王 瑤, 富徐燕， 王 霞， 白 巖，楊賽賽， 潘蘭英， 田 薇

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 臨安 311300；2.山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250000)

我國是生產(chǎn)和使用化學(xué)農(nóng)藥的大國,長期使用農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境及人體健康的危害和影響已經(jīng)引起人們的高度關(guān)注.多菌靈(carbendazol，N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯)，又叫苯并咪唑 44 號、棉萎靈等，是一種廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，能防治水稻、棉花、蔬菜、果樹等多種作物的多種病害，尤其對子囊菌和半知菌引起的病害有較好的防治效果[1]，但它的殘效期比較長，對哺乳動(dòng)物有一定的毒性[2].因此,農(nóng)產(chǎn)品中多菌靈殘留量的測定越來越受到重視.近年來,有關(guān)多菌靈在多種作物上的殘留分析方法有許多報(bào)道，如熒光分析法[3]、紅外光譜法[4]、氣相色譜法[5]、薄層掃描法[6]及紫外光譜法[7]等,其中:薄層掃描法靈敏度較低、氣相色譜法需要對樣品進(jìn)行衍生化處理.因此，目前多菌靈的殘留分析一般采用液相色譜法[8-11]，如Amadeo等用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法[12]測定水果蔬菜中多菌靈的殘留;Rodney[13]等用液相色譜法測定藍(lán)莓中多菌靈的殘留.有關(guān)多菌靈在白術(shù)果實(shí)上的殘留研究尚未見報(bào)道.本文建立了用高效液相色譜法測定白術(shù)中多菌靈農(nóng)藥殘留量的方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2487型高效液相色譜儀;Waters 515 HPLC Pump;MILLIPORE超純水器;DZG-6050型真空干燥箱;KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器.

石油醚、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺均為分析醇;甲醇為色譜醇.多菌靈對照品(純度≥99%)由農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所研制.

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確量取0.90 mL 100 μg/mL的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于10 mL容量瓶中，以N,N-二甲基甲酰胺溶解并定容至刻度，搖勻后即為標(biāo)準(zhǔn)溶液.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理

作物白術(shù)(Atractylodesmacrocephala)采自浙江農(nóng)林大學(xué)百草園白術(shù)基地.農(nóng)藥為50%的多菌靈可濕性粉劑.原藥劑用水稀釋500倍，于6月5日進(jìn)行噴灑施藥.噴藥后按一定時(shí)間間隔隨機(jī)采樣，采樣后立即干燥，貯藏于陰涼處備用.

精確稱取制備好的白術(shù)樣品2.000 g于三角瓶中，加入20 mL甲醇和5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液，超聲提取1 h，抽濾，再用15 mL甲醇洗殘?jiān)?，合并濾液于平底燒瓶中，在40 ℃水浴減壓濃縮至15～20 mL.將濃縮后的提取液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液和50 mL 0.1 g/L NaCl溶液后，再加入25 mL石油醚劇烈振蕩1 min，靜置分層后棄去石油醚層.下層水相用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5，再用二氯甲烷萃取3次，每次15 mL，合并二氯甲烷萃取液于平底燒瓶中,經(jīng)無水Na2SO4干燥，減壓濃縮至近干，再用氮?dú)獯蹈?，以N,N-二甲基甲酰胺定容至2 mL,即得樣品溶液.

1.2.2 色譜條件

色譜柱：4.6 mm×150 mm，TRACE EXCEL ODS不銹鋼柱，粒徑5 μm.流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)=35∶65,流速1.0 mL/min.檢測波長：281 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取凈化

多菌靈不溶于水，微溶于常用的有機(jī)溶劑.因此,常規(guī)方法用有機(jī)溶劑很難將多菌靈從白術(shù)樣品中提取出來.本實(shí)驗(yàn)利用多菌靈在酸性條件下成鹽而易溶于水的特性，使用甲醇和0.1 mol/L鹽酸溶液，在超聲提取器上超聲1 h，提取白術(shù)中殘留的多菌靈，凈化后直接用液相色譜儀檢測.

2.2 流動(dòng)相選擇

分別吸取對照品和樣品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件檢測，以樣品溶液中多菌靈的分離度作為指標(biāo)，對所得譜圖進(jìn)行分析，進(jìn)而確定合適的流動(dòng)相.

流動(dòng)相AV(甲醇)∶V(水)=45∶55，所得多菌靈色譜圖見圖1.結(jié)果顯示目標(biāo)峰基部未完全分離，即峰分離度不夠.

流動(dòng)相BV(甲醇)∶V(水)=35∶65,所得色譜圖見圖2.圖2顯示多菌靈的峰形及分離度良好.

因此,本實(shí)驗(yàn)選用V(甲醇)∶V(水)=35∶65的流動(dòng)相系統(tǒng).

