周衛(wèi)民　李健和　彭六?！〔芸∪A　羅　霞

[摘要] 目的：建立高效液相色譜法測定注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（4∶1）含量及有關(guān)物質(zhì)。方法：色譜柱為Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流動相為甲醇-水-10%四丁基氫氧化銨溶液（600∶400∶20）（用磷酸調(diào)節(jié)，pH值為3.5）；檢測波長為230 nm；流速為0.8 ml/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20 μl。結(jié)果：6批樣品中有關(guān)物質(zhì)最大單個雜質(zhì)的平均含量為0.746%,總雜質(zhì)的平均含量為2.482%。哌拉西林和他唑巴坦檢測濃度的線性范圍分別為53.92～215.70 μg/ml（r=0.999 9）和12.72～50.86 μg/ml（r=0.999 8），平均回收率分別為99.9%(RSD=0.51%)和99.8%(RSD=0.40%)。結(jié)論：本檢測方法靈敏、快速、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（4∶1）的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] HPLC；注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（4∶1）；含量測定；有關(guān)物質(zhì)

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1674-4721（2009）05（a）-007-04

Determination of piperacillin sodium and tazobactam sodium (4∶1) for injection and its related substances by HPLC

ZHOU Weimin1, LI Jianhe2*, PENG Liubao2, CAO Junhua2, LUO Xia2

(1.Department of Pharmacy, Liangang Hospital of Loudi, Loudi 417009, China； 2.Department of Pharmacy, The Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China)

[Abstract] Objective: To establish a high performance liquid chromatagraph(HPLC) method for the determination of piperacillin sodium and tazobactam sodium (4∶1) for injection and its related substances. Methods: Thechromatographic separation was performed on a PhenomenexC18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）with mobile phases constisted of methanol-water- 10%tetrabutylammonium hydroxide solution(adjust pH to 3.5 with phosphoric acid)(600:400:20) and the flow rate at 0.8 ml/min. The detection wavelength was 230 nm. The column temperature was 25℃ and the sample size was 20 μl. Results: The average contents of the largest single impurity and the total impurities in six batches of samples was 0.746% and 2.842%, respectively. The linearity ranges of piperacillin and tazobactam were 53.92-215.70 μg/ml（r=0.999 9）and 12.72-50.86 μg/ml（r=0.999 8）, respectively. The average recovery were 99.9%(RSD=0.51%) and 99.8%(RSD=0.40%)，respectively. Conclusion: The method is sensitive, rapid,accurate,and suitable for the quality control of piperacillin sodium and tazobactam sodium (4∶1) for injection.

[Key words] HPLC;Piperacillin sodium and tazobactam sodium (4∶1) for injection;Content determination;Related substance

哌拉西林屬酰脲類青霉素，抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)，尤其對銅綠假單胞菌有強(qiáng)大抗菌作用，是目前國內(nèi)外廣泛應(yīng)用并被認(rèn)為是最有價值的一類青霉素，但其對β-內(nèi)酰胺酶不穩(wěn)定[1-2]。他唑巴坦是一個新的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，屬于青霉烷，在舒巴坦結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上增加了1個三氮唑環(huán)，是舒巴坦的衍生物，具有廣譜的抑酶活性[2-3]。哌拉西林與他唑巴坦聯(lián)合后具有良好的協(xié)同作用，可增加哌拉西林的抗菌活性，并擴(kuò)大其抗菌譜，比常用的酶抑制聯(lián)合制劑，如哌拉西林/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦及替卡西林/克拉維酸的抗菌作用強(qiáng)[4-7]。哌拉西林他唑巴坦復(fù)方制劑中，哌拉西林與他唑巴坦的配比有8∶1和4∶1兩種。配比為8∶1的復(fù)方制劑，由日本大鵬公司研究，1992年后相繼在法國、英國、西班牙、德國和美國上市，國內(nèi)于1999年批準(zhǔn)上市。配比為4∶1的復(fù)方制劑，由日本富山公司和大鵬公司共同開發(fā)，于2001年6月在日本批準(zhǔn)上市。文獻(xiàn)[8-9]報道哌拉西林/他唑巴坦的最適配比為4∶1。鑒于目前國內(nèi)未見有4∶1品種開發(fā)上市，故研究開發(fā)了療效確切、副反應(yīng)少、治療費(fèi)用相對較低、適用人群更廣（不僅適用于成人，而且適用于12歲以下兒童）、使用更為方便（有靜脈滴注和推注兩種給藥方式）的規(guī)格為2.5 g的注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（4∶1）。采用高效液相色譜法對其含量測定以及降解產(chǎn)物的檢查進(jìn)行研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下:

