高俊娜,劉 萍,李 健,潘魯青,高保全,陳 萍

(1.中國水產科學院黃海水產研究所,山東青島266071;2.中國海洋大學,山東青島266003)

日本蟳線粒體16SrRNA和CO I基因序列比較分析*

高俊娜1,2,劉 萍1**,李 健1,潘魯青2,高保全1,陳 萍1

(1.中國水產科學院黃海水產研究所,山東青島266071;2.中國海洋大學,山東青島266003)

對采自萊州灣和膠州灣的日本蟳野生群體的線粒體16S rRNA和CO I基因片段進行了PCR擴增和測序,分別得到長度為519和658 bp的堿基序列。研究結果顯示這2個基因片段在種內的變異都較低,對2個基因同源序列分析表明,在線粒體16SrRNA基因片段中共檢測到7個變異位點(包括6個單一變異位點,1個簡約信息位點)和7種單倍型;在CO I基因中共檢測到8個變異位點(包括6個單一變異位點,2個簡約信息位點)和7種單倍型。通過統(tǒng)計變異位點、平均核苷酸差異數和核苷酸多樣性指數,分析比較了兩群體間的序列差異和遺傳多樣性水平,結果顯示2個日本蟳野生群體的遺傳多樣性比較豐富。用M EGA 4.0軟件構建了NJ和UPM GA系統(tǒng)樹,基于16SrRNA基因片段的系統(tǒng)樹顯示梭子蟹科的4個屬聚為兩大支:日本蟳不同的單倍型先聚在一起,然后與青蟹屬的3種蟹聚為一支;梭子蟹屬的三疣梭子蟹、遠海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚在一起;再與美青蟹屬的美洲藍蟹、巴西藍蟹等聚為一支?；贑O I基因顯示日本蟳不同的單倍型先聚在一起,再與其他3種蟳聚為一支;梭子蟹屬的遠海梭子蟹和三疣梭子蟹相聚,然后與美青蟹屬的2種蟹相聚為一支。該結果與傳統(tǒng)分類一致。這些數據為我國日本蟳的種質資源保護和利用提供了基礎的分子生物學依據。

日本蟳;16S rRNA基因;CO I基因;遺傳多樣性

日本蟳(Charybdis japonica)隸屬甲殼綱(Crustacea),梭子蟹科(Portunidae),梭子蟹亞科(Portuninae),蟳屬(Charybdis),俗稱海蟳、石蟹、靠山紅等,是一種中型海產食用蟹類,廣泛分布于我國渤海、黃海、東海、南海沿岸島礁區(qū)及淺海水域,是我國最普遍的常見蟹種類之一,在國外分布于日本、朝鮮、東南亞等地,屬廣溫廣鹽性廣布種。因其具有肉質鮮嫩,味道鮮美,營養(yǎng)豐富,生長快等特點,已逐漸成為我國重要的海水養(yǎng)殖品種之一[1-2]。

國內外對日本蟳的研究主要集中在形態(tài)、繁殖、行為、組織學、生理、生化遺傳等方面[3-11],對日本蟳線粒體DNA基因方面的研究,僅有關于12S rRNA基因[12]和16S rRNA基因[13]的報道。線粒體DNA由于具有分子量小、結構簡單、母系遺傳、進化速度快等特點,已被廣泛應用于動物群體遺傳學和系統(tǒng)進化方面的研究。本實驗擬通過對線粒體16S rRNA和CO I基因序列的擴增和測序,對采自膠州灣和萊州灣的日本蟳野生群體進行遺傳多樣性分析,以期為我國日本蟳種質資源的管理和可持續(xù)利用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用日本蟳分別于2008年采自我國膠州灣和萊州灣,均為野生群體,群體大小為60個樣本,活體帶回實驗室,-80℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 從每個群體中隨機選17～20個樣本,每個樣本取約100 g螯足肌肉,剪碎組織,加入475μL組織勻漿緩沖液(10 mmol/L Tris-HC1,p H=8.0;50 mmol/L EDTA,p H=8.0),充分混勻,依次加入終濃度為10%的SDS和20μg/mL的蛋白酶K,55℃裂解至澄清。采用苯酚-氯仿法提取。

