放射性核素示蹤技術(shù)在碳納米顆粒生物效應(yīng)研究中的應(yīng)用

諸 穎，冉鐵成，李晴暖，徐晶瑩，李文新

中國科學(xué)院 上海應(yīng)用物理研究所 核分析技術(shù)重點實驗室，上海 201800

隨著納米科技持續(xù)迅速的發(fā)展，碳納米材料的生物效應(yīng)受到愈來愈廣泛的關(guān)注。一方面，碳納米材料由于其進(jìn)入細(xì)胞的高效率，有望用于構(gòu)建藥物靶向輸運系統(tǒng)的載體[1-2]；另一方面，隨著碳納米管和納米碳黑的大量生產(chǎn)和應(yīng)用，它們對環(huán)境和人類健康的潛在風(fēng)險引起人們的擔(dān)憂，其安全性已經(jīng)成為當(dāng)前毒理學(xué)研究的另一熱點[3-4]。無論是作為藥物載體的研制、還是生物安全性的研究和評估，都需要了解碳納米材料如何與生命體系相互作用以及這種作用如何影響生命體系。而納米材料進(jìn)入生命體系以及隨后在生命體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄則是研究兩者相互作用和產(chǎn)生相關(guān)生物效應(yīng)的重要基礎(chǔ)。

與大多數(shù)化學(xué)分子或生物分子不同，目前缺乏可以用于碳納米顆粒本身檢測和分析的特異性反應(yīng)，這成為研究碳納米材料與生命體系相互作用的障礙。由于放射性核素發(fā)射的射線有相當(dāng)高的探測靈敏度，因此，將放射性核素標(biāo)記碳納米顆粒、通過追蹤放射性的行跡就能探測到碳納米顆粒的位置和運動規(guī)律。放射性核素標(biāo)記和示蹤技術(shù)，由于方法簡單、快速，結(jié)果直觀可信，尤其可以檢測復(fù)雜生物組織中的納米顆粒的特點，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到愈來愈廣泛的應(yīng)用。21世紀(jì)納米科技的迅猛發(fā)展又為放射性示蹤技術(shù)開辟了新的應(yīng)用空間。本工作介紹了國內(nèi)外放射性核素標(biāo)記技術(shù)在碳納米材料與生命體系相互作用研究中的應(yīng)用。通過這些介紹不僅可以了解納米材料與生命體系的相互作用及其科學(xué)意義，而且可以進(jìn)一步認(rèn)識到經(jīng)典的放射化學(xué)技術(shù)在解決納米科技和生命科學(xué)這個新的交叉領(lǐng)域研究中起到的關(guān)鍵作用。

1 放射性示蹤技術(shù)研究碳納米顆粒的體內(nèi)生物分布

1.1 富勒烯衍生物的體內(nèi)生物分布

富勒烯家族的典型代表C60，是由60個碳原子組成的具有中空籠狀結(jié)構(gòu)的球形分子，分子直徑為0.71 nm。C60的特殊結(jié)構(gòu)賦予其許多奇異的生物活性，包括選擇性切割DNA、抗病毒、光動力學(xué)治療、清除自由基、抗氧化和抑制生物酶活性等。同時，C60分子含有30個雙鍵，具有高度的化學(xué)反應(yīng)活性，可以連接上多種藥物分子成為新的C60-藥物偶聯(lián)物。由于藥物分子尺度增大、溶解特性改變以及C60基團(tuán)本身的生物活性，使得這種新化合物有可能改進(jìn)藥物靶向性、增加藥物生物利用度、降低藥物的毒副作用，從而增進(jìn)藥物的治療效果。因此，C60作為藥物或藥物載體在醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景，C60衍生物的生物分布研究引起人們的極大興趣。

