牙周膜干細胞生物學研究新進展*

賀慧霞 劉洪臣

牙周膜干細胞(periodontal ligamentstem cell,PDLSC)是牙周組織再生最直接、最可靠的種子細胞，也是牙周缺損細胞治療和基因治療重要的細胞學基礎，在牙周病治療、種植體周圍軟硬組織缺損修復、正畸牙移動過程中的修復與改建中均發(fā)揮重要作用，是近年來牙周病研究領域的焦點和熱點之一。其中關于 PDLSC的生物學作用、來源、組織學定位、分離方法、分化特性等方面研究都取得了可喜的新進展，為重新認識 PDLSC的生物學特性提供了依據(jù)。

1.PDLSC的生物學作用

PDLSC是指存在于牙周膜中具有自我更新和橫向分化潛能的未分化的干細胞群，是由處于不同分化層次、具有不同分化潛能的祖細胞或前體細胞組成[1]。目前已證實 PDLSC能分化形成牙骨質(zhì)、牙槽骨和牙周膜樣組織，但對于牙周骨缺損修復細胞來自骨組織還是來自牙周膜一直存在不同意見。最近有學者[2]通過 PDLSC示蹤發(fā)現(xiàn)：表達骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stem cell,BMSC)表面標志分子CD166、CD105的 PDLSC具有成骨潛能，當牙周損傷導致牙槽骨缺損后，這些 PDLSC遷移、分化為成骨細胞修復牙槽骨缺損，而牙周膜中不存在BMSCs。另有學者[3]將 PDLSC與生物支架材料羥基磷灰石-磷酸三鈣(HA/TCP)復合，體內(nèi)移植治療小型豬牙周缺損，術后12周經(jīng)細胞示蹤和組織學觀察，發(fā)現(xiàn) PDLSC能顯著提高新生牙周附著高度，這些研究表明 PDLSC是牙周損傷、缺損修復和再生的細胞學基礎。牙周再生是極其復雜的生物學過程，而了解牙周發(fā)育學過程無疑對深入研究 PDLSC的生物學作用和實現(xiàn)真正意義上的生物再生都至關重要。最近有報道顯示[4]：用發(fā)育中的根尖部牙胚條件培養(yǎng)基提供的生物學信號，可誘導 PDLSC向成牙骨質(zhì)樣細胞分化，形成牙骨質(zhì)，這也說明牙周損傷修復與牙周發(fā)育可能具有相同的生物學過程[5]。另外，Ivanovski等[6]采用微陣列(microarray)技術，比較了再生組織來源的細 胞(regenerating-tissue derived cell， RTC)和牙周膜間充質(zhì)細胞(periodontalligament mesenchymal cell,PLC)22000個基因表達，并進行功能分析，發(fā)現(xiàn)了兩種細胞基因表達有顯著差異，差異主要表現(xiàn)在與細胞來源相關的轉(zhuǎn)錄基因、與礦化組織形成相關基因、與牙周及顱面部發(fā)育及牙周再生修復中信號通路相關基因、及重要的生長因子、細胞因子基因。由此確定了參與牙周損傷修復過程中調(diào)控RTCs不同功能的多組基因。Liu等[7]也報道牙髓干細胞(dental pulp stem cell,DPSC)和 PDLSC分別在牙本質(zhì)、骨組織形成過程中CCND2、MME、DLL1等礦化相關基因表達上調(diào)，而KRT15等基因表達下調(diào)，這些基因相互作用是通過Notch、Wnt、FGF-β、BMP和Caderin等信號通路決定著干細胞的命運和組織再生。這些研究表明 PDLSC及其特異性基因在牙周損傷修復與再生中的重要作用，為揭示牙周損傷修復與再生的分子學機制奠定了基礎。

