李 兵 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

曾令兵 (中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 荊州 434000)

RNA干涉技術(shù)及其在水產(chǎn)科學(xué)中的應(yīng)用

李 兵 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

曾令兵 (中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 荊州 434000)

介紹了RNA干涉的作用機(jī)制和特點(diǎn)，從抑制水生動(dòng)物病毒、研究水生動(dòng)物基因功能等方面綜述了RNA干涉技術(shù)近年在水產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

RNA干涉；基因沉默；水產(chǎn)科學(xué)；應(yīng)用

RNA干涉(RNA interference，RNAi)是指由外源或內(nèi)源性的小干涉RNA雙鏈分子(Small interferring RNA，siRNA)導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，引起同源的mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene-silencing，PTGS)[1，2]。

自從1998年Fire等提出RNA干涉以來，人們對(duì)它的機(jī)制以及功能的研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。RNA干涉技術(shù)具有高度特異性、高效性等特點(diǎn)，為人們研究未知功能的基因提供了新的遺傳學(xué)手段，還可以作為一種潛在的抵抗病毒感染的途徑。近年來科學(xué)家利用RNA干涉技術(shù)在研究水產(chǎn)病原生物控制、魚類基因結(jié)構(gòu)與功能等方面開展卓有成效的研究工作，取得了顯著進(jìn)展。

1 RNA干涉技術(shù)

1.1 RNAi的發(fā)展過程

1998年,Fire等[3]將經(jīng)純化得到的反義RNA或正義RNA注入線蟲，基因抑制效應(yīng)微弱；而將正、反義鏈構(gòu)成的雙鏈RNA注入線蟲，結(jié)果誘發(fā)了比單獨(dú)注射正義鏈或反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默。由此他們提出，小的雙鏈RNA分子能引起生物體內(nèi)同源mRNA的降解，導(dǎo)致相應(yīng)的基因表達(dá)沉默，并稱這種現(xiàn)象為RNA干涉。

Wianny[4]發(fā)現(xiàn) RNA干涉也存在于小鼠中。Clemens等[5]發(fā)現(xiàn)RNA干涉在體外培養(yǎng)的果蠅細(xì)胞系中也能實(shí)現(xiàn)。Brummelkamp等[6]利用載體表達(dá)的小發(fā)卡狀RNA(small hairpin RNA，shRNA)在培養(yǎng)的人源、猴源和鼠源等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的RNAi實(shí)驗(yàn)中取得了成功。Tuschl等[7]發(fā)現(xiàn)小的RNA干涉分子(small interferring RNA，siRNA)能在人胚胎腎293細(xì)胞和Hela細(xì)胞內(nèi)有效地抑制目的基因的表達(dá)。McCaffrey等[8]通過載體表達(dá)的shRNA在小鼠中成功抑制了HBV復(fù)制。Song等[9]針對(duì)小鼠Fas mRNA設(shè)計(jì)了siRNA，成功地保護(hù)了小鼠的肝臟。Anderson等[10]、Nishitsuji等[11]、Li等[12]、Tat等[13]分別利用RNA干涉原理有效地抑制了HIV-1的復(fù)制，為HIV-1的治療提供了可能的途徑。

1.2 RNAi的作用機(jī)制

RNAi的發(fā)生過程大致可以分為3個(gè)階段，分別是起始階段、效應(yīng)階段和擴(kuò)增階段。在起始階段，外源導(dǎo)入或病毒感染等方式引入的dsRNA被核酸內(nèi)切酶RNaseIII家族的Dicer所識(shí)別并均勻地切割成21～23 nt大小的siRNA。內(nèi)源microRNA原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-microRNA)在核酸內(nèi)切酶Drosha的作用下形成microRNA前體(pre-microRNA)，然后被Dicer識(shí)別并結(jié)合，加工成類似siRNA的成熟microRNA[14]。在效應(yīng)階段，siRNA與蛋白復(fù)合物結(jié)合后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC中的解旋酶利用ATP解開siRNA雙鏈，反義鏈與Argonaute蛋白形成活化的RISC，活化的RISC與互補(bǔ)的靶mRNA結(jié)合，在酶的催化作用下，將其切割、降解[15]。在線蟲和植物中存在這種siRNA的擴(kuò)增機(jī)制。在這個(gè)階段，siRNA與mRNA靶向性結(jié)合，并作為引物，在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)作用下再次形成dsRNA，dsRNA又被Dicer切割成siRNA，新形成的siRNA又可以進(jìn)入下一輪循環(huán)而達(dá)到擴(kuò)增目的[16]。

