張銀亮,陳創(chuàng)夫,喬 軍,劉賢俠,王利曉,余勝利,胡朝輝

(1.石河子大學動物科技學院,新疆 832003;2.新疆地方與民族高發(fā)病實驗室,石河子 832003;3.新疆天康生物技術股份有限公司;4.新疆生產建設兵團農七師128團奶牛場)

奶牛子宮內膜炎是奶牛最常見的產科疾病,主要病因是奶牛產犢后產道尚未恢復完全,牛場環(huán)境中致病菌較多,奶牛產后抵抗力較弱,病原菌趁機侵入產道,造成奶牛子宮內膜等處產生炎癥。子宮內膜炎對奶牛的生產性能有很大影響,如產奶量下降、人工授精次數(shù)增加、妊娠可能性和受孕率降低等,致使奶牛淘汰率增高,給奶牛業(yè)造成巨大的經濟損失[1],其中以臨床型子宮內膜炎危害最為嚴重,它可使產后初配天數(shù)和受孕天數(shù)相應增加29.81 d和50.67 d[2]。當前,血液學研究已成為研究疾病病理發(fā)生發(fā)展的一種重要手段。本實驗針對新疆烏魯木齊、昌吉、石河子、奎屯奶業(yè)較為發(fā)達地區(qū)的6個規(guī)?；膛鲞M行子宮內膜炎致病菌的分離鑒定,并對其中19頭患子宮內膜炎奶牛和8頭健康奶牛進行血細胞成分分析測定,旨在明確引起奶牛子宮內膜炎的主要病原菌種類,并探討子宮內膜炎患牛和健康牛血細胞成分的關系。

1 材料與方法

1.1 動物及采樣材料 奶牛為引進澳大利亞荷斯坦?；蛑袊伤固古?來源于新疆烏魯木齊、昌吉、石河子、奎屯6個規(guī)?；?根據(jù)直腸檢查和子宮分泌物的觀察,選取子宮內膜炎患牛75頭和健康奶牛8頭,供采樣用。另選成年母兔8只、公兔1只用于配種(購于石河子大學實驗動物中心)。采樣材料為高錳酸鉀、新潔爾滅、酒精棉球、陰道開膣器、一次性無菌注射器、一次性輸精槍外鞘、滅菌棉簽、酒精燈、封口膜等。

1.2 培養(yǎng)基、染色劑及參考菌株 營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、葡萄糖蛋白胨酵母提取物增菌培養(yǎng)基(PYG)、厭氧菌血瓊脂(CDC)、血瓊脂基礎、吐溫-80、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、伊紅美蘭瓊脂(EMB)、麥康凱瓊脂、芽孢染色液(購于杭州天和生物試劑有限公司)、革蘭氏染色液(按照文獻[3]配制)等。參考菌株無乳鏈球菌、停乳鏈球菌為本實驗室保存,普通變形桿菌CMCC49027、金黃色葡萄球菌 ATCC29213、銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希氏菌ATCC35218、化膿性鏈球菌ATCC19615、沙門氏菌CMCC50094、化膿性鏈球菌ATCC19615、蠟桿芽孢桿菌CNCC63301等均購于杭州天和生物試劑有限公司。

1.3 生化鑒定試劑 腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管(批號090507)、葡萄球菌屬細菌生化編碼鑒定管(批號090428)、鏈球菌細菌生化編碼鑒定管(批號090520)、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、乙酰胺、甘露糖、精氨酸脫羧酶、D-核糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、肌醇、水楊素、木糖、山梨醇、衛(wèi)茅醇、肌醇、七葉苷、檸檬酸鹽、淀粉、明膠、紫牛乳(批號090601)靛基質試劑、蛋白胨水、VP試驗甲液、VP試驗乙液、甲基紅(MR)試劑、葡萄糖磷酸鹽胨水、硝酸鹽還原試劑(甲)、硝酸鹽還原試劑(乙)、硝酸鹽(還原)(批號090506)等均購于杭州天和生物試劑有限公司。