(1) 富勒烯衍生物在正常動物體內(nèi)的生物分布

富勒烯最簡單的衍生物是富勒烯多羥基衍生物(富勒醇)和多羧酸衍生物，由于容易制取、水溶性高，因而受到特別的關(guān)注。Yamago[5]給小鼠口服14C標(biāo)記的富勒烯羧酸衍生物，發(fā)現(xiàn)該衍生物只有少量被吸收，大部分隨糞便排出。采用靜脈注射方式給藥后，大部分標(biāo)記物在1 h內(nèi)被迅速輸送到各組織，48 h后90%聚集在肝中，很少有清除。注射一周后僅有2.4%標(biāo)記物隨糞便排出體外，滯留在器官組織里的不足2%，其余標(biāo)記物分布在肌肉和鼠毛里。標(biāo)記物在體內(nèi)滯留時間很長，并具有逾越血腦屏障的能力，但無急性中毒現(xiàn)象。Cagle[6]用籠內(nèi)含放射性166Ho的C82多羥基富勒醇，166Hox@C82(OH)y，研究了它在大鼠體內(nèi)的分布，結(jié)果表明，除了血液流量少的地方外，166Hox@C82(OH)y在全身都有分布，在肝中選擇性高度濃集，骨攝取居第二，清除均較慢，血池有不尋常的長時間殘留。注射4 h后，除腎、脾、骨、肝外，其余組織和器官攝取都顯著下降，腦中無攝取。標(biāo)記物通過腎排泄，5天內(nèi)排出20%完整的166Hox@C82(OH)y。

本研究組曾使用放射性核素99Tcm、125I 和67Ga標(biāo)記了2種富勒烯多羥基衍生物，富勒醇C60(OH)x(x=22～24)和富勒醇環(huán)氧化物C60(OH)xOy(x+y=22～24)，研究了pH、濃度、溫度和時間等對標(biāo)記率的影響以及標(biāo)記物的穩(wěn)定性[7-12]。小鼠靜脈注射后的生物分布結(jié)果指出，大部分標(biāo)記物在1 h時被迅速輸送到除腦外的各器官組織中，標(biāo)記物具有微粒樣的生物分布特征，容易富集在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，主要分布在肝、脾、骨等部位。富勒烯多羥基衍生物容易發(fā)生團(tuán)聚，實驗測定的粒徑約20 nm，這可能是具有微粒樣的生物分布特征的原因。此外，富勒醇在小鼠皮毛也有明顯的攝取，標(biāo)記物主要通過腎臟從尿道排出。99Tcm標(biāo)記的富勒醇在新西蘭大兔體內(nèi)的單光子發(fā)射計算機(jī)斷層(SPECT)圖像顯示的體內(nèi)分布特征與小鼠尸解和放射性測量結(jié)果基本相符[9]。上述實驗得到的生物分布資料為我們在富勒烯作為淋巴腫瘤靶向治療藥物和骨靶向藥物的新藥物設(shè)計和研究提供了實驗依據(jù)[13-14]。