2.PDLSC來源和組織學定位

關于 PDLSC的來源目前有兩種觀點。一種觀點認為是牙周膜發(fā)育過程中原始牙囊組織中的未分化間充質(zhì)細胞存留在牙周組織中形成 PDLSC，這些細胞來源于外胚間葉，正常情況下處于靜息狀態(tài)，當外界刺激信號到達干細胞局部微環(huán)境(niche)，干細胞按照預定程序增殖、分化、遷移修復受損組織。目前已經(jīng)在人和大鼠牙周膜中發(fā)現(xiàn)了具有神經(jīng)外胚層和中胚層分化潛能的多能干細胞[8,9]，這些細胞表達HNK/P75/nestin等神經(jīng)外胚層及neurofilament M、β-tubulinⅢ等神經(jīng)膠質(zhì)細胞表面標志，并有少部分細胞表達肌纖維標志α-SMA，符合神經(jīng)嵴來源細胞體外培養(yǎng)具有極強可塑性的特點[10]。盡管目前尚不清楚其來源與BMSC是否相似，但諸多研究都表明其具有間充質(zhì)干細胞的特點，如克隆形成能力、增殖率高，表達間充質(zhì)干細胞特異性表面標志分子STRO-1等[1,10]。另一種觀點則認為 PDLSC來源于血運，定位在小血管周圍。有學者將3H-胸腺嘧啶標記經(jīng)靜脈注入小鼠體內(nèi)，分別在注射后1h到14d通過放射自顯影技術觀察磨牙牙周組織中標記細胞的數(shù)量和位置，發(fā)現(xiàn)在血管旁10μm范圍內(nèi)存在一標記細胞群，這些細胞較血管旁10μm以外區(qū)域增殖細胞細胞周期慢，大多數(shù)處于G0期，故認為它們可能就是牙周膜中的干細胞,這些細胞從牙槽骨的骨內(nèi)膜間隙遷移至牙周膜及牙骨質(zhì)表面,且毗鄰骨內(nèi)膜的牙周膜中的標記細胞高于骨內(nèi)膜內(nèi)的細胞達5倍以上，對應側(cè)的牙骨質(zhì)明顯增厚，這些都表明干細胞隨血運經(jīng)骨內(nèi)膜間隙定位于牙周膜內(nèi)[11]。最近尚有研究報道： PDLSC表達血管周圍細胞特異性標志分子CD146，共表達血管周圍相關抗原3G5和α-SMA[10,12]，為 PDLSC來源于牙周膜小血管旁提供了新的證據(jù)。

Chen[13]等通過原位組織學和免疫組化學比較了健康牙周組織和炎癥牙周組織中較為公認干細胞特異性標志蛋白STRO-1、CD146和CD44表達情況。發(fā)現(xiàn)對于健康牙，PDLSC分布在牙周近冠、近根尖區(qū)和根分叉區(qū)的牙根表面；而牙周病患牙近冠部牙周組織因炎癥受損， PDLSC分布在其根分叉區(qū)和根尖區(qū)，且在血管周圍0-20μm范圍內(nèi)，而且牙周病患牙的牙周膜中分布最多。此外，牙周病患牙的牙周膜血管外區(qū)域及靠近牙骨質(zhì)部位，尚可見大量干細胞特異性蛋白染色陽性區(qū)域，而健康牙周組織中 PDLSC較少，分布在血管外區(qū)和近牙骨質(zhì)部。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是病變早期，血管旁的 PDLSC對炎癥刺激因子和細胞外基質(zhì)的一種反應，PDLSC動員、募集并遷移到受損的牙周膜組織區(qū)，參與牙周膜損傷修復[1,14]。實際上，STRO-1、CD146染色陽性的血管旁細胞有兩種不同的細胞表型：一種是內(nèi)皮細胞，有扁平而長的胞核和胞漿，這兩種抗體與血管壁的內(nèi)皮細胞發(fā)生交叉反應導致其表達陽性[14]，而且血管旁干細胞和內(nèi)皮細胞還表達其它間充質(zhì)細胞標志如CD105、CD106和CD166。另一種則可能是干細胞，胞核深染，呈圓形或卵圓形，胞漿很少，形態(tài)酷似從牙髓和骨髓中分離的干細胞[15,16]。這表明：健康牙的牙周膜的干細胞可能位于牙周膜的小血管旁，而牙周炎患牙牙周膜干細胞位于血管旁及血管外及靠近受損組織部位；這些血管旁及血管外區(qū)域表達干細胞標志的細胞可能有一部分是血管內(nèi)皮細胞，精確分離和鑒定這些干細胞尚需更特異的從DNA特征做更進一步界定。

