Skp2在宮頸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

呂育純 饒靖紅 李愛祿 歐陽永娥

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈明顯上升并且有年輕化趨勢。雖然采用以手術(shù)、放療為主的綜合治療，但近20年來總5年生存率沒有明顯提高。細(xì)胞周期與細(xì)胞癌變的關(guān)系是近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)，G1期到S期的轉(zhuǎn)換失調(diào)是腫瘤形成的主要原因之一，Skp2是與此轉(zhuǎn)換密切相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控因子，目前國內(nèi)外有關(guān)這方面的報(bào)道甚少且結(jié)果不盡相同。我們采用免疫組織化學(xué)方法，檢測Skp2在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，分析了其表達(dá)水平與宮頸癌的臨床病理因素之間的關(guān)系，為臨床上進(jìn)一步了解宮頸癌的生物學(xué)行為、判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料來源

研究對象：收集我院2002年1月至2006年12月間手術(shù)切除、并經(jīng)病理檢查證實(shí)的65例宮頸浸潤癌石蠟標(biāo)本，20例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變石蠟標(biāo)本。所有研究對象具有完整的臨床資料、病理資料和隨訪資料。所有病例均為初治者，術(shù)前未接受過放射治療或化學(xué)治療。

臨床資料：宮頸浸潤癌(invasive cervical carcinoma，ICC)組：65例患者年齡29～61歲，中位年齡43歲；﹤40歲28例，≥40歲37例。FIGO分期：Ⅰa期6例，Ⅰb期23例，Ⅱa期27例，Ⅱb期9例。大體類型：外生型37例，內(nèi)生型7例，潰瘍型3例，糜爛型18例。局部腫瘤大?。?4 cm者34例，≥4 cm者31例。病理診斷均為宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌。組織學(xué)分級：高中分化癌(≤Ⅱ級)28例，低分化癌(Ⅲ級)37例。根據(jù)術(shù)后病理報(bào)告的宮頸肌層浸潤程度，浸潤﹤淺肌層21例，浸潤≥淺肌層44例。有脈管和(或)宮旁浸潤45例，無脈管和(或)宮旁浸潤20例。伴有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例。宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)組：CINⅡ3例，CINⅢ17例；年齡35～60歲，中位年齡44歲。對照組選擇同期因子宮肌瘤手術(shù)的60例宮頸正常組織(NCE)作為對照，年齡32～58歲，中位年齡45歲。3組患者年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

1.2 方法

所有標(biāo)本均經(jīng)10% 中性福爾馬林液固定，石蠟包埋。蠟塊連續(xù)4～5 μm厚度切片，貼于涂有0.05% 多聚賴氨酸的載玻片備用。采用免疫組化S-P法檢測Skp2。濃縮型Skp2鼠抗人單克隆抗體(克隆號2C8D9)，購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司，工作濃度為1∶200。超敏S-P檢測試劑盒，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。按說明書操作。用已知陽性對照片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。每例常規(guī)進(jìn)行HE染色。

1.3 結(jié)果判斷

與兩位病理科醫(yī)師一起獨(dú)立觀察每張切片后作出判斷。Skp2陽性表達(dá)部位主要在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞的細(xì)胞核，呈棕色或棕黃色顆粒，胞質(zhì)可以有少量表達(dá)；陽性染色細(xì)胞條件為細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、陽性顆粒定位好、著色與背景對比清楚。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行半定量處理。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色0分，黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分；陽性細(xì)胞比例評定標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)﹤5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，﹥50%為3分。2種評分得分相加，0～1分為陰性“-”，2～3分為弱陽性“+”，4～6分為強(qiáng)陽性“++”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5版統(tǒng)計(jì)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Skp2的表達(dá)及與臨床病理因素之間關(guān)系用卡方檢驗(yàn)，生存率采用Kaplan-Meier法計(jì)算，并繪制生存曲線，生存期差別的比較及Kaplan-Meier生存曲線采用 Log-rank 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Skp2表達(dá)