1儀器與試藥

1.1 儀器

日本島津LC-10A高效液相色譜儀；SPD-10A紫外檢測器；上海精密科學(xué)儀器有限公司FA1004N型電子分析天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

注射用哌拉西林鈉他唑巴坦鈉（4∶1）（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥劑科研制，批號：080105、080106、080107、080108、080109、080110）；哌拉西林對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：134215-200711，含量：90.7％）；他唑巴坦對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：129501-200712，含量：99.3％）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1有關(guān)物質(zhì)檢測

2.1.1色譜條件

2.1.1.1流動相選擇：參照文獻(xiàn)，適當(dāng)調(diào)節(jié)各組分比例，選用甲醇-水-10%四丁基氫氧化銨溶液（600:400:20）(用磷酸調(diào)pH值為3.5)為流動相。

2.1.1.2檢測波長確定：取本品適量，加流動相溶解，并稀釋制成每1毫升中約含哌拉西林10 μg的溶液，照紫外-可見分光光度法（《中國藥典》2005年版二部附錄Ⅳ A），在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描；另分別精密稱取哌拉西林和他唑巴坦對照品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1毫升中分別約含哌拉西林和他唑巴坦10 μg的溶液，同法操作。結(jié)果兩種主藥均只有紫外末端吸收?？紤]到高效液相色譜儀和紫外檢測器的靈敏度與穩(wěn)定性，參照文獻(xiàn)中檢測波長，將230 nm作為本品有關(guān)物質(zhì)檢測波長。

2.1.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取本品適量，精密稱定，加流動相溶解，并定量稀釋制成每1毫升中約含哌拉西林0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。另取流動相適量，作為空白溶液。分別取兩種溶液各20 μl注入液相色譜儀，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。結(jié)果哌拉西林主峰保留時間為9.883 min，理論板數(shù)為6 480，他唑巴坦主峰保留時間為4.263 min，理論板數(shù)為4 666。兩主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5?？瞻谉o干擾。參考文獻(xiàn)[1]，規(guī)定系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中理論板數(shù)按哌拉西林峰及他唑巴坦峰計算均應(yīng)不低于1 600。

2.1.3破壞性試驗(yàn)

精密稱取本品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1毫升中約含哌拉西林0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。①酸破壞試驗(yàn)：取供試品溶液10 ml，加濃鹽酸1滴，混勻，過濾，取續(xù)濾液作為酸破壞供試品溶液；另取濃鹽酸1滴，加10 ml流動相稀釋，作為酸破壞空白溶液。②堿破壞試驗(yàn)：取供試品溶液10 ml，加飽和氫氧化鈉溶液1滴，混勻，過濾，取續(xù)濾液作為堿破壞供試品溶液；另取飽和氫氧化鈉溶液1滴，加10 ml流動相稀釋，作為堿破壞空白溶液。③氧化破壞試驗(yàn)：取供試品溶液10 ml，加高錳酸鉀試液1滴，立即過濾，取續(xù)濾液作為氧化破壞供試品溶液；另取高錳酸鉀試液1滴，加10 ml流動相稀釋，作為氧化破壞空白溶液。④熱破壞試驗(yàn)：取供試品溶液10 ml，置沸水中加熱10 min，取出，放冷，過濾，取續(xù)濾液作為熱破壞供試品溶液。⑤光破壞試驗(yàn)：取供試品溶液5 ml，于4 500 lx照度下放置24 h，取出，過濾，取續(xù)濾液作為光破壞供試品溶液。分別取上述各種溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。本品在酸、堿、氧化劑、高溫和強(qiáng)光照射作用下均發(fā)生降解，各條件下雜質(zhì)峰與兩主成分峰均能達(dá)到良好的分離。故本色譜條件能夠滿足有關(guān)物質(zhì)考察的要求。

