Ex Taq+酶（5U/μL）0.3μL ，Mg2+（25mM）4μL， 20μmoL/L 兩個引物各0.6μL，20μmoL/L探針0.8μl, 模板DNA 2μL，補DEPC水至25μL。然后用ABI7300 PCR儀按下列反應參數(shù)進行檢測：94℃ 變性2min ，以 95℃5s、60℃ 40s 擴增45個循環(huán)，在60℃進行單點熒光檢測。

2 結(jié) 果

2.1菌落計數(shù)

將1 mL按10倍遞增稀釋至10-1～10-5濃度，選擇10-3、10-4、10-5 3個稀釋度各0.2 mL均勻鋪板48h培養(yǎng)后，可清晰觀察到培養(yǎng)皿上生長的菌落。按同一稀釋度的3個重復對照的菌落數(shù)相差不大且平均菌落數(shù)在50個左右為標準，最終確定10-3鋪板的3個培養(yǎng)皿生長的平均菌落數(shù)34個來計算原菌液的細菌含量，按“平均菌落數(shù)*稀釋倍數(shù)*5”計算得原菌液的細菌濃度為17x104cfu/ mL。

2.2 熒光定量PCR擴增條件的優(yōu)化

在以相同濃度陽性核酸為模板的反應條件下，優(yōu)化的Ct值變化范圍在21.94～24.70之間。在引物濃度為0.6μmoL/L、 探針濃度為0.8μmoL/L時獲得的Ct值最低和熒光強度增加值（△Rn）最高，同時體系的穩(wěn)定性最好。在Mg2+的濃度優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)Mg2+的濃度變化對Ct值的影響不大，但當Mg2+的終濃度為4mM時，熒光強度增加值（△Rn）最高，反應的靈敏度最好（表2）。

2.3 方法的靈敏性

圖1顯示，O157:H7菌株純培養(yǎng)，TaqMan PCR法的最小檢出量為17cfu/ mL。

2.4 方法的特異性

采用以上最佳反應條件TaqMan PCR方法對O157:H7及10種相關腸道細菌進行檢測，結(jié)果表明：除O157:H7出現(xiàn)很好的陽性結(jié)果外，其他細菌檢測結(jié)果均呈陰性。表明本文建立的TaqMan PCR檢測方法對大腸桿菌O157:H7有很好的特異性，與其它相關腸道細菌無交叉反應。

2.5 方法的重復性

對4種不同濃度的O157:H7菌液重復檢測3次，得到的Ct值進行匯總（表2），4種濃度菌液檢測的結(jié)果均能判斷為陽性，并且Ct值變異系數(shù)在合理范圍內(nèi)（最大為1.90 %，均小于5%）。結(jié)果顯示，本實驗建立的O157:H7 TaqMan PCR檢測方法具有較好的穩(wěn)定性（表3）。

3 討 論

大腸桿菌O157:H7感染是一種食源性疾病，已成為世界性的公共衛(wèi)生問題，嚴重影響食品安全。發(fā)展快速、特異、敏感的檢測方法，加強對大腸桿菌O157:H7的檢測、鑒定和流行病學調(diào)查是確保飲食安全、預防大腸桿菌O157:H7感染的重要手段。傳統(tǒng)的大腸桿菌O157:H7檢測主要靠分離培養(yǎng)和直接免疫熒光等方法，由于方法學本身的原因，其特異性和敏感性均受不同程度的限制。自1995年美國PE公司提出實時PCR檢測方法后，實時PCR以其快速、定量、無需電泳、無交叉污染等突出優(yōu)點而被迅速推廣[6]。Real-Time PCR技術已應用到食品微生物檢測，使得食品中病原菌的檢測又提高了一個新的水平，無論從敏感性、特異性與速度上都具有優(yōu)勢，當然它對引物和探針也提出了更高的要求[7]，因為引物與探針直接影響方法的特異性和靈敏性。為了保證方法的特異性，我們選取了與stxl／2、eaeA、hly等其它毒力基因相比，其特異性更強的編碼大腸桿菌O157:H7菌體抗原特異合成酶，并參與O抗原脂多糖的生物合成的基因rfbE作為檢測的特異性靶基因，最終確定了一對引物及一條特異性熒光探針,同時測定方法的靈敏度和擴增效率，獲得檢測最低Ct值和最高熒光強度值(△Rn)。本研究對所建立的TaqMan PCR方法進行了引物、探針濃度和Mg2+的濃度優(yōu)化，確定了反應體系和反應參數(shù)，結(jié)果顯示當引物和探針的濃度為0.6μmoL/L，0.8μmoL/L，Mg2+濃度為4 mmoL/L時，具有良好的特異性和敏感性。為了驗證特異性，我們對大腸桿菌O157:H7菌株和金黃色葡萄球菌等10種相關腸道細菌菌株增菌分純，血清鑒定的菌種置于恒溫金屬浴中100℃ 15min，于4℃冰箱過夜，常溫下13000r/min離心3min，取上清液為模板進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它不僅特異性高，而且比傳統(tǒng)培養(yǎng)法和常規(guī)PCR更敏感、快速，也更簡便。通常大腸桿菌O157:H7傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢出限為1×104cfu/ mL,全過程至少需要4～7天。而常規(guī)PCR檢測，一次反應的敏感度在100cfu/ mL左右，從核酸DNA的提取， PCR擴增與電泳整個過程大約需5～6小時左右，而采用本方法從核酸提取至完成檢測最快能在3小時內(nèi)完成，敏感度可達10cfu/ mL，而且該方法實行完全閉管式操作，避免了常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物污染和假陽性的問題。

本實驗建立的TaqMan PCR擴增大腸桿菌O157:H7 -rfbE基因來檢測大腸桿菌O157:H7的方法不僅靈敏性高、特異性好、檢測周期短、檢測結(jié)果準確、穩(wěn)定，而且操作簡便，可應用于食品微生物的快速檢驗，而且成本低，具有較大的推廣及應用價值。

4 參考文獻

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資助項目：湖州市科技局資助項目（2007YS15）

作者簡介：徐德順（1967—），男，主管技師，學士。（收稿日期：2008-12-02）