1.3 RNAi的特點(diǎn)

RNAi具有以下幾個(gè)主要的特點(diǎn)：(1)高度特異性。RNAi作用只降解與其序列同源的靶mRNA分子。(2)高效性。由于RNAi過程中存在信號(hào)分子擴(kuò)增機(jī)制，極少量的dsRNA就可以引起靶mRNA分子的降解[16]。(3)作用迅速。dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞后可迅速引起與其同源的mRNA的降解。(4)能抑制靜息期的病毒。RNAi的作用不依賴于病毒的復(fù)制，利用慢病毒載體表達(dá)的RNAi可以抑制處在靜息期的病毒的基因表達(dá)。(5)能同時(shí)抑制多個(gè)基因。針對(duì)一個(gè)基因家族的保守序列設(shè)計(jì)siRNA能同時(shí)抑制該基因家族里的多個(gè)基因的表達(dá)。(6)操作簡便。相對(duì)基因敲除技術(shù)而言，RNAi的操作更為簡便，更易于控制。

1.4 siRNA的制備

制備siRNA較為常用的方法有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、長片斷dsRNAs經(jīng)Rnase Ⅲ類降解體外制備siRNA法、通過siRNA表達(dá)載體或者病毒載體制備siRNA以及通過PCR法制備的siRNA表達(dá)框架等。各方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

表1 siRNA制備方法的比較Table 1 Comparison on methods of siRNA preparation

1.5 RNAi技術(shù)的應(yīng)用

RNAi具有廣泛的用途，例如用于基因功能解析、生物遺傳育種、腫瘤與傳染性疾病治療、新型藥物篩選、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑、生長與發(fā)育機(jī)理等方面的研究。外源導(dǎo)入siRNA使生物體內(nèi)同源的基因沉默而表現(xiàn)為相應(yīng)的功能缺失的表型，就可以確定該基因的功能。在基因治療研究中，選擇病原生物、腫瘤細(xì)胞或遺傳性、代謝性疾病特有的基因靶序列，設(shè)計(jì)siRNA并導(dǎo)入目標(biāo)生物體內(nèi)，從而引發(fā)RNA干涉，抑制靶基因的表達(dá)，達(dá)到基因治療的目的。Gitlin等[24]發(fā)現(xiàn)，用siRNA預(yù)處理的人或鼠細(xì)胞能夠抵抗脊髓灰質(zhì)炎病毒感染，已感染脊髓灰質(zhì)炎病毒細(xì)胞中導(dǎo)入siRNA有利于病毒的清除。RNAi可以作為尋找新的基因治療藥物靶標(biāo)的工具，高通量地對(duì)藥物靶基因作功能和效果分析。美國Genetica公司已將RNAi技術(shù)作為高通量藥物靶標(biāo)識(shí)別和確認(rèn)的工具[25]。由于RNAi能高效地阻斷目的基因的表達(dá)，因此RNAi技術(shù)可以作為研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的良好工具。Deng等[26]通過RNAi技術(shù)證實(shí)Mirk激酶在骨骼肌細(xì)胞分化過程中受Rho家族成員調(diào)控，聯(lián)合應(yīng)用傳統(tǒng)突變?nèi)笔Ъ夹g(shù)和RNAi技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)通路中不同基因的上下游關(guān)系。

2 RNAi在抑制水產(chǎn)動(dòng)物病毒復(fù)制方面的應(yīng)用

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，水產(chǎn)動(dòng)物病害愈加頻繁的發(fā)生。大規(guī)模疾病的暴發(fā)不僅造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，由此滋生的濫用藥物問題給食品安全帶來了巨大的隱患，嚴(yán)重阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。因此，有效控制水產(chǎn)動(dòng)物病害的發(fā)生成為當(dāng)務(wù)之急。但是，目前對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物疾病，尤其是病毒性疾病缺乏有效地防治方法，常規(guī)的藥物防治不能有效控制疾病的發(fā)生，而且容易引起藥物殘留等問題。而小的RNA干涉分子能特異性地抑制同源基因的表達(dá)，利用RNAi干涉技術(shù)，通過外源導(dǎo)入siRNA可以在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)有效地降解病毒的RNA，達(dá)到防治病毒性疾病的目的。