2.3 精密度和重復(fù)性測定

精密度實(shí)驗(yàn) 分別取對照品溶液(9 μg/mL)20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定每次進(jìn)樣后多菌靈的峰面積值,其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.203%，表明儀器的精密度良好.

圖1 流動(dòng)相A條件下所得多菌靈色譜圖

圖2 流動(dòng)相B條件下所得多菌靈色譜圖

重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一個(gè)樣品5份,按供試品制備方法制備后，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定每次進(jìn)樣后多菌靈的峰面積值.結(jié)果顯示：其RSD為3.18%，表明重現(xiàn)性良好.

2.4 線性關(guān)系和檢出限測定

在上述色譜條件下，測定了HPLC/UV對多菌靈響應(yīng)的線性關(guān)系.檢測線性范圍為0.45～108 ng，其線性回歸方程式為

Y=8 886.7X-8 875.2,R=0.999 7.

表明對照品溶液在0～5.4 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2.5 穩(wěn)定性檢測

取新鮮配制的樣品溶液，分別在0，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣20 μL,測定峰面積，其RSD為3.97%，表明穩(wěn)定性良好.

2.6 樣品分析及回收率檢測

在上述色譜條件下,準(zhǔn)確吸取已制備好的樣品溶液20 μL，注入高相液相色譜儀中，用外標(biāo)法定量，根據(jù)公式計(jì)算殘留量,結(jié)果見表1.

表1 多菌靈在白術(shù)中的含量隨時(shí)間呈遞減關(guān)系

回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品2 g，加入一定量的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法對樣品進(jìn)行提取、凈化和色譜測定后，計(jì)算添加回收率,結(jié)果見表2.多菌靈在樣品中的添加回收率在94.57%～103.33%，RSD為3.75%.

3 結(jié) 論

1)本文采用反相高效液相色譜法分析白術(shù)中的多菌靈殘留，利用高效液相色譜儀的洗脫功能，使殘留的多菌靈在7.5 min時(shí)流出，而其他基質(zhì)共提物則在其前流出，對多菌靈不產(chǎn)生干擾，從而使得定性定量結(jié)果更趨準(zhǔn)確和真實(shí).檢測線性范圍為0.45～108 ng，加樣回收率在94.57%～103.33%，最低檢出量3.6×10-10g，最低檢測質(zhì)量濃度為0.022 5 μg/mL.方法定量準(zhǔn)確、快捷，操作簡便，靈敏度高，滿足農(nóng)藥殘留分析的要求.

2)國家生產(chǎn)安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定無公害藥材中多菌靈的殘留量應(yīng)小于0.5 mg/kg，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，多菌靈在白術(shù)上最后一次施藥到采收應(yīng)不少于30 d，最好不少于40 d.

表2 多菌靈殘留分析方法的添加回收率

[1]劉乾開,朱國念.新編農(nóng)藥使用手冊[M].2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:309.

[2]吳麗明,黃伯俊.多菌靈對小鼠精子形態(tài)及雄鼠生育力的影響[J].職業(yè)醫(yī)學(xué),1992,19(l):11-12.

[3]蔣新田,丁明.多菌靈的熒光法測定研究[J].分析化學(xué),1989,17(9):823-825.

[4]丁明.多菌靈紅外光譜定量分析研究[J].農(nóng)藥,1989,28(1):16-17.

[5]Chiba M.Progress in clean-up and derivatization techniques for pesticide residue analysis[C]//Greenhalgh R,Roberts T R.Pesticide Science and Biotechnology.Oxford:Blackwell Scientific,1987:337-340.

[6]陳建立,姜敏怡.多菌靈薄層-紫外分析方法研究[J].農(nóng)藥,1986(4):6-7.

[7]李俊凱,易金蘭,程玲.柑桔中多菌靈殘留量紫外光譜分析[J].湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,21(2):131-134.

[8]桂文君,黃雅麗,吳慧明.多菌靈在柑桔及土壤中的HPLC殘留分析方法[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2004,3(3):25-27.

[9]王明月,袁宏球,王秀蘭.高效液相色譜法測定多菌靈農(nóng)藥中的有效成分含量[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2004,24(1):23-26.

[10]郝金芝.高效液相色譜法測定水果中的多菌靈[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2004,14(5):586-587.

[11]余向陽,駱愛蘭,劉賢進(jìn).小麥中多菌靈殘留的HPLC分析方法研究[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2004,3(1):17-19.

[12]Amadeo R F A,Ana T,Ana A.Determination of imidacloprid and benzimidazole residues in fruits and vegetables by liquid chromatography-masss pectrometry after ethylacetatemulti-residu extraction[J].JAOAC International,2000,83(3):748-755.

[13]Bushway R J,Hurst H L,Kugabalasooriar J,et al.Determination carbendazim in blueberries by reversed-phase high-perfomance liquid chromatography[J].Journal of Chromatography,1991,587(2):321-324.