依次加入終濃度為10%的SDS和20μg/mL的蛋白酶K,55℃裂解至澄清。采用苯酚-氯仿法提取基因組DNA。用DNA定量儀測定樣品DNA的濃度和純度,-20℃保存?zhèn)溆谩?%瓊脂糖凝膠電泳檢測,全自動凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.2 PCR擴增 16S rRNA基因片段擴增的引物[14]為:16S AR:5-CGCCTGTTTA TCAAAAACA T-3′,16S BR:5′-CCGGTCTGAACTCAGA TCACG-3′;CO I基因片段擴增的引物為:CO IL1490:5′-GGTCAACAAA TCA TAAAGA TA TTGG-3′,CO IH2198:5′-TAAACTTCA GGGTGACCAAAAAA TCA-3′。

PCR反應總體積為50μL,其中含模板DNA 50-100ng,10×PCR buffer 2.5μL,上、下游引物(濃度10μmol/L)各1.2μL,dN TPs(濃度2 mmol/L)4μL,M gCl2(濃度25 mmol/L)4μL,Taq酶1 U。在eppendorf-PCR儀上進行PCR反應:94℃預變性2 min;94℃變性45 s,48℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸5 min。

1.2.3 DNA序列測定 擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將PCR產物送往上海生物工程有限公司,純化后直接進行雙向測序。

1.2.4 序列分析 將測得的全部序列用Bioedit軟件進行編輯并輔以人工核查,用Clustal X 1.83軟件比對,并確定序列長度。用DnaSP 5.0軟件計算群體的遺傳多樣性參數。M EGA 4.0軟件計算序列的堿基組成、變異位點、簡約信息位點以及不同群體間的Kimura2-param ter遺傳距離,用鄰接法(NJ)構建系統(tǒng)樹,系統(tǒng)樹各結點的支持率以序列數據集1 000次重復抽樣檢驗的自引導值(Bootstrap value)表示。用于平均核苷酸差異比對的GenBank上11種蟹為:遠海梭子蟹(Portunus pelagicus)、塞氏梭子蟹(Portunus sayi)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、Scy lla tranquebarica、鋸緣青蟹(Scy lla serrata)、欖綠青蟹(Scy lla olivacea)、美洲藍蟹(Callinectes sapidus)、巴西藍蟹(Callinectes bellicosus)、Callinectes exasperatus、Callinectes bocourti、Callinectes arcuatus和4種蟳:鈍齒蟳(Charybdis hellerii)、銹斑蟳(Charybdis feriatus)、Charybdis vadorum和銳齒蟳(Charybdis acuta),其外緣序列登錄號及片段長度信息見表1。

表1 外源序列物種名稱,登錄號和長度Table 1 Species,accession number and length of outgroup sequences

2 結果與分析

2.1 線粒體16SrRNA基因片段序列分析

對2個群體39個樣品的線粒體16S rRNA基因片段進行PCR擴增和序列測定,得到長度為519 bp的基因片段,共出現(xiàn)7種單倍型(Hap lotype 1,2,3,4,5,6,7),已在GenBank中注冊(登陸號碼為HM 237590-HM 237596)。萊州灣群體檢測到5個單倍型(Hap lotype 1,3,4,6,7),膠州灣檢測到4個單倍型(Hap lotype 1,2,5,6),其中Hap lotype1和Hap lotype6為共享單倍型。共檢測到7個變異位點,包括6個單一變異位點,1個簡約信息位點。萊州灣群體檢測到5個多態(tài)位點:4個單一變異位點和1個簡約信息位點;膠州灣群體檢測到3個多態(tài)位點:2個單一變異位點和1個簡約信息位點。2個群體各堿基含量基本一致,A、T、G、C含量平均為34.6%、36%、17.7%、11.8%,A+T含量明顯大于G+C含量。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(見表2),萊州灣群體的各項遺傳多樣性參數略高于膠州灣,相差不大。

圖1 日本蟳不同單倍型16S rRNA序列的變異位點Fig.1 Variable sites of 16SrRNA sequence from hap lotypesof Charybd is japonica

表2 日本蟳2個野生群體16SrRNA基因片段的遺傳多樣性參數Table 2 Genetic diversity parameter of 16S rRNA gene fragments among 2 w ild populations of Charybdis japonica

表3 基于16SrRNA基因片段計算的日本蟳各單倍型及外群間的遺傳距離Table 3 Genetic distances of 16SrRNA gene fragments among Charybdis japonicas hap lo types and outgroups