2.1 抑制真鯛虹彩病毒

真鯛虹彩病毒能感染真鯛等海水養(yǎng)殖魚類，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)真鯛虹彩病毒還沒有很好的抑制方法，因此很有必要研究一種新的途徑來抑制真鯛虹彩病毒的復(fù)制。真鯛虹彩病毒是一種雙鏈DNA病毒，病毒基因組編碼一個(gè)主衣殼蛋白(major capsid protein，MCP)基因和92個(gè)推定的開放讀碼框架。Lua等[27]針對(duì)真鯛虹彩病毒(Red seabream iridovirus，RSIV)的主衣殼蛋白基因設(shè)計(jì)siRNA(siR-MCP)，用不同濃度的siR-MCP(30、60 和120 nmol/L)和MCP表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染比目魚胚胎細(xì)胞(Hirame Natural Embryo，HINAE)2 d后，經(jīng)過RT-PCR的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，120 nmol/L的siR-MCP能有效地抑制MCP基因的瞬時(shí)表達(dá)(表達(dá)量減少了79.55%)。用120 nmol/L的siR-MCP轉(zhuǎn)染HINAE細(xì)胞6 h后，用RSIV感染HINAE細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h、84 h、96 h后，經(jīng)過RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RSIV的復(fù)制分別減少了13.04%、55.16%、97.14%。研究表明，通過siR-MCP抑制MCP基因的表達(dá)可以有效地抑制RSIV的復(fù)制。用siR-MCP轉(zhuǎn)染HINAE細(xì)胞，接毒72 h、96 h、120 h后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液的上清進(jìn)行滴度測(cè)定，發(fā)現(xiàn)病毒的數(shù)量與對(duì)照組相比有所下降，表明siR-MCP有抗病毒的特性。由此提示RNA干涉技術(shù)可為水產(chǎn)動(dòng)物病毒性疾病的防治提供了一種新的途徑。

2.2 抑制對(duì)蝦白斑綜合癥病毒

對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是一種雙鏈環(huán)狀DNA病毒，是造成世界范圍內(nèi)大面積暴發(fā)對(duì)蝦病毒性疾病的主要病原。病毒感染蝦后3～7 d內(nèi)死亡率高達(dá)100%，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。WSSV的基因組大小約為300 kb，由6個(gè)主蛋白和大約34個(gè)輔助蛋白組成。Westenberg等[28]針對(duì)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒包膜蛋白vp28和DNA綁定蛋白vp15設(shè)計(jì)了siRNA并注射到對(duì)蝦體內(nèi)，24 h后感染 WSSV病毒。發(fā)現(xiàn)siRNA能降低有效地抑制目的基因的表達(dá)，降低對(duì)蝦的死亡率。Wu等[29]針對(duì)凡納濱對(duì)蝦白斑綜合癥病毒5個(gè)基因位點(diǎn)DNA 聚合酶(dnapol)，核苷酸還原酶小亞基(rr2)，胸苷激酶-胸苷酸激酶(tk-tmk)，核衣殼蛋白vp24以及包膜蛋白vp28設(shè)計(jì)了siRNA，將siRNA和WSSV注射到凡納濱對(duì)蝦第三腹節(jié)和第四腹節(jié)之間的肌肉組織，暫養(yǎng)6 d后，成活率分別為50%、50%、66%、33% 和33%，而對(duì)照組成活率為0%。說明siRNA對(duì)白斑綜合癥病毒的復(fù)制有一定的抑制作用，展示RNA干涉技術(shù)在防治病毒性疾病、尤其是目前尚無有效對(duì)策進(jìn)行控制的病毒性疾病的廣闊應(yīng)用前景。

