DNA-AFLP分析用辣椒基因組DNA提取方法的優(yōu)化

向 珣，宋小麗，施倩倩(浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，農(nóng)業(yè)部“園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控”重點開放實驗室，浙江杭州310029)

柴偉國 (浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024)

曹家樹 (浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，農(nóng)業(yè)部“園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控”重點開放實驗室，浙江杭州310029)

DNA-AFLP分析用辣椒基因組DNA提取方法的優(yōu)化

向 珣，宋小麗，施倩倩(浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，農(nóng)業(yè)部“園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控”重點開放實驗室，浙江杭州310029)

柴偉國 (浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024)

曹家樹 (浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，農(nóng)業(yè)部“園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控”重點開放實驗室，浙江杭州310029)

采用SDS法、CTAB-1法和CTAB-2法提取辣椒(Capsicumannuum)葉片DNA，通過紫外吸收和瓊脂糖凝膠電泳檢測，證明CTAB-2法所提取DNA的質(zhì)量和純度較高；以此DNA為模板進行DNA-AFLP分析，特征條帶清晰、基本無脫尾，適用于DNA-AFLP等分子生物學研究。

CTAB；辣椒(Capsicumannuum)；DNA；DNA-AFLP

提取DNA是分子生物學研究的基礎技術(shù)，DNA的純度及結(jié)構(gòu)的完整性是進行基因工程各項研究所必需的。AFLP標記由Vos等[1]發(fā)明，原理是利用一種稀有酶切位點酶和一種豐富酶切位點酶，同時切割基因組DNA，然后在酶切片段兩端連接上人工接頭，作為擴增反應的模板。設計的引物和接頭與酶切位點互補，并在3’端加上2 ～ 3個選擇性堿基，因此在DNA被酶切后的無數(shù)片段中，只有那些與引物3’端互補的片段才能進行擴增，稱為選擇性擴增。擴增產(chǎn)物在PAGE膠上分離后，通過銀染等檢測手段顯示出多態(tài)性豐富的指紋圖譜。該標記系統(tǒng)能通過少量的引物擴增產(chǎn)生數(shù)量豐富的帶型標記，并且分辨率高，在鑒定遺傳多樣性和物種親緣關系中具有較大的優(yōu)越性[1]。目前，栽培辣椒(Capsicumannuum)品種種質(zhì)譜系越來越集中在少數(shù)優(yōu)良種質(zhì)上，導致親緣關系越來越近，形態(tài)區(qū)分難度也越來越大，新品種的新穎性和特異性鑒定缺少依據(jù)，生產(chǎn)上品種的形態(tài)鑒定、新品種的認定或?qū)彾ê芾щy。DNA-AFLP構(gòu)建辣椒遺傳圖譜，不僅具有強有力的多態(tài)性檢測能力，而且所揭示的多態(tài)性DNA產(chǎn)物能被高效地克隆，獲得的分子標記可以用于輔助育種及基因文庫篩選等更深入的遺傳學研究。

高質(zhì)量的DNA提取，是成功構(gòu)建DNA-AFLP指紋圖譜的前提。模板的質(zhì)量將影響酶切、連接、PCR擴增反應，而假陽性或假陰性不能反映真實的多態(tài)性[4]。酚類化合物和多糖是影響植物DNA提取的2個重要因素，常導致DNA降解，影響DNA的純度、產(chǎn)量及DNA聚合酶活性[5]。辣椒葉片富含淀粉和多酚等物質(zhì)，有效去除DNA所含雜質(zhì)(多糖、酚類等)，是提取高質(zhì)量辣椒DNA的關鍵。因此，本研究在SDS和CTAB法基礎上適當加以改良，提取形態(tài)相近、親緣關系密切的12份辣椒材料DNA，進行DNA-AFLP分子標記鑒定，以便為區(qū)分它們提供分子指紋證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試辣椒品種12份，分別是‘采風1號’、‘采風3號’、‘千麗1號’、‘弄口早椒’、‘杭椒2號’、‘杭椒3號’、‘浙椒1號’、‘雞爪椒’、‘吉林甜椒’、‘9614-1-2’、‘9624-25’和‘ASC0503’，全部來源于杭州市農(nóng)業(yè)科學研究院蔬菜研究所。