(2) 富勒烯衍生物在荷瘤動物中的生物分布

在C60分子上連接臨床上使用的抗腫瘤藥物，新的C60-藥物偶聯(lián)物是否會由于C60基團(tuán)本身的生物活性和結(jié)構(gòu)效應(yīng)帶來更好的抗腫瘤藥效是很有意義的研究課題。紫杉醇是臨床上常用的一線抗癌藥物，已有報道，C60-紫杉醇衍生物具有緩釋效果[19]，因而具有潛在應(yīng)用價值，但是未見該化合物的體內(nèi)分布和靶向性研究資料。淋巴道是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要通道，及時進(jìn)行針對淋巴系統(tǒng)的治療可以降低惡性腫瘤轉(zhuǎn)移幾率，減小外科手術(shù)切除范圍，為原發(fā)灶的治療爭取寶貴時間，對提高患者的治愈率、生存率和治療后的生活質(zhì)量有重要意義。但是常規(guī)劑型的化療藥物沒有淋巴靶向性，如上文所述，C60具有微粒樣的生物分布特征，這使C60作為載體的抗癌藥物容易通過毛細(xì)淋巴管壁內(nèi)皮細(xì)胞間隙和內(nèi)皮細(xì)胞的胞飲進(jìn)入淋巴系統(tǒng)，因而有望構(gòu)建淋巴靶向給藥系統(tǒng)。經(jīng)皮下或腔內(nèi)注射以后，荷藥微粒順淋巴道移行，最后被載帶到淋巴結(jié)并較長時間在淋巴結(jié)濃集，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的目的。本研究組用臨床使用的惡性腫瘤化療藥物氮芥，成功合成了C60-苯甲醛氮芥。進(jìn)一步通過有機(jī)合成和隨后的同位素交換反應(yīng)得到苯環(huán)上標(biāo)記有放射性核素125I的C60-苯甲醛氮芥[20]。將標(biāo)記物行SD大鼠爪墊皮下注射。體內(nèi)分布結(jié)果表明，C60-氮芥在胃和胃內(nèi)容中的放射性攝取率最高，達(dá)60%ID/g；淋巴的攝取率也很高，約25%ID/g，僅次于胃，這提示該富勒烯衍生物有望用于胃癌治療，同時具有抑制癌細(xì)胞順淋巴道轉(zhuǎn)移的功效。細(xì)胞水平的藥效實驗表明，C60-氮芥對癌細(xì)胞的抑制作用小于氮芥，但在對大鼠原位胃癌模型的藥效分析實驗表明，C60-氮芥的抑瘤效果遠(yuǎn)大于氮芥，兩者的抑瘤率分別為69.7%和33.6%。更有意義的是，C60-氮芥能有效抑制腫瘤細(xì)胞的腹膜轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率分別為0%和20%，明顯優(yōu)于氮芥的40%和50%[13]。該實驗證明，C60-氮芥的更好藥效并不是源于化合物細(xì)胞毒性的增強(qiáng)，而是化合物對胃和淋巴系統(tǒng)的高靶向性，與臨床應(yīng)用的氮芥相比，C60-氮芥可能是更有效且毒副作用更小的治療胃癌的新藥物。由此可見，放射性核素標(biāo)記和示蹤技術(shù)在納米尺度靶向藥物的設(shè)計、研制和實驗驗證中起著重要作用。

1.2 碳納米管的體內(nèi)生物分布

碳納米管是由碳原子形成的石墨烯片層圍繞中心按一定的螺旋角卷曲而成的無縫、中空的納米管。按納米管管壁層數(shù)分為單壁碳納米管(SWNTs)和多壁碳納米管(MWNTs)。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，碳納米管是非常有效的細(xì)胞內(nèi)輸送藥物的載體，有望構(gòu)建新一類藥物靶向輸運體系。為了開展藥物輸運系統(tǒng)的研究和碳納米管大量進(jìn)入環(huán)境后的安全性評估，必須了解碳納米管在生命體內(nèi)的生物分布和代謝行為。

(1) 碳納米管在正常小鼠體內(nèi)的生物分布

自2002年北京大學(xué)王海芳等[21]首次用放射性核素標(biāo)記和示蹤技術(shù)開啟了碳納米管在小鼠體內(nèi)分布的研究以來，幾年中，納米管的生物分布已經(jīng)積累了比較豐富的資料[21-25]。研究過的碳納米管有水溶性羥基化SWNTs[21, 23]，牛磺酸修飾的MWNTs[22, 24]和葡糖氨修飾的MWNTs[25]。使用的放射性核素有125I[21, 24]、14C[22]、131I[23]和99Tcm[25]。這些研究結(jié)果雖然存在一些差異，但總的生物分布特征基本一致。靜脈注射后，檢測時相從1 h[21]、10 min[22]縮短到僅2 min[23], 就觀察到納米管的體內(nèi)分布，證明其可像小分子一樣在體內(nèi)各組織和器官間自由穿梭，迅速遷移。除了腦以外，大部分器官都有攝取，最高的攝取發(fā)生在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的肝和脾，此外，骨和肺也有較高的攝取。納米管通過腎臟從尿液排泄，但體內(nèi)清除很慢，靜脈注射后90天，依然在肝和脾中能夠檢測到大量的納米管。靜脈注射、腹腔注射、灌胃、皮下注射等不同給藥途徑后，其生物分布無明顯差異。Tween-80非共價修飾的MWNTs能顯著降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對MWNTs的攝取。