2.3 抑制蛙病毒

虎紋蛙虹彩病毒(Iridovirus-tiger frog virus，TFV)屬于虹彩病毒科、蛙病毒屬?；⒓y蛙虹彩病毒主要感染虎紋蛙幼體和幼蛙，導(dǎo)致其大量死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。虎紋蛙虹彩病毒免疫原性很低，疫苗接種的效果一般都不理想。RNA干涉作用具有高效降解同源mRNA的特點(diǎn)，解決了這一難題。Xie等[30]針對(duì)虎紋蛙虹彩病毒主衣殼蛋白基因設(shè)計(jì)的siRNA對(duì)病毒的復(fù)制有強(qiáng)烈的抑制作用。siRNA能導(dǎo)致TFV感染的細(xì)胞出現(xiàn)CPE的時(shí)間推遲。病毒感染后的細(xì)胞培養(yǎng)液中病毒的滴度和病毒粒子的含量均有下降。提示RNA干涉技術(shù)可以用于抑制虎紋蛙虹彩病毒的復(fù)制。他們還通過體外轉(zhuǎn)錄siRNA以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)shRNA在肥頭鯉肌肉細(xì)胞(FHM)中有效地抑制了報(bào)告基因lacZ的表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)siRNA更為有效。

2.4 抑制草魚呼腸孤病毒

草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV)主要感染當(dāng)年草魚種，在水溫25～30 ℃最為流行，死亡率高。草魚呼腸孤病毒為雙鏈RNA病毒，其基因組由11個(gè)片段組成。陳蕓[31]以草魚呼腸孤病毒外殼蛋白基因VP7為靶基因，構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染草魚腎細(xì)胞(CIK)后，用GCRV感染CIK細(xì)胞。結(jié)果顯示，shRNA表達(dá)載體在細(xì)胞水平上對(duì)GCRV具有較強(qiáng)的病毒抑制作用，抑制率達(dá)82%。他們采用顯微注射將shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入稀有鮈鯽體內(nèi)。結(jié)果表明，針對(duì)GCRV的VP7基因設(shè)計(jì)的shRNA表達(dá)載體有效地抑制了GCRV在稀有鮈鯽體內(nèi)的復(fù)制。

3 RNAi在水產(chǎn)動(dòng)物基因功能研究方面的應(yīng)用

Li等[32]發(fā)現(xiàn)特異性的siRNA能有效地抑制斑馬魚胚胎中外源的綠色熒光蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。針對(duì)Zf-T基因設(shè)計(jì)的siRNA通過顯微注射到斑馬魚胚胎中，導(dǎo)致脊索發(fā)育畸形，尾部嚴(yán)重萎縮。 針對(duì)Pax6.1基因設(shè)計(jì)的siRNA導(dǎo)致斑馬魚胚胎眼和前腦發(fā)育不良。同時(shí)注射2種siRNA導(dǎo)致胚胎缺少脊索、眼以及部分腦組織。因此可以推測(cè)Zf-T基因與脊索的發(fā)育密切相關(guān)，Pax6.1基因在眼和腦組織的發(fā)育過程中起到了重要的作用。Dodd等[17]首次研究了siRNA對(duì)斑馬魚肌營養(yǎng)不良蛋白基因(dmdgene)的作用效果，應(yīng)用化學(xué)合成的siRNA注射到斑馬魚胚胎中，成功抑制了dmd基因的表達(dá)。Liu等[18]發(fā)現(xiàn)運(yùn)用核酶消化長片段dsRNA得到的siRNA能夠引起非特異性的基因表達(dá)抑制，而運(yùn)用SP6 RNA聚合酶進(jìn)行體外合成得到的siRNA能夠特異性的沉默靶基因的表達(dá)，說明體外轉(zhuǎn)錄的siRNA可以在斑馬魚中用來特異性地下調(diào)目的基因表達(dá)。這提示RNA干涉技術(shù)在斑馬魚基因功能研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。

Boonanuntanasarn等[33]發(fā)現(xiàn)序列特異性的siRNA能有效地抑制虹鱒胚胎中綠色熒光蛋白基因的瞬時(shí)表達(dá)，有4個(gè)堿基錯(cuò)配的siRNA沒有抑制效果。這說明siRNA的抑制作用具有高度特異性。針對(duì)酪氨酸酶A基因設(shè)計(jì)的siRNA，有效地抑制了酪氨酸酶A基因的表達(dá)，而且siRNA的抑制作用具有劑量依賴性。Robalino等[34]針對(duì)凡納濱對(duì)蝦的血藍(lán)蛋白基因設(shè)計(jì)的dsRNA注射到對(duì)蝦尾部肌肉，經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，dsRNA在肝胰腺中有效地抑制了血藍(lán)蛋白mRNA的表達(dá)。說明dsRNA可以在對(duì)蝦不同的組織間進(jìn)行傳遞；對(duì)蝦體內(nèi)存在著完整的RNAi機(jī)制，因此RNA干涉技術(shù)可以用于研究對(duì)蝦的基因功能。

