王 婭 鄭 毅* 沈少娟 陳金聊

微生物輔酶Q10高產菌株理性選育

王 婭1鄭 毅1*沈少娟2陳金聊2

1.福建師范大學生命科學學院 2.廈門金達威微生物研究室

輔酶Q10是一種新型的生化藥物，常作為保健品、食品以及化妝品的添加劑，在醫(yī)藥和化妝品領域具有廣泛的應用前景。近年來，Q10的研究與開發(fā)越來越受國內外學者的關注。本文概述了微生物輔酶Q10合成代謝途徑、代謝定向育種等方面的研究進展。

輔酶Q10微生物 理性育種

輔酶Q10(CoQ10)又稱為泛醌，為2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-二苯醌的側鏈帶有10個類異戊二烯的衍生物，在真核細胞內與線粒體內膜相結合，在原核細胞內則存在于細胞質膜中，是呼吸鏈的重要遞氫體[1]。它是細胞自身合成的天然抗氧化劑和細胞代謝的激活劑，具有提高機體免疫力的功能，因而是一種臨床價值很高的生化藥物。它可用于治療心臟病、胃潰瘍、病毒性肝炎；還具有抗腫瘤、治療圓形脫發(fā)和肺氣腫的功能；對艾滋病和帕金森癥有顯著的輔助治療[2]。在化妝品和保健品市場中，輔酶Q10對延緩衰老和提高機體免疫力有著不可代替的作用[3]。隨著生活水平的提高，近年來人們對它的需求量不斷攀升，從而促進了輔酶Q10產品生物加工的發(fā)展

目前，輔酶Q10的生產主要依賴于微生物發(fā)酵法，受限于發(fā)酵的效價低，造成生產成本居高不下。本文主要對目前微生物輔酶Q10的研究現狀、高產菌株的選育思路以及發(fā)酵工藝控制方面進行概述，為大規(guī)模的工業(yè)化生產提供一定依據。

1 微生物法生產輔酶Q10

輔酶Q10的生產方法一般分為直接提取法、化學合成法、微生物發(fā)酵法等。直接提取法受到原材料輔酶Q10含量的限制且受原料及季節(jié)等的限制，提取成本高，不適合于現代化工業(yè)大生產?；瘜W合成法制得輔酶Q10為順反異構體混合物，生物活性低，同時合成過程反應復雜、步驟多、且轉化效率低、往往還存在許多副產物，這些因素都嚴重影響了其產業(yè)化的發(fā)展[4]。

微生物發(fā)酵法是目前生產輔酶Q10的最主要生產方法。該生產方法由于原料廉價豐富，產物分離過程相對簡單，產物為天然品，不存在手性問題，生物活性好，易被人體吸收，且可以通過發(fā)酵罐實現規(guī)?；I(yè)化生產，因此成為最有發(fā)展?jié)摿Φ妮o酶Q10生產方法。迄今為止，國內外報道的輔酶Q10產生菌大多為細菌[5-8]，表1列出主要的產輔酶Q10微生物。通常微生物發(fā)酵產生輔酶Q10的產量在30~130mg/L，據估計要實現商業(yè)化生產輔酶Q10的產量應該高于500mg/L[9]。日本是最早開發(fā)輔酶Ｑ10的國家，但從近幾年的發(fā)展趨勢來看，中國正成為輔酶Q10原料藥的生產中心。

2 輔酶Q10高產菌株選育策略

2.1 應用代謝調節(jié)理論推理選育高產菌

在對輔酶Q10生物合成途徑及其調控機制研究基礎上，利用代謝工程的定向選育高產菌株，優(yōu)化代謝途徑，可達到提高輔酶Q10發(fā)酵水平的目標。目前主要代謝控制策略：(1)強化輔酶Q10組件的生物合成，即強化莽草酸途徑、MEP途徑與甲硫氮酸合成途徑；（2）切斷或減弱支路通量，解除其末端產物對輔酶Q10代謝流的分流與反饋抑制，例如莽草酸途徑也產生芳香族氨基酸、類胡蘿卜素等；（3）強化葡萄糖代謝流量，解除葡萄糖分解代謝阻遏，實現高濃、高效轉化。

