反向遺傳學(xué)在植物研究中的應(yīng)用

撰文/閆曉丹*

1、反向遺傳學(xué)及其技術(shù)介紹

反向遺傳學(xué)（reverse genetics）是相對(duì)于正向（經(jīng)典）遺傳學(xué)而提出的。經(jīng)典遺傳學(xué)的系統(tǒng)研究是從孟德?tīng)柕耐愣够▽?shí)驗(yàn)開(kāi)始的，就是通過(guò)研究生物的表型、性狀來(lái)推測(cè)其遺傳物質(zhì)組成、分布與傳遞規(guī)律等，從而研究生命過(guò)程的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律的。即正向遺傳學(xué)主要研究生物突變性狀的遺傳行為，如控制突變性狀的基因數(shù)目及其在染色體上的位置以及突變性狀在后代中的傳遞規(guī)律等。反向遺傳學(xué)則是在已知基因序列的基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)代生物理論與技術(shù)，通過(guò)核苷酸序列的突變、缺失、插入等手段創(chuàng)造突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng)。即反向遺傳學(xué)是直接從生物的遺傳物質(zhì)入手來(lái)研究基因的生物學(xué)功能，闡述生物生命發(fā)生的本質(zhì)現(xiàn)象與規(guī)律，如生物的繁殖復(fù)制機(jī)制、病毒的致病機(jī)制等。

而與反向遺傳學(xué)操作相關(guān)的各種技術(shù)統(tǒng)稱為反向遺傳學(xué)技術(shù)（r e v e r s e g e n e t i c s approach），包括RNA 干擾（RNA interference ,RNAi）技術(shù)、基因沉默技術(shù)、基因體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)等，是DNA 重組技術(shù)應(yīng)用范圍的擴(kuò)展與延伸。隨著基因組序列測(cè)定技術(shù)的日漸成熟，反向遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。目前反向遺傳學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，且在病毒研究方面已經(jīng)顯示出了巨大的作用，尤其是RNA 病毒的研究方面。

2、反向遺傳學(xué)的應(yīng)用

2.1 用于拯救病毒或創(chuàng)造新型病毒 根據(jù)一些病毒的有關(guān)的已知核酸序列，采用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)可以構(gòu)建出“人為設(shè)計(jì)”的病毒，得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列為基因組的新型病毒，這給獲得高免疫原性的低致病力毒株來(lái)制造疫苗提供了一個(gè)全新的途徑。也可在生產(chǎn)疫苗時(shí)，將流行毒株與高產(chǎn)毒株進(jìn)行基因重配，得到同時(shí)具有高產(chǎn)特性和流行毒株抗原性的重組毒株，以提高疫苗產(chǎn)量。此外，由病毒的cDNA體外轉(zhuǎn)錄來(lái)獲得拯救病毒是研究RNA 病毒致病機(jī)制的有效手段。最早人們利用體外連接的方法將小片段的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）產(chǎn)物連接起來(lái)，構(gòu)建成病毒基因組全長(zhǎng)的cDNA，并以此為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，然后轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞以獲得感染性的拯救病毒。近年來(lái)長(zhǎng)鏈RT-PCR 技術(shù)發(fā)展迅速，使一次性擴(kuò)增出病毒基因組全長(zhǎng)的cDNA，并直接以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板來(lái)獲得拯救病毒成為可能。

2.2 用于負(fù)股RNA病毒的研究 反向遺傳學(xué)技術(shù)通過(guò)構(gòu)建含有特定序列的感染性RNA病毒，在DNA 分子水平上對(duì)RNA 病毒感染性克隆進(jìn)行體外操作，從而研究這些病毒特定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、病毒各成分之間及病毒與細(xì)胞間相互作用、病毒致病機(jī)制、構(gòu)建病毒載體及活疫苗的生產(chǎn)等。該技術(shù)最先是在正鏈RNA病毒上得到成功使用的。目前，已經(jīng)獲得了脊髓灰質(zhì)炎病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、煙草花葉病毒、登革病毒等的感染性分子克隆，且小RNA 病毒、黃病毒、甲病毒等正鏈RNA 病毒作為載體表達(dá)異源病毒蛋白的嘗試也取得了重大進(jìn)展。