Jannel等[35]通過體外轉(zhuǎn)錄法合成了針對(duì)羅非魚肌生成抑制素myostatin基因設(shè)計(jì)的siRNA，通過顯微注射到斑馬魚的晶胚中。在顯微注射30 d、60 d和75 d后對(duì)所有魚體進(jìn)行稱重，每組分別取20個(gè)個(gè)體進(jìn)行肌肉的組織學(xué)分析。結(jié)果表明，注射了siRNA的斑馬魚與對(duì)照組相比，體重增長達(dá)到45%，肌纖維含量平均增長了48.7%。說明siRNA有效抑制了myostatin基因的表達(dá)，也提示RNA干涉技術(shù)可以用于培育個(gè)體大、肌纖維含量高的優(yōu)良品種。

Zenke等[36]利用紅鰭東方鲀的U6啟動(dòng)子成功的在藍(lán)色大太陽魚細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄了shRNA，并證實(shí)了在藍(lán)色大太陽魚細(xì)胞系、石鱸鰭條細(xì)胞系以及大鱗大麻哈魚胚胎細(xì)胞系中紅鰭東方鲀的U6啟動(dòng)子比鼠的U6啟動(dòng)子能更有效地表達(dá)shRNA。Voelker等[37]利用RNAi技術(shù)抑制斑馬魚胚胎細(xì)胞色素cyp1a基因和血紅素氧合酶1基因(hmox1)的表達(dá)，并將胚胎用3,4-氯苯胺(3,4-dichloroaniline)處理。結(jié)果胚胎發(fā)育紊亂的幾率有所提高；而注射cyp1a和hmox1的mRNA減少了胚胎發(fā)育紊亂發(fā)生的幾率。2種處理揭示了cyp1a和hmox1基因表達(dá)的蛋白對(duì)暴露于3,4-氯苯胺中的斑馬魚胚胎具有保護(hù)作用。進(jìn)一步展示RNA干涉技術(shù)在基因功能研究方面的應(yīng)用前景。

Su等[38]通過shRNA抑制斑馬魚綠色熒光蛋白基因和無尾基因的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于單獨(dú)使用CMV啟動(dòng)子或者U6啟動(dòng)子而言，將CMV增強(qiáng)子或者整個(gè)CMV啟動(dòng)子定位于U6啟動(dòng)子的上游可以顯著地增強(qiáng)shRNA對(duì)目的基因的抑制效果。Wang等[39]通過T7質(zhì)粒系統(tǒng)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄小發(fā)夾RNA，有效地抑制了斑馬魚胚胎中綠色熒光蛋白基因和無尾(no tail)基因的表達(dá)。提示T7質(zhì)粒系統(tǒng)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄小發(fā)夾RNA可應(yīng)用于斑馬魚胚胎的基因功能研究。Schyth等[40]針對(duì)1種魚類棒狀病毒的糖蛋白基因設(shè)計(jì)了3種不同的siRNA，經(jīng)病毒感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA，結(jié)果顯示3種siRNA均能有效地抑制病毒的增殖，而含1～4個(gè)堿基錯(cuò)配的siRNA，有2/3能對(duì)病毒起到抑制作用，說明siRNA的作用具有序列特異性。Hwang等[41]發(fā)現(xiàn)傳染性胰腺壞死癥病毒(infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)能誘導(dǎo)大麻哈魚細(xì)胞產(chǎn)生一種新型的膜聯(lián)蛋白1(annexin1)。他們針對(duì)膜聯(lián)蛋白1設(shè)計(jì)了siRNA，有效地抑制了膜聯(lián)蛋白1的mRNA的表達(dá)，經(jīng)IPNV感染的細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象顯著增加，細(xì)胞外的病毒減少至25%。揭示大麻哈魚膜聯(lián)蛋白1的抗細(xì)胞凋亡作用對(duì)IPNV在細(xì)胞中的增殖十分重要。