表1 輔酶Q10主要產生菌

2.1.1選育營養(yǎng)缺陷型突變株

Olson和 Rudney[12]發(fā)現胡蘿卜素合成和輔酶Ｑ10合成具有共同的前體，胡蘿卜素分支是輔酶Ｑ10合成中的一股強大的代謝流。胡蘿卜缺陷型菌株可以切斷β-胡蘿卜素的代謝流，從而增加與輔酶Ｑ10合成的共同前體GGPP的積累與供給，提高輔酶Ｑ10的產量。Hajime Yoshida等[9]獲得綠色突變株的Ｑ10胞內含量比野生型提高3.6倍。研究表明，通過選育L-苯丙氨酸缺陷、蘇氨酸、L-酪氨酸缺陷或色氨酸缺陷等營養(yǎng)缺陷型突變株以阻斷不必要的代謝支路，增加甲硫氨酸和SAM合成途徑中各酶基因尤其是限速酶的拷貝數及表達量，可以提高SAM的產量，為合成輔酶Ｑ10提供富足的前體[14]。

2.1.2選育抗反饋調節(jié)的突變株

（1）耐前體突變株選育

在輔酶Q10生物合成的中，每合成一分子產物需要一分子對羥基苯甲酸（PHBA），一分子聚異戊二烯焦磷酸（PPP），還需要S-腺苷蛋氨酸（SAM）和O2的供給，因此要提高輔酶Q10產量必須保證前體的協(xié)同供給。L-乙基硫氨酸是L-蛋氨酸的結構類似物，因此選育抗前體L-乙基硫氨酸突變株，可以解除蛋氨酸對高絲氨酸轉乙?；傅姆答佉种坪蛯﹄琢蛎蚜呀饷负娃D甲基酶的阻礙，有利于輔酶Q10的大量積累。王普等[15]，對實驗室自行篩選的輔酶Q10產生菌株—季也蒙假絲酵母() CG108進行誘變，并結合L-乙基硫氨酸耐前體突變株的理性化篩選，獲得一株輔酶Q10高產菌株PN251。

（2）耐終產物突變株選育

選育抗類似物突變株是目前代謝控制育種的主要方向[16]。在輔酶Q10的合成途徑中，終產物可能抑制產物的大量合成。Vk3是輔酶Q10的結構類似物，因此利用類似于Vk3等輔酶Q10結構類似物來遺傳性的解除對代謝關鍵酶的抑制作用，使得在細胞中已經有大量終產物的情況下仍能不斷合成所需產物。張向陽等[17]，以根癌土壤桿菌() 突變株WSH2E01為出發(fā)菌株，通過進一步的誘變處理，獲得-乙硫氨酸和維生素K3(VK3) 雙抗性突變株WSH2V01，與出發(fā)菌株WSH AT12 相比，突變株WSH2V01 在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下輔酶Q10產量達到29. 5 mg/L 。

（3）解除葡萄糖分解阻遏突變株

當發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度提高到一定濃度時，會抑制菌體的生長與產物生成，這可能是由于某些酶的合成被容易分解利用的碳源所阻遏。因此選育解除葡萄糖分解阻遏突變株，增加葡萄糖代謝通量，從而促進了輔酶Q10的合成。

2.1.3應用細胞毒性物質篩選高產菌株

在培養(yǎng)基中添加放線菌素D、羅紅霉素等細胞毒性物質對菌體細胞產生脅迫毒害作用。由于輔酶Q10是一種能提高機體免疫力的生理活性物質，篩選抗細胞毒性物質的菌株，可以獲得高產輔酶Q10的菌株。此篩選模型大大加快了高產菌株的選育過程。潘春梅等[18]，以放射型根瘤菌()WSH2601為出發(fā)菌株，經紫外線和亞硝基胍復合誘變，獲得遺傳穩(wěn)定性好的抗放線菌素D突變株WSH-F06。

在輔酶Q10的選育過程中，僅選用單一的一種育種策略是遠遠不夠的。通常情況是基于廣譜性的選育手段（如通過紫外處理、輻射處理、細胞毒性物質等[19]），再結合針對輔酶Q10某些合成途徑設計的選育模型進行復合育種，從而獲得輔酶Q10高產菌株。

2.2 應用代謝工程理論構建輔酶Q10工程菌

利用基因工程理論改變細胞內代謝調節(jié)機制也是獲得高產菌種的一個重要策略。

2.2.1莽草酸途徑及代謝工程育種

基于對大腸桿菌代謝途徑的不斷探索和深刻認識，以及菌體自身的優(yōu)良條件，目前對其進行基因工程改造較為成功[20]。在大腸桿菌中，通過提高輔酶Q10合成途徑中基因的表達可以提高輔酶Q10前體的流通量，從而獲得大量的終產物。Barker[21]等通過選擇性地表達莽草酸途徑中的幾個酶，同時限制芳香族氨基酸的通量，使對羥基苯甲酸的產量達到了12g/L。