2.3 反向遺傳學(xué)研究的重要方法RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用 生物的每個(gè)組織、細(xì)胞所攜帶的遺傳信息是完全一致的，然而其形狀、功能和蛋白質(zhì)組成等具有明顯不同，這都是由基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)空性所導(dǎo)致的。基因表達(dá)的調(diào)控有轉(zhuǎn)錄前調(diào)控（即調(diào)控靶基因DNA）和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（即調(diào)控靶基因mRNA）兩種途徑。內(nèi)源性雙鏈RNA干擾（double-strand RNA interference, dsRNAi）技術(shù)和反義RNA技術(shù)是調(diào)控靶基因mRNA的重要方式。RNAi是生物細(xì)胞內(nèi)普遍存在的對(duì)抗病毒基因、轉(zhuǎn)座子或人工轉(zhuǎn)入基因所表達(dá)的mRNA 等外源基因的侵害，調(diào)控自身基因表達(dá)以防范疾病的一種自我保護(hù)現(xiàn)象，其提供了一種特異性失活功能基因的方法。它是指當(dāng)與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞后，使該mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其基因表達(dá)的沉默，即轉(zhuǎn)錄后基因沉默。

RNAi 技術(shù)是反向遺傳學(xué)研究的重要手段，其在抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子和參與胚胎發(fā)育等方面具有重要的生物學(xué)功能。在功能基因組的研究中，需要對(duì)特定基因進(jìn)行功能喪失或降低的突變以確定其功能。由于RNAi 具有高度的序列專一性，可以特異的使特定基因沉默，從而獲得功能喪失或降低的突變。因此，RNAi 可作為功能基因組研究的強(qiáng)有力的手段。與目前基因治療中常用的方法如反義RNA技術(shù)或轉(zhuǎn)入沒(méi)有功能的突變體相比，RNAi對(duì)基因表達(dá)的抑制具有高效、特異、簡(jiǎn)便易行的特點(diǎn)。因此，RNAi 在人類功能基因組研究和疾病治療上也有很大的應(yīng)用潛力。在植物中，RNAi 不僅作為一種防御機(jī)制，而且在植物發(fā)育過(guò)程中，通過(guò)使DNA甲基化或使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變等參與內(nèi)源基因的表達(dá)調(diào)控。

2.4 用于基因方面的研究 反向遺傳技術(shù)在病毒、動(dòng)物、植物等基因研究方面具有重大應(yīng)用價(jià)值,并取得了較大進(jìn)展。一部分用于研究高等動(dòng)植物相關(guān)基因功能:一些高等動(dòng)、植物（如人類、水稻和Arabidopsis）測(cè)序完成后,最具有挑戰(zhàn)性的工作就是確定所有基因序列的生物學(xué)功能,通過(guò)基因突變、刪除等,利用反向遺傳學(xué)方法來(lái)研究未知基因的功能已受到研究者的廣泛關(guān)注。也可用該方法研究致使植物雜交不育與雜交失活相關(guān)基因的功能,是物種形成的遺傳學(xué)研究的良好工具。另一部分用于基因的克隆測(cè)序與定位:用反向遺傳學(xué)途徑克隆新基因是依據(jù)被克隆基因在染色體上的位置來(lái)實(shí)現(xiàn),以圖位克隆與轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)為常見(jiàn)。隨著現(xiàn)代生物信息學(xué)的發(fā)展,出現(xiàn)了更為便捷的電子克隆（silicon cloning）方法。還可以用于研究動(dòng)、植物細(xì)胞內(nèi)DNA 的同源重組,基因序列分析，可在DNA的分子水平上構(gòu)建嵌合病毒以研究病毒基因組的基因功能。此外,反向遺傳技術(shù)也被用于研究蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用關(guān)系等方面。

3、反向遺傳學(xué)應(yīng)用中存在的問(wèn)題

反向遺傳學(xué)技術(shù)是隨著分子生物學(xué)技術(shù)尤其是DNA 重組技術(shù)的發(fā)展而建立起來(lái)的一門技術(shù),在各科學(xué)研究領(lǐng)域里具有廣闊的應(yīng)用潛力。隨著對(duì)生物分子水平的認(rèn)識(shí)與了解, 以及人類和其他生物基因組測(cè)序、分析的完成,直接從遺傳物質(zhì)著手來(lái)研究解釋生命本質(zhì)與現(xiàn)象將變得越來(lái)越便捷、省時(shí),在利用反向遺傳學(xué)技術(shù)為人類健康、生存服務(wù)的同時(shí),也應(yīng)加以高度的警惕,避免構(gòu)造出對(duì)社會(huì)和人類健康造成威脅的病毒株或生物。目前，反向遺傳學(xué)在植物中的應(yīng)用還不十分廣泛，因此，反向遺傳學(xué)在植物中如何應(yīng)用，對(duì)于植物育種學(xué)家而言即是機(jī)遇也是挑戰(zhàn)。