1.2 方法

(1)總DNA的提取 基因組DNA提取采用SDS法和CTAB法，略加改進[6]。操作如下：從超低溫冰箱中取出材料，稱取0.5 g，加入適量的液氮，在保持葉片冷凍的條件下快速將葉片研磨成粉末；分別用3種抽提緩沖液抽提(表1)；70% ～ 80%冷乙醇洗沉淀2次，再用無水乙醇漂洗1次，冷凍真空干燥機抽干；加50 ～ 100 μL ddH2O或TE使沉淀溶解，-20 ℃保存；取5 μL DNA，以 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA質(zhì)量，同時用紫外分光光度計檢測DNA含量及質(zhì)量。

表1 抽提緩沖液體系Table 1 Extraction buffer systems

(2)DNA-AFLP分析 以CTAB-2法提取的DNA為模板，經(jīng)EcoR Ⅰ、MseⅠ雙酶切，并與MseⅠ、EcoR Ⅰ接頭連接，預擴、選擴、聚丙烯酰胺凝膠電泳。所有接頭和引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(表2)。AFLP酶切、連接、擴增參照宋小麗等[7](表3、表4)。

表2 DNA-AFLP所用接頭及引物序列Table 2 DNA-AFLP adopters and primers

表3 DNA-AFLP反應體系Table 3 DNA-AFLP reaction system

表4 DNA-AFLP擴增和電泳程序Table 4 DNA-AFLP amplification and electrophoresis procedures

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒葉片勻漿比較

將葉片加入液氮磨成干粉，加入抽提緩沖液，在65 ℃水浴45 min后比較勻漿的顏色。SDS法勻漿顏色為暗綠色，不透明；CTAB-1法葉片勻漿顏色翠綠且透明，CTAB-2法葉片勻漿顏色比CTAB-1稍暗，但是透明。勻漿綠色且透明是DNA提取質(zhì)量高的標志。CTAB法比SDS法除酚類物質(zhì)徹底，其中CTAB-1防止酚類物質(zhì)氧化的能力更強。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

A. SDS法提辣椒基因組DNA; B. CTAB-1法提辣椒基因組DNA; C. CTAB-2法提辣椒基因組DNA; a泳道：‘采風1號’DNA；b泳道：‘采風3號’DNA。圖1 辣椒基因組DNA 0.8%瓊脂糖凝電泳檢測Figure 1 Electrophoresis of pepper genomic DNA through 0.8% agarose gel

電泳檢測顯示，采用CTAB-2法提取的DNA純度較高，結(jié)構(gòu)完整、條帶清晰、整齊一致，無降解現(xiàn)象；SDS法幾乎全部降解，并存在蛋白質(zhì)污染，可能是大量的酚類物質(zhì)降解促進了DNA 的降解。CTAB-1法中，DNA條帶模糊不均一，都有不同程度的降解，且有膠狀物聚集于點樣孔，說明有多糖和蛋白質(zhì)污染(圖1)。

2.3 紫外吸收檢測

CTAB-2法提取DNA的D260/D280在1.75 ～ 1.95(表5)，說明CTAB-2法提取的DNA紫外吸收曲線具有典型的天然DNA標準吸收光譜，RNA、蛋白質(zhì)去除較好；SDS法提取的DNAD260/D280在1.0 ～ 1.3之間(未列出)，結(jié)合電泳圖可以分析出DNA降解非常嚴重；CTAB-1法的D260/D280在1.3 ～ 1.7之間，結(jié)合電泳圖可以分析出DNA降解嚴重而且含部分蛋白質(zhì)。就測量的DNA濃度而言，SDS法和CTAB-1法測得的濃度(未列出)比CTAB-2法高很多，都是1 000以上，但這是由于DNA降解的緣故，僅僅數(shù)值不能說明問題。

表5 CTAB-2提辣椒基因組DNA的濃度和質(zhì)量Table 5 Quantity and quality of pepper genomic DNA extracted by method CTAB-2

2.4 DNA-AFLP分析

對酶切、連接后的產(chǎn)物進行預擴增，凝膠電泳檢測顯示擴增產(chǎn)物穩(wěn)定，彌散范圍在100 ～ 1 000 bp之間(圖2)，表明辣椒基因組DNA酶切充分，接頭連接較好。使用5條EcoR Ⅰ引物和5條MseⅠ引物，共25對引物組合用于構(gòu)建12個辣椒品種的遺傳圖譜，大部分引物在品種間均能擴出差異條帶(圖3)。