4 問題與展望

RNAi具有高效性、特異性等諸多特點(diǎn)，在抑制特定基因的表達(dá)方面具有很大的優(yōu)越性。RNAi技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物基因結(jié)構(gòu)與功能分析、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及病原生物抑制與疫病控制等方面。由于化學(xué)合成siRNA的成本較高，且直接應(yīng)用化學(xué)合成的siRNA其作用時(shí)效比較短，只適用于在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中用于篩選或鑒定有效siRNA結(jié)構(gòu)。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄或載體表達(dá)技術(shù)在魚類細(xì)胞或魚體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定高效表達(dá)siRNA結(jié)構(gòu)，對(duì)于RNAi技術(shù)在魚類傳染性疾病的基因治療、水產(chǎn)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因新品種培育、遺傳性狀連鎖基因定位、動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用有重要意義，是今后的研究于在水產(chǎn)科學(xué)中應(yīng)用的發(fā)展方向。相信隨著研究的不斷深入，RNAi技術(shù)一定會(huì)在水產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域得到更加廣泛的應(yīng)用和取得更大的成果。

[1]Fire A.RNA-triggered gene silencing[J].Tre in Genet，1999，15：358～363.

[2]McManus M T，Sharp P A.Gene silencing in mammals by small interfering RNAs[J].Nat Rev Genet,2002，3：737～747.

[3]Fire A，Xu S，Montgomery M K.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaeorhabditiselegans[J].Nature，1998，391：806～811.

[4]Wianny F，Zernicka-Goetz M.Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development[J].Nat cell bio，2000：70～75.

[5]Clemens J C，Worby C A，Simonson-Leff N，etal.Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissert signal transduction pathways[J].Pro Natl Acid Sci USA，2000，97：6499～6503.

[6]Brummelkamp T R，Bernards R，Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J].Science，2002，296：550～553.

[7]Tuschl T.Functional genomics：RNA sets the standard[J].Nature，2003，421：220～221.

[8]McCaffrey A P，Nakai H，Pandey K，etal.Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference[J].Nat Bio，2003，21：639～644.

[9]Song E，Lee S K，Wang J，etal.RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis[J].Nat Med，2003，9：347～351.

[10]Anderson J，Banerjea A，Akkina R.Bispecific short hairpin siRNA constructs targeted to 04CD4，CXCR4，and CCR5 confer HIV-1 resistance[J].Oligonucleotides，2003，13：303～312.

[11]Nishitsuji H，Ikead T，Miyoshi H，etal.Expression of small hairpin RNA by lentivirus-based vector confers efficient and stable gene-suppression of HIV-1 on human cells including primary non-dividing cells[J].Microbes Infect，2004，6：76～85.

[12]Li Z Y，Xiong Y，Peng Y，etal.Specific inhibition of HIV-1 replication by short hairpin RNAs targeting human cyclin T1 without inducing apoptosis[J].Febs Lett，2005，579：3100～3106.

[13]Tat S L，Li Y G，Masanori K，etal.Suppression of HIV replication using RNA interference against HIV-1 integrase[J].Febs Lett，2007，581：3253～3259.

[14]Zeng Y，Yi R，Cullen BR.Recognition and cleavage of primary microRNA precursors by the nuclear processing enzyme Drosha[J].EMBO J，2005，24：138～148.

[15]Filipowicz W.RNAi:the nuts and bolts of the RISC machine[J].Cell，2005，122：17～20.

[16]Sijen T，F(xiàn)leenor J，Simmer F，etal.On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing[J].Cell，2001，107：465～476.

[17]Dodd A，Chambers S P，Love D R.Short interfering RNA-mediated gene targeting in the zebrafish[J].Febs Lett，2004，561：89～93.

[18]Liu W Y，Wang Y，Sun Y H，etal.Efficient RNA interference in zebrafish embryos using siRNA synthesized with SP6 RNA polymerase[J].Dev Growth Differ，2005，47：323～331.

[19]Yang D，Buchholz F，Huang Z，etal.Short RNA duplexes produced by hydrolysis withEscherichiacoliRNaseⅢ mediate effective RNA interference in mammalian cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2002，99：9942～9947.

[20]Shinagawa T，Ishii S.Generation of Ski-knock down mice by expressing a long double-strand RNA from an RNA polymerase II promoter[J].Genes Dev，2003，17：1340～1345.

[21]Castanotto D，Li H，Rossi J.Functional siRNA expression from transfected PCR products[J].RNA，2002，8：l454～1460.

[22]Blesch A.Lentiviral and MLV based retroviral vectors forexvivoandinvivogene transfer[J].Methods，2004，33：164～172.