英、法和意大利的聯(lián)合研究小組使用螯合分子二乙三氨五醋酸(DTPA)對長度為300～1 000 nm的SWNTs進(jìn)行功能化修飾，然后將顯像核素111In連接在DTPA上，實現(xiàn)了化學(xué)修飾的水溶性SWNTs的放射性標(biāo)記。實驗中，每只小鼠從尾靜脈注射200 μL含60 μg(111In)DTPA-SWNTs的PBS溶液[26]，但是，生物分布測定結(jié)果與文獻(xiàn)[21-25]有很大不同。標(biāo)記物在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的肝、脾等沒有明顯的攝取和滯留，有趣的是肌肉、毛和肺卻有異常的攝取。所有臟器和組織的放射性活度很快降低，血液清除很快，半衰期只有約3 h。標(biāo)記物通過腎臟從尿液排出，且尿液中可以檢出完整的原形SWNTs。

由于納米顆粒的復(fù)雜性，有關(guān)生物效應(yīng)的實驗研究結(jié)果缺乏可比性，彼此矛盾的結(jié)果也時有發(fā)生。對于碳納米顆粒體內(nèi)生物分布的研究，今后應(yīng)該給出有關(guān)納米管形貌、尺度、功能化修飾和疏水性等性質(zhì)的詳細(xì)資料。要注意碳納米管在放射性核素標(biāo)記以后可能發(fā)生的特性變化，同時，放射性標(biāo)記物的體內(nèi)穩(wěn)定性對實驗測定的生物分布有非常重要的影響，一旦放射性核素從碳納米管上脫落，示蹤測量得到的是游離核素的生物分布，而不是碳納米管的生物分布。

(2) 碳納米管在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物分布

斯坦福大學(xué)的戴洪杰研究小組利用雙功能偶聯(lián)劑1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)將64Cu正電子核素連接在非共價修飾在SWNTs上的PEG上[27]。正電子發(fā)射計算機(jī)斷層(PET)技術(shù)指出，經(jīng)PEG非共價修飾的SWNTs在小鼠體內(nèi)相當(dāng)穩(wěn)定，血液清除時間較長且在肝、脾等內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)有較高的攝取。在該納米管的PEG鏈上接上精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)小肽后能使納米管高效地靶向到小鼠皮下U87MG腫瘤，并且對生物體沒有明顯的毒副作用。對于分子量為5 400的PEG修飾的SWNTs，引入RGD，使腫瘤攝取從注入劑量的3%～4%增加到10%～15%；靶與非靶組織的攝取比增加到15。結(jié)果提示碳納米管有望作為腫瘤早期診斷藥物的載體。但是，腫瘤靶向治療藥物輸運系統(tǒng)的研制，還需要進(jìn)一步研究抗腫瘤藥物在碳納米管上的負(fù)載、藥物在體內(nèi)的釋放或緩釋以及納米管的最終去向和生物安全性等[28]。