3.PDLSC的分離、鑒定和分化潛能

從不同組織中分離成體干細胞目前尚無統(tǒng)一、理想的方法，一般主要是根據(jù)干細胞具有克隆形成能力的普遍特點和不同干細胞所特有的生物、物理學特性進行分離和鑒定的。 PDLSC由于尚無確定的特異性標志，目前主要采用STRO-1、CD146等公認的間充質(zhì)干細胞標志蛋白經(jīng)免疫磁珠或流式細胞分選法分離，這也是根據(jù) PDLSC與BMSC、DPSC具有相似的組織結(jié)構(gòu)和胚胎來源，沿用后兩種干細胞的分離方法進行分離的[17]。同時，干細胞具有高度的克隆形成能力，可采用酶消化法原代培養(yǎng) PDLSC，再用克隆分離法進行分離，這是最早分離研究DPSCs的方法。隨著對 PDLSC研究的不斷深入，關于 PDLSC表達STRO-1、CD146等間充質(zhì)干細胞表面標志和某些血管周細胞表面標志CD105、CD106、CD166已達成共識，采用STRO-1抗體免疫磁珠分離或STRO-1抗體通過流式細胞分選是目前較為公認的有效分離方法[1,10,16,17]。最近，Gronthos[18]尚采用特異性間充質(zhì)干細胞標志蛋白CD106通過免疫磁珠法從綿羊的牙周膜組織中成功分離 PDLSC。

成體干細胞的鑒定，目前普遍是根據(jù)的兩大特點：自我更新能力和橫向分化潛能來確定。在體外，干細胞的自我更新能力則表現(xiàn)為能形成細胞克隆的能力，酶消化的牙周膜細胞中有3.75-11.66%的細胞具有克隆形成能力。在體內(nèi)將分離的PDLSC與生物支架材料HA/TCP復合后植入免疫缺陷裸鼠皮下，8周組織學觀察可見 PDLSC分化形成包含牙骨質(zhì)、牙槽骨和牙周膜結(jié)締組織的全部牙周組織[12]。新形成組織還檢測到牙周膜類似于腱組織的特異性轉(zhuǎn)錄因子—Scleraxis明顯高于BMSC對照組形成的骨組織；此外，新形成組織還表達牙周膜相關蛋白-1(PLAP-1)和牙骨質(zhì)特異性標志蛋白—牙骨質(zhì)附著蛋白。這些都表明PDLSC體內(nèi)移植后形成了真正意義上的牙周膜、牙骨質(zhì)和骨組織，具有形成全部來源組織的自我更新能力[19,20]。

作為干細胞，PDLSC具有向其它類型組織細胞橫向分化的潛能。在體外礦化誘導培養(yǎng)條件下，PDLSC能分化為成骨樣細胞，形成鈣化結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶活性升高，表達成骨相關蛋白：骨鈣素、骨涎蛋白、骨橋素、Ⅰ型膠原等[1,8,21]；在成脂培養(yǎng)條件下，PDLSC能向脂肪樣細胞分化，形成油紅特染的脂滴，并表達脂肪細胞特異性蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)和低密度脂蛋白(LPL)[10,16,22]。 PDLSC在含一定濃度的二甲亞砜、丁羥回醚、福絲扣林、β-巰基乙醇和氫化可的松的聯(lián)合誘導條件下可向神經(jīng)細胞樣分化，形成典型的樹突狀細胞，并表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)等神經(jīng)細胞表面標志[10，23]。最近，Gay等人用10ng/ml的轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGFβ3)誘導 PDLSC分化為軟骨樣細胞，并形成對甲苯胺藍有異染性的軟骨樣基質(zhì)，RT-PCR檢測有Ⅱ型膠原的表達[24]。這些特點充分說明 PDLSC具有多向分化能力。

另外，細胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及細胞動力學等生物學特性也是鑒定干細胞的重要方面。PDLSC具有與其它成體干細胞相似的生物物理學特點。PDLSC通常較周圍成熟細胞或終末分化的細胞體積小，位于小血管周圍，在形態(tài)上趨于未分化狀態(tài)，圓形或卵圓、多角形，但在不同培養(yǎng)條件下有時有明顯的形態(tài)學差異[12]。由于 PDLSC是由處于不同分化階段異質(zhì)型細胞構(gòu)成，因此，在超微結(jié)構(gòu)上部分細胞也具有未分化細胞的特點，如核漿比例較低，胞漿內(nèi)細胞器較少等[21]。處于局部微環(huán)境中的 PDLSC多保持靜止狀態(tài)，細胞處于G0期。但當外界刺激信號引起干細胞原有的狀態(tài)改變，則這些干細胞進入細胞周期，顯示高度的增殖能力和分化能力。