2.2.2聚異戊二烯焦磷酸合成（PPP）途徑及代謝工程育種

由于大腸桿菌主要是合成輔酶Q8，而通過基因工程原理改造輔酶Q10異戊二烯側鏈聚合的關鍵酶，從而使其大量合成輔酶Q10。Cheong等[22]將聚十異戊二烯焦磷酸(DPS ) 基因和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）基因一起插入載體pGPRX11中，通過質粒轉化入BNQ-pGPRX11-(KCCM-10554)中表達，得到輔酶Q10的高產菌，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化后產率達到6.69 mg/ g，工業(yè)化生產前景較好。

2.2.3甲基引入策略

大腸桿菌中，芳香環(huán)修飾的第一步是PHBA和PPP的縮合反應，催化此反應的酶是對羥基苯甲酸聚異戊二烯焦磷酸轉移酶（UbiA），此酶為膜結合蛋白，是生物輔酶Q10合成的限速步驟[12]。過量表達UbiA等相關基因可以使輔酶Q10的產量提高。

運用基因工程原理進行育種選育高產菌株可以獲得較好的效果，但是由于輔酶Q10代謝合成路徑復雜，所涉及到的基因繁多，研究工作較為緩慢，因此，還需要進一步的深入研究。

3 展望

隨著輔酶Q10的需求量不斷攀升，越來越多國內外學者加入到研究輔酶Q10的行列。國外學者在利用基因工程改造菌種方面以及發(fā)酵過程中的條件控制方面做了許多研究。國內的研究主要側重于利用傳統(tǒng)的誘變育種進行菌種選育以及配方優(yōu)化方面，盡管獲得了一系列產量提高的突變株，但總體產量水平還達不到工業(yè)化生產的水平。隨著輔酶Q10生物合成途徑及調控機制的深入研究，應用代謝工程的方法選育高產菌株，構建工程菌株，改造原菌株，從而進一步化化生產工藝。同時，輔酶Q10發(fā)酵過程中的工藝參數控制相對復雜，如何簡化發(fā)酵工藝控制的中間環(huán)節(jié)，建立自動化控制模式也是十分重要的。

[1] 張繼中,遲莉麗,沈亞領. 輔酶Q10的生產及在醫(yī)學領域中的應用[J].上海應用技術學院學報,2004,12,4(4):301-305.

[2] 楊學義,宿燕崗.輔酶Q10的藥理和臨床應用[J].中國藥理學通報,1994,10(2):88-91.

[3] 胡淼琳.Coenzyme Q10的生化營養(yǎng)性質以及它的醫(yī)療功效[J].自由基生物學與醫(yī)學,1994,2(1):46-53.

[4] 王宗德,曾衛(wèi)明.輔酶Q10提取分離和測定的研究現狀[J].江西林業(yè)科技,1999,27(4):21-24.

[5] Suk-Jin Ha.etal. Optimization of culture conditions and scale-up to Pilot and plant scales for coenzymeQ(10) production by Agrobacterium tumefaciens. Appl.Microbiol.Biotechnol. (2007)74:974-980.

[6] Suk-Jin Ha,Sang-Yong Kim , Jin-Ho Seo.et al. Optimization of culture conditions and scale-up to pilot and plantscales for coenzymeQ10production by Agrobacterium tumefaciens. Appl Microbiol Biotechnol, 2007(74):974-980.

[7] 鄭君,管斌,孔青.高產輔酶Q10光合細菌的選育[J].中國釀造,2008,9(186):83-86.

[8] Newman,J.D. etal. High-level production of amorpha-4,11-diene in a two-phase partitioning bioreactor of metabolically engineered Escherichia coli. Biotechnol.Bioeng. 95:684-691.

[9] Hajime Yoshida, et al. Production of ubiquinone-10 using bacteria. J. Gen. Appl. Microbiol., 1998, 44:19-26 .

[10] Choi, G-S. et al.Restricted electron flux increases coenzyme Q10 production in Agrobacterium tumefaciens ATCC4452. Process Biochem,2005,40:3225-3229.

[11] Meganathan R．Ubiquinone biosynthesis in microorganisms． FEMS Microbiology Letters，2001，203：l31-139．

[12] Olson E O and Rudney H. Biosynthesis of ubiquinone[J ]. Vitam. Hom,1983,40:1-43.

鄭毅。