Skp2在宮頸癌癌細(xì)胞核部位染色陽性，低分化或轉(zhuǎn)移灶的癌細(xì)胞常出現(xiàn)Skp2染色強(qiáng)陽性，在CIN中Skp2為陽性或弱陽性，而在正常宮頸組織的基底細(xì)胞中偶爾可見胞核Skp2染色陽性。我們還觀察到Skp2表達(dá)細(xì)胞在正常宮頸組織局限于增生的基底和基底旁，高分化癌位于具有角化核心的癌島邊緣，而分化差的癌Skp2表達(dá)細(xì)胞則分布于整個(gè)標(biāo)本中。

宮頸癌組織中Skp2的陽性率為55.4 %，與CIN的25.0%比較有顯著性差異(χ2=5.655，P=0.017)，與正常宮頸組織Skp2的陽性率(6.7%)比較有極顯著性差異(χ2=34.031，P=0.000)，而CIN與正常宮頸組織Skp2蛋白的陽性率比較也有顯著性差異(χ2=5.505，P=0.025)，見表1。

表1 宮頸癌、CIN及正常組織中Skp2的表達(dá)(例)

2.2 宮頸癌中Skp2的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

宮頸癌中Skp2的陽性率隨著腫瘤分化程度的降低表達(dá)增高，其中高、中分化癌(≤Ⅱ級)和低分化癌(Ⅲ級)Skp2的陽性率分別為39.3%和67.6%，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)，見表2。

宮頸癌中Skp2的表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤顯著相關(guān)；宮頸間質(zhì)浸潤>淺肌層、有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤者，Skp2的陽性表達(dá)率顯著高于宮頸間質(zhì)浸潤≤淺肌層、無盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無脈管浸潤者，但Skp2的表達(dá)與年齡、腫瘤大小、臨床分期無明顯關(guān)系(P>0.05)，見表2。

Skp2陽性表達(dá)者盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤的發(fā)生率分別為33.3%(12/36)和47.2%(17/36)，Skp2陰性表達(dá)者則分別為0(0/29)和10.3%(3/29)，前者盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤的發(fā)生率顯著高于后者(P<0.01)。

2.3 Skp2表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

宮頸癌中，Skp2陽性表達(dá)36例，平均生存期51.3個(gè)月，5年生存率52.8%(19/36)；Skp2陰性表達(dá)29例，平均生存期為59.3個(gè)月，5年生存率69.0%(20/29)，見圖1。 Skp2陽性表達(dá)組的生存期及5年生存率均低于Skp2陰性表達(dá)組，經(jīng)Log-rank 檢驗(yàn)，Log-rank=8.60，P=0.0034，兩者差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Skp2表達(dá)與宮頸癌的預(yù)后顯著相關(guān)。

表2 宮頸癌中Skp2的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

圖1 Skp2表達(dá)陽性與陰性患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

3.1 宮頸癌中Skp2的表達(dá)及其意義

1995年Zhang等[1]首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)注射p45抗體或反義寡核酸能阻斷p45的功能，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，認(rèn)為p45增加與轉(zhuǎn)化細(xì)胞的細(xì)胞周期控制改變有關(guān)，p45因與細(xì)胞周期蛋白cyclin A相互作用而命名為Skp2(S-phase kinase-associated proteins 2)。Skp2基因定位于人5號染色體短臂上(5p13)，分子量約45 kD。由F-box序列、“Linker”序列、蛋白-蛋白相互作用模塊如亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeat，LRR)依次連接構(gòu)成[2]。

Skp2是泛素連接酶E3結(jié)合磷酸化p27的識別蛋白質(zhì)，參與p27的泛素化降解，與細(xì)胞周期的進(jìn)展，DNA的復(fù)制、細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。Skp2能調(diào)節(jié)CDKI的降解、控制Skp1A/B與CyclinA/CDK2復(fù)合物的結(jié)合、與Skp1結(jié)合以形成SCFSkp2復(fù)合物。此外Skp2還參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄因子E2F-1在G1末期積累，在S-G2期顯著降低；研究發(fā)現(xiàn)這種降低與Skp2有關(guān)，阻斷Skp2與E2F-1的相互作用可使E2F-1泛素化下調(diào)、穩(wěn)定性增加[3]。Skp2還能作為某些癌基因如c-myc的聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子，在其轉(zhuǎn)錄激活和泛素化降解中發(fā)揮重要作用，并促進(jìn)c-myc誘導(dǎo)的S期轉(zhuǎn)變和活化c-myc的靶基因[4]，而某些抑癌基因如PTEN也可能通過下調(diào)Skp2的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。