值得思考的是日本學者Techawattanawisal等[25]最近采用神經(jīng)球培養(yǎng)系統(tǒng)從成年大鼠牙周膜組織中成功分離了PDLSC。其依據(jù)是牙周膜組織是由顱面組織發(fā)育過程中的外胚間葉細胞發(fā)育而來，那么，出生后牙周膜中的干細胞應該具有神經(jīng)嵴來源干細胞的特點，能夠分化成神經(jīng)和外胚間葉的子代組織如外周神經(jīng)、神經(jīng)膠質(zhì)和骨骼肌。該系統(tǒng)已經(jīng)成功用于骨髓、真皮和角膜等多種非神經(jīng)組織干細胞的分離和培養(yǎng)，這種以基礎培養(yǎng)基和生長因子為主要成分的無血清培養(yǎng)基能使干細胞在懸浮培養(yǎng)過程中增殖形成小球，而不同于傳統(tǒng)細胞貼壁培養(yǎng)。結(jié)果顯示PDLSC在懸浮培養(yǎng)中形成了類似于神經(jīng)球的干細胞球，并表達神經(jīng)嵴來源細胞的標志基因Twist,Slug,Sox2和Sox9，而且可以分化為神經(jīng)元樣、膠質(zhì)樣、少突膠質(zhì)細胞樣細胞和肌管，這與以前有關 PDLSC的報道截然不同，認為傳統(tǒng)采用貼壁培養(yǎng)法所獲得的PDLSC，其特性研究建立在多次傳代的細胞基礎上，其原始的生物學性狀在傳代中可能已經(jīng)發(fā)生改變或因細胞不貼壁而被棄去。而此體系可保持原始干細胞的特征，有利于人們發(fā)現(xiàn)PDLSC完全不同于傳統(tǒng)間充質(zhì)干細胞的某些特性。最近有報道采用該體系從外周血中成功分離了非粘附性的成骨細胞，這也表明該方法的獨特優(yōu)勢[26]。另有報道已經(jīng)從真皮中分離出具有神經(jīng)嵴來源干細胞特點的皮膚干細胞。這表明牙周膜中存在神經(jīng)嵴來源的干細胞，采用此法所分離的 PDLSC具有神經(jīng)嵴源性干細胞的特性，提示 PDLSC還將有可能在治療肌萎縮等疾病方面發(fā)揮作用。

由此可見,對 PDLSC的生物學特性目前我們還知之很少，對 PDLSC還有許多未解之謎，諸如上述這兩種完全不同的培養(yǎng)方法所分離的 PDLSC所表現(xiàn)出顯著不同的生物學形狀差異，是干細胞自然特性的不同表現(xiàn)形式，抑或不同體外培養(yǎng)條件導致 PDLSC內(nèi)在特性的改變；這些差異的分子生物學基礎及其特異性標志等，對這些問題的思考和解答必將推動對 PDLSC研究不斷走向深入。

4.結(jié)語

PDLSC的發(fā)現(xiàn)是干細胞理論與相關技術發(fā)展的結(jié)果，也是牙周生理、病理學研究的一大飛躍。對 PDLSC生物學特性的研究是認識和應用PDLSC的必由之路。盡管目前對 PDLSC的研究才剛起步，許多方面仍有待于深入研究。但PDLSC在牙周生理功能維持、病理損傷修復中的重要作用及牙周再生方面潛在的巨大應用前景，為PDLSC生物學及其相關研究提供了新的契機。

[1]Seo BM,Miura M,Gronth os S,et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J].Lancet 2004,364(9429),149-155

[2]Ohta S,Yamada S,Matazaka K,et al.The behavior of stem cells and progenitor cells in the periodontal ligament during wound healing asobserved using immunohistochemical method[J].J Periodontal Res.2008,43(6)：595-603

[3]Liu Y,Zheng Y,Ding G,et al.Periodontal ligament stem cell-mediated treatment for periodontitis in miniature swine[J].Stem cells.2008,26(4)：1065-1073