1.4 細菌分離與鑒定

1.4.1 采樣 保定子宮內膜炎患牛,先掏空直腸內宿糞,然后用0.1%的高錳酸鉀溶液清洗外陰,再用酒精棉球擦拭外陰,用滅菌開膣器打開陰道,由助手用一次性輸精槍外鞘沾取炎性分泌物并迅速投入營養(yǎng)肉湯和PYG液體培養(yǎng)基中,迅速帶回實驗室培養(yǎng)。用一次性無菌注射器尾靜脈采血并在4 h內送實驗室檢測。

1.4.2 細菌分離 經過24 h培養(yǎng)的菌液分別在營養(yǎng)瓊脂平板、CDC厭氧血平板、血平板、麥康凱平板、伊紅美蘭平板做四區(qū)劃線培養(yǎng)12～48 h,再根據(jù)菌落形態(tài)、溶血性、革蘭氏染色等特點挑取單菌落進行純培養(yǎng),后用終濃度為25%的甘油管-80℃保菌。

1.4.3 細菌鑒定 根據(jù)細菌在培養(yǎng)基上的生長情況和革蘭氏染色情況分為G+球菌、G-桿菌、G+桿菌、G-球菌4大類,以確定生化反應項目[4]。G+球菌:鏡檢呈葡萄串狀且經過氧化氫酶試驗陽性者進行葡萄球菌鑒定,鏡檢呈鏈狀且經過氧化氫酶試驗呈陰性者進行鏈球菌鑒定;G-桿菌:乳糖試驗陽性者,應用腸桿菌科生化微量鑒定管進行鑒定。乳糖試驗陰性者,可根據(jù)菌落生長情況和 MR試驗陰性者確定為銅綠假單胞菌,陽性者且遷徙生長為變形桿菌,歸于腸桿菌科;G+桿菌:根據(jù)其在普通平板上菌落形態(tài)呈蠟狀且通過芽孢染色可以看到芽孢初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌并進行相應的生化反應;G-球菌:未分離到。

1.4.4 細菌致病性實驗 按照文獻[5]方法做改進,對所分離的細菌進行致病性檢驗。選擇成年健康母兔,利用自制的子宮灌注器吸取分離到的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌24 h培養(yǎng)物,按1∶1比例混合導入母兔子宮內,混合菌液分別接種模型組1:2只健康未孕母兔;模型組2:2只產后3 d母兔;模型組3:2只產后3 d并用韌物刺激產道的母兔;另取2只健康母兔做對照,用同樣方法在子宮內注入滅菌肉湯。每3 d接種1次。每天10:00時和22:00時測量母兔體溫并觀察母兔陰道分泌物,待見陰道流出大量分泌物后將母兔撲殺,取子宮炎性分泌物進行細菌培養(yǎng),并觀察與先前接種的細菌是否一致。

1.5 血細胞成分分析 PE-6800Vet全自動血細胞分析儀,深圳市普康電子有限公司生產。血細胞分析儀應用試劑PE-L01型溶血劑(表面活性劑20 g/L、NaCl 6 g/L、緩沖劑4 g/L)、清洗液(濃縮)PE-CO2型(蛋白水解酶 250 mL/L、NaCl 7.5 g/L、食品著色劑 0.2 g/L、防腐劑2.5 g/L、緩沖劑4.0 g/L)、清洗液(強力)PE-CO3型(次氯酸鈉溶液120 mL/L、NaCl 8.6 g/L、表面活性劑2 g/L、防腐劑0.5 g/L、緩沖劑4.0 g/L)。對產后子宮內膜炎患牛和正常奶牛白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)、淋巴細胞(LYM)、中間細胞(MID)、粒細胞(GRAN)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞分布寬度SD(RDW-SD)、紅細胞分布寬度 CV(RDW-CV)、血小板平均體積(MPV)、血小板分布寬度(PDW)、紅細胞壓積(HCT)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板壓積(PCT)含量等進行測定。

2 結果

2.1 奶牛子宮內膜炎致病菌的分離鑒定結果 通過染色觀察、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)等鑒別方法,從75份子宮分泌物樣中分離出葡萄球菌、鏈球菌和腸桿菌等189株,全部為混合感染。生化鑒定結果:共分離得到金黃色葡萄球菌56株(占29.62%),大腸埃希氏菌52株(占27.51%),銅綠假單胞菌 25株(占13.23%),蠟樣芽孢桿菌22株(占11.64%),無乳鏈球菌17株(占8.99%),停乳鏈球菌10株(占5.30%),沙門氏菌 3株(占1.59%),中間葡萄球菌2株(占1.06%),表皮葡萄球菌、普通變形桿菌各1株(各占0.53%),嚴格厭氧菌未分離到。詳見表1。