用M EGA 4.0軟件,將2群體的7個單倍型分別與遠海梭子蟹等10種蟹和2種蟳的對應16S rRNA基因片段序列分別用NJ法和UPM GA法進行聚類分析,經1 000次bootsrap檢驗后獲得置信度,再用Kimura雙參法算出個體間遺傳距離(見表3)。從表中可以看出日本蟳種內的平均遺傳距離為0.004,與梭子蟹屬的3種蟹之間的遺傳距離0.122～0.141,與青蟹屬的3種蟹之間的遺傳距離0.119～0.132,與美青蟹屬之間的遺傳距離0.143～0.148,而與蟳屬其他2種之間的遺傳距離0.059和0.081,種內遺傳距離遠小于種間遺傳距離,同屬間物種的遺傳距離遠小于不同屬間物種的遺傳距離。圖2為基于16SrRNA基因片段構建的NJ和UPM GA系統(tǒng)樹,2種方法構建的系統(tǒng)樹趨勢一致,梭子蟹科的4個屬聚為兩大支:日本蟳不同的單倍型先聚在一起,再和青蟹屬的3種蟹聚為一支;梭子蟹屬的、三疣梭子蟹、遠海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚為一支;再和美青蟹屬的美洲藍蟹、巴西藍蟹等聚為一支。

圖2 基于16S rRNA基因構建的NJ系統(tǒng)樹和UPM GA系統(tǒng)樹Fig.2 NJ and UPGMA phylogenetic tree based on 16SrRNA gene sequences

2.2 線粒體CO I基因片段序列分析

對2個群體35個樣品的線粒體CO I基因片段進行PCR擴增和序列測定,得到長度為658 bp的基因片段,共出現(xiàn)7種單倍型(Hap lotype 1,2,3,4,5,6,7),已在GenBank中注冊(登陸號碼為HM 237597-HM 237603)。萊州灣群體檢測到4個單倍型(Hap lotype 1,2,5,6),膠州灣檢測到6個單倍型(Hap lotype 1,2,3,4,6,7),其中Haplotype 1和Haplotype 6為共享單倍型,共檢測到8個變異位點,包含6個單一變異位點,2個簡約信息位點,萊州灣群體檢測到3個多態(tài)位點,膠州灣群體檢測到7個多態(tài)位點。2個群體各堿基含量基本一致,A、T、G、C含量平均為26.7%、36.9%、17.8%、18.6%,A+T含量明顯高于G+C含量,符合無脊椎動物線粒體DNA序列特征。表4為日本蟳2個野生群體CO I基因片段的遺傳多樣性參數結果,可見萊州灣群體的各項遺傳多樣性參數值低于膠州灣。表5為基于CO I基于片段計算的日本蟳種內和種間遺傳距離結果,可見日本蟳種內平均遺傳距離為0.004,種間的遺傳距離在0.140～0.241之間。圖4為基于日本蟳CO I基因序列采用NJ法和UPM GA法構建分子進化樹,2種方法構建的系統(tǒng)樹趨勢一致:日本蟳不同的單倍型先聚在一起,再和其他3種蟳聚為一支;梭子蟹屬的遠海梭子蟹和三疣梭子蟹相聚,然后和美青蟹屬的2種蟹相聚為一支。

圖3 日本蟳不同單倍型COⅠ序列的變異位點Fig.3 Variable sites of COⅠsequence from hap lotypes of Charybd is japonica

表4 日本蟳2個野生群體CO I基因片段的遺傳多樣性參數Table 4 Genetic diversity parameter of COIgene fragments among 2 wild populations of Charybd is japonica

表5 基于CO I基因片段計算的日本蟳群體內和群體間遺傳距離Table 5 Intraspecefic and interspecefic genetic distances based on CO Igene

圖4 基于COI基因構建的NJ和UPM GA系統(tǒng)樹Fig.4 NJ and UPGMA phylogenetic tree based on CO Igene sequences

3 討論

線粒體DNA由于具有進化速度快、變異性大、母系遺傳、易于擴增等優(yōu)點,成為動物群體進化研究中的一種重要的分子標記[15-17]。線粒體序列分析成為DNA多態(tài)性分析技術中最有效的方法之一,因為不論是個體還是群體,任何遺傳變異或多態(tài)最終都是DNA序列的差異,DNA序列分析可以檢測到堿基替換、插入和缺少等變異信息,從而在分子水平檢測個體、群體及種間的多態(tài)及遺傳差異[18-23]。因此,研究線粒體DNA的多態(tài)性,對生物不同群體間的遺傳結構變異和遺傳多樣性的研究有著重要的意義。本文對日本蟳16S rRNA和CO I基因片段進行了PCR擴增和測序,分別得到519和658 bp的堿基序列,2個基因同源序列分析表明,A+T堿基含量明顯高于G+C,這與許多研究者在蝦類、蟹類等無脊椎動物的線粒體基因中觀察到的結果相似[24-25]。本文對日本蟳16S rRNA和CO I 2個基因片段遺傳特征的研究,顯示兩者在種內的變異都比較低。