[4]Yang ZH,Zhang XJ,Dang NN,et al.Apical tooth germ cell-conditioned medium enhances the differentiation of periodontal ligament stem cells into cementum periodontal ligament-like tissue[J].J Periodont Res.2009,44(2)：199-210

[5]Ripamoni U.Recapitulating development：a template for periodontal tissue engineering[J].Tissue Eng.2007,13(1)：51-71

[6]Ivanovski S,Lichanska AM,Aniello ED,et al.Gene expression profiling of cells involved in periodontal regeneration[J].Tissue Eng.2007,13(2)：393-404

[7]Liu L,Ling J,Wei X,et al.Stem cell regulatory gene expression in human adult dental pulp and periodontal ligament cells undergoing odontogenic differentiation[J].J Endod.2009,35(10)：1368-1376

[8]Techawattanawisal W,Nakahama K,Komati M,et al.Isolation of multipotent stem cells from adult rat periodontal ligament by neurosphere forming culture system[J].Biochem Biophys Res Commun 2007,357(4)：917-923

[9]Widera D,Grimm WD,Moebius JM,et al.Highly efficient neural differentiation of human somatic stem cells,isolated by minimally invasion periodontal surgery[J].Stem Cell Dev 2007,16(3)：447-460

[10]Coura GS,Garcez RC,Mendes de Aauiar CBN,et al.Human periodontal ligament：a niche of neural crest stem cells[J].J Periodont Res.2008,43(5)：531-536

[11]Ivanovski S,Gronthos S,Shi S,et al.Stem cells in the periodontal ligament[J].Oral Dis.2006,12(4)：358-363

[12]Nagatomo K,Komaki M,Sekiya L,et al.Stem cell properties of human periodontal ligament cells[J].J Periodontal Res.2006,41(4)：303-310

[13]Chen SC,Marino V,Gronthos S,et al.Location of putative stem cells in human periodontal ligament[J].J Periodont Res.2006,41(6)：547-553

[14]Murillo J,Wang Y,Xu X,et al.Advanced glycation of type I collagen and fibronection modifies periodontal cell behavior[J].J Periodontol.2008,79(11)：2190-2199

[15]Gronthos S,Zannettino AC,Hay SJ,et al.Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow[J].J Cell Sci.2003,116(9)：1827-1835

[16]Shi S, Gronthos S. Perivascularniche ofpostnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp[J].J Bone Miner Res 2003,18(4)：696-704

[17]賀慧霞，劉洪臣，王東勝,等.人與犬牙周膜干細胞的生長特性比較[J].口腔頜面修復學雜志，2009,10(2)：65-68

[18]Gronthos S,Mrozik K,Shi S,et al.Recovery of stem cells from cryopreserved periodontal ligament[J].Calcif Tissue Int.2006,79(5)：310-317

[19]Yamada S,Tomoeda M,Ozawa Y,et al.PLA-1/asporin,a novel negative regulator of periodontal ligament mineralization[J].J Biol.Chem.2007,282(32)：23070-23080.

[20]Carmona-Rodríguez B,Alvarez-Pérez MA,Narayanan AS,et al.Human cementum protein 1 induces expression of bone and cementum proteins by human gingival fibroblasts[J].Biochem Biophys Res Commun.2007,358(3)：763-769

[21]賀慧霞,劉洪臣,王東勝，等.礦化液促進犬牙周膜細胞異位成骨實驗[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志，2008,6(3)：161-165

[22]賀慧霞,劉洪臣,王東勝，等.人牙周膜干細胞向脂肪細胞方向誘導分化實驗[J].華西口醫(yī)學雜志，2010,28(2)：203-207

[23]高 秦.人牙周膜干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和體外誘導分化的實驗研究[D].第一軍醫(yī)大學碩士學位論文,2006年，廣州

[24]GayIC,ChenS,MacDougallM.Isolationand characterization of multipotent human periodontal ligament stem cells[J].Orthod Craniofacial Res.2007,10(3)：149-160

[25]Techawattanawisal W,Nakahama K,Komaki M,Abe M,Takagi Y,Morita I.Isolation of multipotent stem cells from adult rat periodontal ligament by neurosphere-forming culture system[J].Biochem and Biophys Res Comm.2007,357(4)：917-923

[26]Eghbali-Fatourcchi GZ,Lamsam J,et al.Circulating osteoblast-lineage cells in humans.N.Engl.J.Med.2005,352：1959-1966