表1 各分離菌株的種類及部分特性

2.2 細菌致病性試驗結果 母兔進行子宮內人工接種細菌后,除空白對照組外其余各組母兔接種第3天后即可看到少量膿性分泌物從母兔陰道流出且伴發(fā)陰道紅腫等癥狀,待母兔有大量炎性分泌物流出時,將炎性分泌物涂片鏡檢,可見大量的膿球、白細胞和少量脫落的子宮內膜上皮細胞碎片;將子宮分泌物進行細菌培養(yǎng)鑒定均可見先前灌注的細菌。模型組1和對照組初期體溫略有升高,后基本恢復正常;模型組2和模型組3母兔均表現(xiàn)體溫升高。詳見圖1。

圖1 母兔攻菌期間的體溫變化

2.3 子宮內膜炎患牛與健康奶牛血細胞成分比較子宮內膜炎患牛與健康奶牛血細胞成分比較見表2。SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析表明,健康奶牛組和奶牛子宮內膜炎組的LYM、GRAN、MCH、PDW、PCT差異極顯著(P＜0.01)。其余指標差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論與小結

奶牛子宮內膜炎的發(fā)病原因比較復雜,產后4周子宮內細菌感染是引發(fā)該病的主要原因[6-7]。據(jù)報道,引起奶牛子宮內膜炎的細菌有葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希氏菌、變形桿菌、克雷伯氏菌、棒狀桿菌和支原體等[8-11],本實驗對新疆奶業(yè)發(fā)達地區(qū)6個規(guī)?；膛龅?5例子宮內膜炎病進行細菌分離鑒定,共分離出葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鏈球菌等,基本與國內外的報道一致。

表2 子宮內膜炎患牛與健康奶牛血細胞成分比較

本次細菌致病性試驗以母兔為實驗對象,建立子宮內膜炎模型,結果表明,正常母兔子宮內人工接種細菌后初期母兔表現(xiàn)出體溫升高等,后期母兔的各項指標均恢復正常,說明正常母兔的子宮自凈功能很強,產后母兔組和產后并用韌物刺激產道的母兔組均表現(xiàn)出體溫升高并伴發(fā)有炎性分泌物從陰道流出,說明產后和產道損傷的母畜更易受到細菌的侵襲并引發(fā)子宮內膜炎。這就要求在生產過程中要加強母畜的管理,產前要給予母畜一定的鍛煉,減少難產的發(fā)生,產后要及時補充營養(yǎng)以增強母畜的免疫力,并做好消毒工作,最大程度上減少子宮內膜炎的發(fā)病。

本次血細胞分析結果表明,子宮內膜炎患牛血液中血紅蛋白及紅細胞的含量均普遍低于正常值,淋巴細胞比例下降,這與麻延峰[12]的報道結果一致。淋巴細胞是一種免疫活性細胞,不具有吞噬功能,主要誘導機體產生抗體。當淋巴細胞比例下降,說明奶牛自身的免疫力低下,導致子宮內一些新致病菌大量繁殖而引發(fā)子宮內膜炎。粒細胞降低是由于試驗選取化膿性子宮內膜炎病例,由于患牛處于產后早期能量負平衡與免疫力低下狀態(tài),因此其吞噬能力大大降低,這提示我們應該做好圍產后期飼養(yǎng)管理。由于新疆引進了大量的澳洲荷斯坦牛,經查閱文獻資料,未發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)引進奶牛血常規(guī)指標的參考數(shù)據(jù),故本研究采用了新疆本地飼養(yǎng)條件下的奶牛的參考值。由于奶牛的飼養(yǎng)方式、地域環(huán)境、品種、氣候條件等因素的影響,新疆奶牛集中飼養(yǎng)地區(qū)尚需進一步抽測不同發(fā)育階段、不同產后階段、不同年齡(胎次)、產奶水平、不同飼養(yǎng)方式下的奶牛的血常規(guī)指標,以便初步建立血細胞成分的參考標準,對生產更具有實際意義。

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