2 放射性示蹤技術(shù)研究碳納米顆粒的體外細(xì)胞攝取和分布

細(xì)胞是構(gòu)成生命體的基本單元，外界任何生物活性因子對機(jī)體的作用，均可通過細(xì)胞的形態(tài)與功能的改變表現(xiàn)并檢測出來。與動物模型相比，細(xì)胞模型具有較為簡單、易于控制實驗條件、實驗結(jié)果重復(fù)性較好等優(yōu)點。因此，大量碳納米顆粒的生物效應(yīng)研究都采用細(xì)胞模型進(jìn)行。碳納米顆粒與細(xì)胞相互作用的初始階段就是納米顆粒被細(xì)胞內(nèi)化而進(jìn)入細(xì)胞。研究納米顆粒的細(xì)胞攝取及其在細(xì)胞內(nèi)的分布是了解碳納米顆粒細(xì)胞生物效應(yīng)的重要基礎(chǔ)。

放射性核素示蹤技術(shù)用于碳納米顆粒細(xì)胞攝取和分布的研究報道并不多見。2002年Foley等[29]研究了水溶性富勒烯的羧酸衍生物C61(CO2H)2與人纖維原細(xì)胞HS68的相互作用。使用熒光技術(shù)，證明了C61(CO2H)2穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；使用差速離心法收集各相應(yīng)的細(xì)胞器組分，放射性計數(shù)結(jié)果表明該衍生物(14C-C61(CO2H)2)在線粒體分布最高，其次是細(xì)胞膜和微粒體，而細(xì)胞質(zhì)液中最低。本研究組用125I和99Tcm分別標(biāo)記了C60(OH)x，研究了標(biāo)記物和L02細(xì)胞以及CHO細(xì)胞的相互作用，未發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞對C60(OH)x有明顯的攝取[30]。對于CHO細(xì)胞，細(xì)胞裂解液的放射性水平只有對照組的2～3倍，但依然可以看到，無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中C60(OH)x的攝取率比有血清時的更高[30]。和C61(CO2H)2相比，C60(OH)x低的細(xì)胞攝取率可能起源于它們比C61(CO2H)2更高的水溶性，而血清蛋白通過和C60(OH)x相互作用進(jìn)一步提高了后者的水溶性，導(dǎo)致更低的細(xì)胞攝取。

和水溶性富勒烯衍生物不同，碳納米管和納米碳黑(NCB)有非常高的細(xì)胞攝取[31]。本課題組用99Tcm成功標(biāo)記了MWNTs和3種不同尺度的NCB[32]，定量檢測了人宮頸癌細(xì)胞Hela對這些顆粒的攝取量。實驗指出，碳納米顆粒濃度為100 mg/L時，MWNTs和NCB在完全培養(yǎng)液中的細(xì)胞攝取率為10%左右，當(dāng)培養(yǎng)液中無血清時，細(xì)胞攝取率增加到約30%[31, 33]。根據(jù)存活的細(xì)胞數(shù)，攝取率轉(zhuǎn)換為每1 000個細(xì)胞對碳納米顆粒的攝取量。對于直徑分別為51、20、14 nm的3種NCB，每1 000個細(xì)胞攝取量分別為350、389、509 ng。可見，無血清條件下，細(xì)胞對3種不同尺度NCB的攝取具有明顯尺度效應(yīng)，粒徑越小，攝取量越大，結(jié)果導(dǎo)致實驗檢測到的細(xì)胞毒性也越大[31, 33]。MWNTs的細(xì)胞攝取量與毒性關(guān)系不符合NCB的規(guī)律性，提示碳納米管的細(xì)胞毒性機(jī)制不同于NCB，可能由納米管制備時使用的金屬催化劑殘留所致[34-36]。實驗揭示的細(xì)胞攝取與血清和納米顆粒粒徑的依賴性對于深入理解碳納米顆粒與生物大分子的相互作用、納米顆粒的細(xì)胞內(nèi)化過程以及內(nèi)化機(jī)制具有重要科學(xué)意義；對于提高基因治療藥物的轉(zhuǎn)染率以及建立和規(guī)范碳納米顆粒細(xì)胞毒性檢測方法和評估標(biāo)準(zhǔn)等也有應(yīng)用價值。由此可見，放射性核素示蹤技術(shù)能夠定量地描述碳納米顆粒的細(xì)胞攝取，預(yù)期這將在納米醫(yī)藥和納米毒理學(xué)領(lǐng)域的研究中發(fā)揮更重要、更廣泛的作用。