[23]Kitagawa R，Miyachi S，Hanawa H，etal.Differential characteristics of HIV-based versus SIV-based lentiviral vector systems:Gene delivery to neurons and axonal transport of expressed gene[J].Neu Res，2007，57：550～558.

[24]Gitlin L，Karelsky S，Andino R.Short interfering RNA confers intracellular antiviral immunity in human cells[J].Nature，2002，418：430～434.

[25]O’Neil N J，Martin R L，Tomlinson M L，etal.RNA-mediated interference as a tool for identifying drug targets[J].Am J Pharmacogenomics，2001，1：45～53.

[26]Deng X，Ewton D Z，Pawlikowski B，etal.Mirk/dyrk1B is a Rho-induced kinase active in skeletal muscle differentiation[J].Biol Chem，2003，278：41347～41354.

[27]Dang L T，Kondo H，Hirono I，etal.Inhibition of red seabream iridovirus (RSIV)replication by small interfering RNA(siRNA)in a cell culture system[J].Antiviral Research，2008，77：142～149.

[28]Westenberg M，Heinhuis B，Zuidema D，etal.siRNA injection induces sequence-independent protection inPenaeusmonodonagainst white spot syndrome virus[J].Virus Res，2005，114：133～139.

[29]Wu Yue，Lü Ling，Yang Li-Shi，etal.Inhibition of white spot syndrome virus inLitopenaeusvannameishrimp by sequence-specific siRNA[J].Aquaculture，2007：21～30.

[30]Xie Junfeng，Lu Ling，Min Deng，etal.Inhibition of reporter gene and Iridovirus-tiger frog virus in fish cell by RNA interference[J].Virol，2005，338：43～52.

[31]陳 蕓.用RNA干擾抗草魚出血病病毒的初步研究[D].武漢：中國科學(xué)院水生生物研究所，2005.

[32]Li Y X，F(xiàn)arrell M J，Liu R P,etal.Double-stranded RNA injection produces null phenotypes in zebrafish[J].Dev Biol，2000，217：394～405.

[33]Boonanuntanasarn S，Yoshizaki G，Takeuchi T.Specific gene silencing using small interfering RNAs in fish embryos[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，310：1089～1095.

[34]Robalino J，Bartlett T，Shepard E，etal.Double-stranded RNA induces sequence-specific antiviral silencing in addition to nonspecific immunity in a marine shrimp：convergence of RNA interference and innate immunity in the invertebrate antiviral response[J].Virol，2005，79：13561～13571.

[35]Jannel Acosta，Yamila Carpio，Ingrid Borroto，etal.Myostatin gene silenced by RNAi show a zebrafish giant phenotype[J].Journal of Biotechnology，2005，119：324～331.

[36]Zenke K，Kim K H.Novel fugu U6 promoter driven shRNA expression vector for efficient vector based RNAi in fish cell lines[J].Biochem Biophys Res Commun，2008，371：480～483.

[37]Voelker D，Stetefeld N，Schirmer K，etal.The role of cyp1a and heme oxygenase 1 gene expression for the toxicity of 3,4-dichloroaniline in zebrafish embryos[J].Aquat Toxicol，2008，86：112～120.

[38]Su J，Zhu Z，Xiong F，etal.Hybrid Cytomegalovirus-U6 Promoter-based Plasmid Vectors Improve Efficiency of RNA Interference in Zebrafish[J].Mar Biotechnol，2008，10：511～517.

[39]Wang N，Sun Y H，Liu J，etal.Knock down of gfp and no tail expression in zebrafish embryo by in vivo-transcribed short hairpin RNA with T7 plasmid system[J].Biomed Sci，2007，14：767～776.

[40]Schyth B D，Lorenzen N，Pedersen F S.Antiviral activity of small interfering RNAs：specificity testing using heterologous virus reveals interferon-related effects overlooked by conventional mismatch controls[J].Virol，2006，349：134～141.

[41]Hwang H J，Moon C H，Kim H G，etal.Identification and functional analysis of salmon annexin 1 induced by a virus infection in a fish cell line[J].Virol，2007，81：13816～13824.

Q789

A

1673-1409(2009)02-S042-06

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.013

2008-11-11

李 兵(1983-)，男，湖北麻城人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖病害研究.

曾令兵，E-mail：zenglingbing@gmail.com.