M：100 bp標準分子量；泳道1 ～ 12為辣椒品種編號圖2 連接產(chǎn)物預擴增凝膠電泳檢測Figure 2 1% agrouse gel electrophoresis of the preamplified productions

3 討論

辣椒葉片富含的酚類物質(zhì)會導致DNA降解，與DNA 結(jié)合形成的沉淀物質(zhì)多呈黃色或黑褐色，難以溶解或溶液顏色深，很難得到高純度DNA。由于酚類化合物在植物材料中普遍存在，常出現(xiàn)獲得的DNA產(chǎn)量低、質(zhì)量差、DNA易降解等問題，難以滿足相關的分子分子生物學研究需求。已有的報道使用液氮研磨，并在提取液中加入一定量的PVP、巰基乙醇等可去除酚類物質(zhì)的試劑[8,9]。

RAPD是一種有效的分子標記技術(shù)，對DNA用量很少(5 ～ 10 ng)，質(zhì)量要求也不高，操作簡單。俞文政等[10]采用SDS法、CTAB法和高鹽低pH法對辣椒葉片DNA進行提取，結(jié)果顯示SDS法提取的DNA分子較為完整，能進行RAPD分析。Paran 等[11]發(fā)現(xiàn)在檢測辣椒多態(tài)性上，AFLP引物是RAPD有效性的4倍，具有信息量大、快速、穩(wěn)定、高效的優(yōu)勢[12]，但AFLP對DNA的要求較RAPD高，因為DNA需要經(jīng)過EcoR Ⅰ、MseⅠ雙酶切，并與MseⅠ接頭和EcoR Ⅰ接頭連接，隨后預擴、選擴，過程復雜且多，提取的DNA質(zhì)量不高會導致酶切不充分，影響以后的連接擴增反應，不利于擴增。本研究中，SDS法提取的DNA質(zhì)量不高，褐變嚴重。SDS法中DNA純化雖用氯仿/異戊醇代替酚來去處變性蛋白，克服酚殘留對酶切的影響，但SDS本身對PCR、RAPD等有較大影響。顧紅雅等[13]提出用增大離心速度或延長離心時間，也有利于雜質(zhì)的去除，克服SDS法DNA含較多糖類雜質(zhì)的缺點。

與SDS法(0.5 mol·L-1NaC1)相比，CTAB法增加高鹽溶液中鹽的濃度(提取緩沖液中NaC1的濃度提高到1.4 mol·L-1)，使DNA在高鹽緩沖條件下優(yōu)先沉淀，可有效去處多糖。CTAB-1法增加巰基乙醇的含量，同時加入PVP使其與多酚類物質(zhì)結(jié)合形成復合物。雖然CTAB-1的葉片勻漿比CTAB-2更綠，酚類物質(zhì)去除更好，但過剩的疏基乙醇導致辣椒葉片DNA得率低，有脫尾，雖能用于普通PCR擴增，但由于DNA片斷的斷裂程度較大，在DNA-AFLP分析中譜帶減少、模糊，影響分析效果。

DTT是一種還原劑，有抗氧化作用，與巰基乙醇的作用相似，但DTT的刺激性氣味要小很多，毒性也較巰基乙醇低很多。王巖等[6]利用改良的2×CTAB法(含0.2%DTT)提取辣椒基因組DNA，以此DNA為模板適合于普通PCR分析。本研究CTAB-2法在高鹽緩沖條件下，用0.2%DTT代替CTAB-1法1%PVP-360，并省略了1%的巰基乙醇，結(jié)果顯示改良的CTAB-2提取的基因組DNA產(chǎn)量高、質(zhì)量好，適用DNA-AFLP分析。在高鹽提取緩沖液中加入適量的DTT，能有效地抑制酚類物質(zhì)的氧化，同時也避免造成DNA的斷裂等一系列的問題，為利用DNA-AFLP分析辣椒植物的起源、分類、親緣關系及品種特征圖譜的建立提供了有力保障。

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Q785

A

1673-1409(2009)02-S048-04

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.014

2009-03-30

浙江省自然科學基金項目(Y3080128)；國家自然科學基金項目(30771377)

向 珣(1973-)，女，四川達州人，農(nóng)學博士，講師，從事園藝植物生長發(fā)育研究.

曹家樹，Email:jshcao@zju.edu.cn.