3 結(jié)論和展望

碳納米顆粒經(jīng)過放射性核素標(biāo)記可以便利地用于納米顆粒與生命體的相互作用研究，得到納米顆粒在生命體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄等重要資料。這些量化資料對于納米顆粒作為載體的藥物設(shè)計、藥效研究、納米材料安全性研究和毒性評估等都起著重要作用。隨著放射性核素成像的SPECT 和PET技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是它們和CT 和MIR的圖像融合技術(shù)的建立和推廣，放射性核素標(biāo)記和示蹤技術(shù)使納米顆粒在生命體內(nèi)的行為和歸宿可以用醫(yī)學(xué)圖像顯示出來，這必將推動納米科技和生命科學(xué)的交叉領(lǐng)域研究的更快發(fā)展。

在細(xì)胞層次的研究中，盡管傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記和細(xì)胞成像已占有絕對優(yōu)勢，但放射性示蹤技術(shù)在未來會有更大的發(fā)展空間。其中一個原因是熒光標(biāo)記物的熒光信號不穩(wěn)定，分析過程中容易淬滅，使定量分析的精確度欠高。然而，更重要的原因和碳納米顆粒本身固有的奇異性質(zhì)密切相關(guān)。碳納米顆粒的奇異性質(zhì)源于它們巨大的比表面以及由此帶來的高反應(yīng)活性。放射性檢測的靈敏度高于熒光技術(shù)，標(biāo)記在納米顆粒上的放射性只需要少數(shù)放射性原子或無機(jī)小分子。相反，熒光標(biāo)記需要更多、更大的有機(jī)熒光分子，其結(jié)果將在更大程度上改變碳納米顆粒的表面性質(zhì)，影響碳納米顆粒生物活性的研究。近年來一些實驗也證明，人們對熒光素干擾碳納米材料生物活性研究的擔(dān)憂不是沒有根據(jù)。

納米顆粒的放射性核素標(biāo)記過程提出了不少屬于放射化學(xué)的問題，這本身對經(jīng)典的放射化學(xué)也是一項新挑戰(zhàn)。14C的放射性標(biāo)記中，核素是在碳納米材料合成時引進(jìn)的，因此幾乎能夠完全保持碳納米材料原有的特性，但是這種標(biāo)記技術(shù)只有少數(shù)實驗室能進(jìn)行，且14C壽命很長，影響檢測的靈敏度。使用125I、131I和99Tcm等放射性核素在碳納米顆粒上的直接標(biāo)記都存在機(jī)制不清楚的問題，目前尚不知道核素是以共價還是非共價方式和納米顆粒相結(jié)合，這也帶來對標(biāo)記物的體內(nèi)外穩(wěn)定性、標(biāo)記物在體內(nèi)的放射化學(xué)純度等問題的擔(dān)憂。若使用偶聯(lián)劑對碳納米顆粒進(jìn)行非直接標(biāo)記，則標(biāo)記位點和機(jī)制明確，且穩(wěn)定性也會提高，但可能帶來標(biāo)記后的納米顆粒是否還保留其本身特性的問題。因此，碳納米顆粒的放射性核素標(biāo)記技術(shù)推動了碳納米顆粒生物效應(yīng)的研究，反過來，也給經(jīng)典的放射化學(xué)提出了更多的研究課題。隨著碳納米管和富勒烯研究和應(yīng)用的進(jìn)一步深入和推廣，以及碳納米家族新成員，石墨烯片、石墨烯帶和納米金剛石的出現(xiàn)，放射化學(xué)必將在與納米科技和納米生物學(xué)的交叉研究中得到進(jìn)一步的充實和發(fā)展。

致謝：感謝本課題組李宇國和尹娟娟博士提供有用的資料和幫助。

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