高效毛細(xì)管電泳濁度法檢測牛奶及奶粉中的三聚氰胺*

霍 利 呂運(yùn)開 丁天惠

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，保定 071002) (河北保定天慧分離科學(xué)研究所，保定 071002)

三聚氰胺(melamine)簡稱三胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物[1]，主要用于生產(chǎn)三聚氰胺-甲醛樹脂，廣泛用于木材加工、塑料、涂料、皮革、醫(yī)藥等行業(yè)。由于經(jīng)典的凱氏定氮法無法測定氮的來源，不法商人便將其加入飼料，甚至奶粉中，冒充蛋白質(zhì)，提高產(chǎn)品的表觀蛋白質(zhì)含量，從中謀取暴利。自2007年在美國爆發(fā)寵物食品受三聚氰胺污染事件及2008年我國爆發(fā)了嬰幼兒因食用了含三聚氰胺的奶粉而致腎結(jié)石甚至死亡的惡性事件后，食品中添加三聚氰胺才引起廣泛的重視。

目前三聚氰胺的檢測方法主要為液相色譜法(LC)[2-8]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[9,10]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[11-17]及免疫學(xué)法。LC是目前最常用的測定方法，但由于三聚氰胺屬于強(qiáng)極性化合物，其在普通的C18色譜柱上幾乎無保留，因此需在流動(dòng)相中添加庚烷磺酸鈉或者辛烷磺酸鈉等離子對試劑以得到較好的保留。GC-MS和LC-MS均可作為三聚氰胺的確證方法，但設(shè)備價(jià)格昂貴，運(yùn)行成本高，不易普及。毛細(xì)管電泳是近十年來蓬勃發(fā)展的一種檢測方法，因其具有分離效率高且經(jīng)濟(jì)環(huán)保的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和食品安全檢測領(lǐng)域。目前毛細(xì)管電泳檢測三聚氰胺方法的報(bào)道較少，主要原因是國家規(guī)定的三聚氰胺限量嚴(yán)格，如嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1 mg/kg，液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉及其它配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg，而毛細(xì)管電泳對三聚氰胺的檢測靈敏度低，一般情況下無法直接檢測，需要復(fù)雜的柱前富集過程。饒欽雄等[18]采用三氯乙酸沉淀牛奶中蛋白質(zhì)，高速離心分離，經(jīng)MCX柱凈化富集，毛細(xì)管電泳分離檢測牛奶中三聚氰胺，方法的檢出限為0.5 mg/kg；Tsai等[19]同樣采用了高速離心和MCX柱凈化富集，在線富集毛細(xì)管電泳分離檢測奶中三聚氰胺，方法的檢出限為0.5 mg/kg。

筆者著重研究了樣品前處理方法和高效毛細(xì)管電泳濁度法，從而避免了復(fù)雜的柱前富集過程和繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作步驟，旨在建立簡便、低成本、準(zhǔn)確靈敏的牛奶和奶粉中三聚氰胺的高效毛細(xì)管電泳直接測定方法，使之成為企業(yè)和檢測部門的普適檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效毛細(xì)管電泳儀：TH-3000型，配紫外檢測器，河北省保定市天惠分離科學(xué)研究所；

離心機(jī)：80-2B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

酸度計(jì)：PHS-3C型，上海偉業(yè)儀器廠；

超聲波清洗器：KH3200B型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

三氯乙酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉：分析純；

十二烷基硫酸鈉(SDS)：純度大于99%；

三氯乙酸溶液：1%，將1 g三氯乙酸固體溶于水中定容至100 mL；

氫氧化鈉溶液：將1.9 g氫氧化鈉溶于水中并定容至50 mL；

磷酸鹽緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取40 mg磷酸二氫鈉溶于25 mL水中，加入300 μL濃磷酸，750 μL三氯乙酸水溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 2.05～2.07，加入25 mg SDS，混勻后超聲5 min，密閉保存；

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99%；

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：用三氯乙酸溶液溶解三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)需要稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

實(shí)驗(yàn)用水為自制二次蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)樣品的前處理方法

稱取牛奶或奶粉樣品5.0 g(精確至0.01 g)，加入1%三氯乙酸溶液混勻并定容至25 mL，渦旋1 min，超聲5 min，加熱至沸騰后自然冷卻，以4 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾，待測。

(2)電泳條件

毛細(xì)管柱：50 cm×75 μm，河北永年銳灃色譜器件有限公司；分離電壓：13 kV；溫度：25℃；進(jìn)樣量：12.3 kPa×3 s；檢測波長：236 nm。

(3)實(shí)驗(yàn)步驟

毛細(xì)管柱使用前依次用0.1 moL/L NaOH溶液、0.1 moL/L鹽酸溶液、超純水、緩沖溶液各沖洗3 min；兩次進(jìn)樣間用緩沖溶液沖洗3 min。沖洗完畢后將樣品裝柱，在12.3 kPa的壓力下，進(jìn)樣3 s后，在13 kV電壓條件下開始檢測并收集數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 濁度法電泳條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在一定的pH范圍內(nèi)，一定比例的三聚氰胺、三氯乙酸和SDS可生成沉淀，反應(yīng)液的濁度隨之增加，通過在緩沖溶液中添加三氯乙酸和SDS可明顯提高檢測靈敏度，且與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對照，三聚氰胺的峰面積Y(μV·s)與質(zhì)量濃度c(mg/L)之間呈良好線性關(guān)系。該法與普通毛細(xì)管電泳檢測方法相比，儀器的檢測靈敏度可提高1～2個(gè)數(shù)量級，且特異性強(qiáng)、重現(xiàn)性好。