本研究從線粒體16S rRNA和CO I基因部分序列獲得了萊州灣和膠州灣野生日本蟳的遺傳多樣性參數,由于基于16S rRNA獲得的遺傳多樣性參數較少,僅以日本囊對蝦(M arsupenaeus japonicus)和三疣梭子蟹的核苷酸多樣性指數(0.0022,0)[14,26]做對比,基于CO I基于的遺傳多樣性參數,對比中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)、保羅美對蝦(Penaeus pau lensis)、巴西美對蝦(Farf antepenaeus brasiliensis),日本囊對蝦和南方濱對蝦(Penaeus schmitti)的COⅠ基因片段核苷酸算多樣性指數(0.000 40,0.000 00,0.000 40,0.004 70)[26-28],以及野生三疣梭子蟹COⅠ基因片段核苷酸算多樣性指數(0.001 09)[14],在一定程度上說明了這2個采樣地的日本蟳的遺傳多樣性相對來說比較豐富。

通過與來自GenBank的11種蟹和4種蟳序列比較,分別采用NJ法和UPM GA法構建了分子系統(tǒng)發(fā)育樹,結果顯示,2種方法構建的系統(tǒng)樹趨勢一致:基于16SrRNA基因片段梭子蟹科的4個屬聚為兩大支:日本蟳不同的單倍型先聚在一起,再和青蟹屬的3種蟹聚為一支;梭子蟹屬的三疣梭子蟹、遠海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚在一起,再和美青蟹屬的美洲藍蟹、巴西藍蟹等聚為一支?；贑O I基因序列顯示日本蟳不同的單倍型先聚在一起,再和其他3種蟳聚為一支;而梭子蟹屬的遠海梭子蟹和三疣梭子蟹相聚,然后和美青蟹屬的2種蟹相聚為另一支。該結果與傳統(tǒng)分類一致。

本文測定的日本蟳線粒體16SrRNA和CO I基因片段序列,為更準確地探討日本蟳群體遺傳變異與分化及其與梭子蟹科其他種之間的系統(tǒng)進化關系以及為進行日本蟳種質資源保護和遺傳多樣性研究提供了新的材料。

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Compared Analysis on the Sequences of Mitochondrial 16S rRNA Gene and CO IGene Fragments of Charybdis japonica

GAO Jun-Na1,2,L IU Ping1,L IJian1,PAN Lu-Qing2,GAO Bao-Quan1,CHEN Ping1
(1.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Qingdao 266071,China;2.Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

519 base sequence of the 16S rRNA gene and 658 base sequence of the cytochrome oxidase 1 gene were amp lified and sequenced in specimens of Charybdis japonica from Laizhou Bay and Jiaozhou Bay.The analysis of the homology sequences of 16S and CO Igene indicated that little sequence variation wasobserved within species.A total of 7 or 8 nucleotide siteswere detected variable,w hich defined both 7 haplotypes in 16S and CO Igene,respectively.Variable sites,nucleotide diversity,average number of nucleotide differences and average number of nucleotide substitutions per site were calculated and compared.Rich levels of nucleotide diversities were detected in two Charybdis japonica wild populations.The molecular phylogenetic trees were constructed with NJ and UPGMA method using softw are M EGA 4.0 based on 16S rRNA and CO I gene respectively.The phylogenetic tree based on 16SrRNA gene sequences showed that Portunidae are clustered into two branches:different hap lotypes of Charybdis japonica together first,and then with the three kinds of Scylla;and three crabs of Portunus and two of Callinectes clustered into the o ther branch;While the phylogenetic tree based on CO I gene sequences show ed that different hap lotypes of Charybd is japonica together first,and then with three crabs of Charybdis;Portunus trituberculatus and Portunus pelagicus of Portunus and two of Callinectes clustered into the other branch.The results are consistent with classical taxonomy.These findings are expected to provide important information for the protection and utilization of Charybd is japonica resources of China.

Charybdis japonica;16S rRNA gene;CO Igene;genetics diversity

Q953

A

1672-5174(2010)12-057-07

國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2006AA 10A 406);國家自然科學基金項目(30871933);青島市科技計劃項目(07-2-3-5-jch)資助

2010-03-03;

2010-07-14

高俊娜(1984-),女,碩士生,主要從事海水養(yǎng)殖生物種質資源與遺傳育種研究。E-mail:happygao123@126.com

**通訊作者:Tel:0532-85823291;E-mail:liuping@ysfri.ac.cn

責任編輯 于 衛(wèi)