腫瘤發(fā)生的根本原因在于基因組的不穩(wěn)定，致使G1/S和G2/M 2個(gè)關(guān)卡失控，使本來應(yīng)該停止增殖或生理性凋亡的細(xì)胞不停地進(jìn)入細(xì)胞周期，因而造成細(xì)胞的惡性增生。Skp2具有促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S轉(zhuǎn)換“關(guān)卡”的作用，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，從而促進(jìn)DNA的復(fù)制、細(xì)胞的增殖。因此Skp2基因被認(rèn)為是1種原癌基因，具有癌基因功能。研究發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白在乳腺癌[3]、前列腺癌[6]、胃癌[7]，結(jié)腸癌[8]，宮頸癌[9]等多種惡性腫瘤中表達(dá)增加。

本項(xiàng)研究中，我們檢測到宮頸癌中Skp2的陽性率為55.4%，與Dowen等[9]在宮頸癌的研究結(jié)果相近。我們的研究結(jié)果顯示Skp2在宮頸癌中特異性表達(dá)，其表達(dá)水平明顯高于正常宮頸組織的6.7%和宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的25.0%，而且宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中 Skp2的陽性率也顯著高于正常宮頸組織。 這一結(jié)果提示Skp2的表達(dá)在宮頸癌的發(fā)生中可能起重要作用。

3.2 Skp2的表達(dá)與臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系

為進(jìn)一步探討Skp2在宮頸癌的發(fā)展進(jìn)程中的作用，我們分析了Skp2的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)組織學(xué)分級≤Ⅱ級的病例Skp2的陽性表達(dá)水平明顯低于組織學(xué)分級Ⅲ級的病例，這表明Skp2表達(dá)水平與腫瘤的分化相關(guān)，腫瘤分化越低其表達(dá)越高，Hershko等[8]在結(jié)直腸癌病例的研究中也有相似的報(bào)道，說明Skp2表達(dá)增高不同程度地影響腫瘤的分化程度及其惡性進(jìn)程。

同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)Skp2的表達(dá)水平與腫瘤的浸潤深度、是否有脈管浸潤密切相關(guān)，浸潤深度超過深肌層組，有脈管浸潤組Skp2的表達(dá)水平均明顯高于不超過淺肌層組，無脈管浸潤組。除此之外，Skp2的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，這些臨床病理因素與患者的預(yù)后密切相關(guān)。因此Skp2的上調(diào)可能與宮頸癌的惡性進(jìn)展有關(guān)，其高表達(dá)提示患者預(yù)后可能不良。Shigemasa等[10]用免疫組化法檢測134例卵巢腫瘤患者，發(fā)現(xiàn)腺瘤和低度惡性傾向腫瘤細(xì)胞中未檢測到Skp2的表達(dá)，而43例腺癌細(xì)胞中檢測到Skp2的表達(dá)，與前兩者有顯著性差異，并且晚期患者的Skp2表達(dá)檢出率明顯高于早期患者(P=0.01)。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，Skp2過度表達(dá)明顯與低生存率關(guān)聯(lián)，他們認(rèn)為Skp2過表達(dá)提示預(yù)后不良。我們從本研究中也發(fā)現(xiàn)，Skp2表達(dá)陽性的病例5年生存率明顯低于Skp2表達(dá)陰性的病例。進(jìn)一步支持宮頸癌中Skp2的高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)，Skp2的高表達(dá)是宮頸癌的高危因素之一。

綜上所述，Skp2的表達(dá)升高可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及惡性程度有關(guān)，檢測Skp2的表達(dá)水平對判斷宮頸癌的惡性程度和預(yù)后具有重要的參考價(jià)值，為術(shù)后輔助治療的選擇提供客觀依據(jù)，具有較大的臨床意義。因此，Skp2可以作為宮頸癌獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，為宮頸癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

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