2.1.4 精密度試驗(yàn)

取本品適量，加流動相溶解，并定量稀釋制成每1毫升中約含哌拉西林0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。精密量取20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。如此連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果哌拉西林和他唑巴坦的峰面積分別為10 028 347和820 209，其RSD分別為0.82%和0.80%。本方法精密度良好。

2.1.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品適量，加流動相溶解，并定量稀釋制成每1毫升中約含哌拉西林0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。分別于0、1、2、4、6、8 h精密量取20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以兩成分峰面積的變化為指標(biāo)考察供試品溶液在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果見表1。供試品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 檢測限試驗(yàn)

精密稱取哌拉西林對照品11.18 mg與他唑巴坦對照品12.26 mg，置100 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度。然后從上述溶液中精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度。精密量取1ml，置10 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度。分別取20、10、5 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。當(dāng)進(jìn)樣量為10 μl時，哌拉西林峰與他唑巴坦峰信噪比均為3，哌拉西林和他唑巴坦的最小檢出量分別為1.0 ng和1.2 ng。

2.1.7 測定法

取本品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1毫升中約含哌拉西林0.4 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，用流動相定量稀釋制成每1毫升中約含哌拉西林16 μg的溶液，作為對照溶液。照上述色譜條件下的方法試驗(yàn)，取對照溶液20 μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使哌拉西林峰高為滿量程的20%～25%。再取上述兩種溶液各20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖至哌拉西林峰保留時間的2倍，供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積，其中最大單個雜質(zhì)峰的峰面積不得大于對照溶液中哌拉西林和他唑巴坦兩主成分峰面積和的一半（2.0%）；各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液中哌拉西林和他唑巴坦兩主成分峰面積的和（4.0%）。各批樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果見表2。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

同有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下。

2.2.2 線性關(guān)系試驗(yàn)

精密稱取哌拉西林對照品148.96 mg和他唑巴坦對照品32.08 mg，置50 ml量瓶中，加流動相溶解，并稀釋至刻度。分別精密量取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 ml，置50 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，取20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以哌拉西林峰面積A1為縱坐標(biāo)，哌拉西林濃度C1（μg/ml）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A1=25 663 C1+5 487.8，r=0.999 9。以他唑巴坦峰面積A2為縱坐標(biāo)，他唑巴坦?jié)舛菴2（μg/ml）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A2=8 436.1 C2-291.02，r=0.999 8。試驗(yàn)結(jié)果表明：哌拉西林溶液在53.92～215.70 μg/ml濃度范圍內(nèi)，他唑巴坦溶液在12.72～50.86 μg/ml濃度范圍內(nèi)均與相應(yīng)峰面積呈良好的線性關(guān)系。色譜圖見圖3。

2.2.3 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取本品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1毫升中約含哌拉西林和他唑巴坦分別為0.100 mg和0.025 mg的溶液，作為供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h精密量取20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果見表3。含量測定供試品溶液在8 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

精密稱取本品適量，加流動相溶解并稀釋制成每1毫升中約含哌拉西林和他唑巴坦分別為0.100 mg和0.025 mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果哌拉西林和他唑巴坦的峰面積分別為2 415 379和198 180，其RSD分別為1.29%和0.71%。本方法精密度良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取哌拉西林對照品約80、100、120 mg各3份，分別精密稱取他唑巴坦對照品約20、25、30 mg各3份，各分別置于9個100 ml量瓶中，按處方分別加入相應(yīng)量的哌拉西林鈉和他唑巴坦鈉原料藥適量，各制成模擬樣品共9份。取各份模擬樣品，分別加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加流動相溶解，并稀釋至刻度。另取哌拉西林對照品適量和他唑巴坦對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并稀釋制成約含哌拉西林和他唑巴坦分別為0.1 mg/ml和0.025 mg/ml的溶液。分別精密量取上述各種溶液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。結(jié)果見表4和表5。本方法回收率良好。