(1)緩沖溶液的選擇

考察了磷酸鹽-磷酸、甲酸-甲酸銨和磷酸鹽-鹽酸緩沖體系。實(shí)驗(yàn)顯示，三聚氰胺在磷酸鹽-磷酸緩沖溶液中的響應(yīng)高，體系穩(wěn)定，故實(shí)驗(yàn)選定磷酸鹽-磷酸緩沖溶液為緩沖溶液。

考察10 、20 、30 mmol/L NaH2PO4的分離效果。結(jié)果表明，其分離效果相當(dāng)?？紤]到低離子強(qiáng)度時(shí)，電流小，遷移時(shí)間短；高離子強(qiáng)度時(shí)，電流大，噪聲大，遷移時(shí)間長，故確定緩沖溶液中NaH2PO4濃度為10 mmol/L。

在緩沖溶液中添加SDS后，方法靈敏度有了明顯提高，隨著SDS加入量的提高，靈敏度也越來越高，但遷移時(shí)間也延長。SDS濃度對0.2 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測靈敏度的影響情況見表1。根據(jù)表1結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選定緩沖溶液中加入SDS的濃度為1 mg/mL。

表1 SDS添加量對緩沖溶液的影響

緩沖溶液pH值對檢測靈敏度的影響見表2。當(dāng)對添加濃度為1 mg/kg的樣品進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，緩沖溶液pH值對檢測靈敏度的影響很明顯。只有精確控制緩沖溶液的pH 值為2.05～2.07，再加入適量的SDS，靈敏度才能達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

表2 pH值對緩沖溶液的影響

(2)其它電泳條件的選擇

實(shí)驗(yàn)對不同的電壓和進(jìn)樣量進(jìn)行了比較。較高電壓可以提高三聚氰胺的響應(yīng)值，但隨著電壓增加，電流增大，基線噪聲加大，毛細(xì)管中緩沖溶液發(fā)熱并產(chǎn)生氣泡，發(fā)生斷流現(xiàn)象，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過加大進(jìn)樣量可以提高儀器的響應(yīng)值，但是進(jìn)樣量過大會(huì)導(dǎo)致毛細(xì)管因超載而出現(xiàn)分離度降低、峰展寬等現(xiàn)象。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最后選擇分離電壓為13 kV、進(jìn)樣量為12.3 kPa×3 s。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化

由于三聚氰胺是極性化合物，可溶于弱酸，而牛奶樣品中含有豐富的蛋白質(zhì)，所以選用1%三氯乙酸水溶液作提取溶劑。經(jīng)大量的樣品試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加熱試樣至沸騰，再自然冷卻，既不影響對三聚氰胺的提取，又可以把蛋白去除干凈。經(jīng)加熱的試樣不需要高轉(zhuǎn)速離心就可以較完全沉降蛋白，上層清液可直接過膜上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)顯示，樣品的pH值對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大影響，經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，在每25 mL工作溶液中加入120 μL氫氧化鈉溶液，可明顯改善低濃度三聚氰胺的峰型。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

用1%的三氯乙酸水溶液稀釋儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.2、1、2、4、8、10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

在1.2(2)電泳條件下進(jìn)樣測定，三聚氰胺的峰面積Y(μV·s)與質(zhì)量濃度c(mg/L)之間呈良好線性關(guān)系。線性回歸方程為Y=1 610.3c+401.7，相關(guān)系數(shù)r2=0.999。

2.4 精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)

在對不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，溶液濃度為0.2 mg/L時(shí)，信噪比S/N=6，故方法的定量限為0.2 mg/L。取空白牛奶和奶粉樣品，添加三聚氰胺工作溶液，添加水平為1、5、10 mg/kg，按1.2實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定?？瞻讟悠泛吞砑佣肯匏?1.0 mg/kg)的樣品譜圖見圖1～圖4。每個(gè)添加水平測定5個(gè)平行樣，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算結(jié)果列于表3。

圖1 空白奶樣的毛細(xì)管電泳譜圖

圖2 添加1.0 mg/kg三聚氰胺奶樣的毛細(xì)管電泳譜圖

圖3 空白奶粉樣品的毛細(xì)管電泳譜圖

圖4 添加1.0 mg/kg三聚氰胺奶粉樣品的毛細(xì)管電泳譜圖

樣品添加量/mg·kg-1測得量/mg·kg-1回收率/%RSD/%牛奶15100.8324.8009.75083.296.097.52.72.81.8奶粉15100.8394.8809.37083.996.693.73.43.02.5

3 結(jié)論

毛細(xì)管電泳法在分析離子化合物方面具有很強(qiáng)的優(yōu)勢，而且分離效率高，時(shí)間短，重現(xiàn)性好，分離模式多種多樣；在前處理時(shí)，加入三氯乙酸后加熱樣品，改善了去除牛奶和奶粉中蛋白質(zhì)的效果，提高了對三聚氰胺的提取效率，尤其在檢測時(shí)利用濁度法通過對緩沖溶液pH值的精確控制的改進(jìn)和SDS的添加，提高了儀器檢測的靈敏度。在不進(jìn)行柱前富集的情況下，靈敏度與高效液相色譜法相近，而且樣品前處理更簡單，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，定量限可達(dá)1 mg/kg。該法可用于大量牛奶和奶粉樣品中三聚氰胺的快速檢測。

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