RNAi實現(xiàn)方法及在免疫相關(guān)基因功能鑒定中的應(yīng)用＊

魏衍全,田 宏,吳錦艷,尚佑軍,劉湘濤

RNAi實現(xiàn)方法及在免疫相關(guān)基因功能鑒定中的應(yīng)用＊

魏衍全,田 宏,吳錦艷,尚佑軍,劉湘濤

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是通過內(nèi)、外源雙鏈RNA觸發(fā)的,由19-23bp小分子干擾RNA片段(siRNA)誘導(dǎo)的同源性m RNA的降解,從而使該基因表達沉默(gene silence)的過程。它是廣泛存在于動、植物中的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默,是生物體在進化過程中,抵御病毒感染及因重復(fù)序列和突變引起的基因組不穩(wěn)定性的保護機制,同時也是一種真核生物體內(nèi)的基因調(diào)控機制。1995年康奈爾大學(xué)的 Guo等〔1〕嘗試用反義 RNA阻斷線蟲par-1基因的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)反義RNA和正義RNA都阻斷了基因的表達。直到1998年Fire等〔2〕在進行線蟲基因沉默研究中,分別注射肌肉蛋白的正義、反義和雙鏈 RNA,發(fā)現(xiàn)雙鏈 RNA的抑制效果是單鏈RNA的10到100倍。他們將這種雙鏈RNA抑制基因表達的現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAi),并因此獲得了2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。此后,已陸續(xù)證明在真菌、線蟲、果蠅、植物、動物等多種生物中都存在RNAi現(xiàn)象。以下從siRNA如何在細胞內(nèi)形成來介紹RNAi實現(xiàn)的方法以及RNAi在免疫相關(guān)基因功能研究中的最新應(yīng)用進展。

1 RNAi實現(xiàn)方法

由于siRNA有效地導(dǎo)入哺乳動物細胞并不像導(dǎo)入其他生物細胞那么簡單,因此性質(zhì)穩(wěn)定、作用持久的siRNA的產(chǎn)生及在哺乳動物細胞內(nèi)實現(xiàn)功能的方法就成為該項技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。隨著對RNAi生物機制研究的不斷深入,為使siRNA最大量地在靶細胞發(fā)揮作用,最有效地與靶基因結(jié)合,研究者們正在不斷地改進各種RNAi實現(xiàn)方法。目前siRNA細胞內(nèi)形成大體有以下幾種途經(jīng)。

1.1 理化介導(dǎo)法 是指利用各種物理或化學(xué)方法將siRNA導(dǎo)入靶細胞。該方法具有安全、易于大量制備和較高的基因包裹能力等優(yōu)點。目前主要有以下幾種方式導(dǎo)入siRNA:(1)磷酸鈣共沉淀;(2)電穿孔法;(3)DEAE-葡聚糖或多聚季胺鹽(polybrene)法;(4)機械轉(zhuǎn)運法;(5)脂質(zhì)體法;(6)陽離子聚合物介導(dǎo)法等等。Huang等〔3〕設(shè)計并合成了4個針對戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因的siRNA,通過脂質(zhì)體-2000轉(zhuǎn)染A 549細胞來抑制 HEV的感染。結(jié)果顯示,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率很高并且所設(shè)計的四個siRNA均能保護細胞免受HEV的感染。

1.2 質(zhì)粒DNA載體法 雖然直接轉(zhuǎn)染合成的siRNA能特異性抑制哺乳動物細胞內(nèi)同源基因的表達〔4〕。但是細胞內(nèi)siRNA很容易被降解,不能實現(xiàn)穩(wěn)定的RNAi。相比之下,質(zhì)粒載體就能在細胞內(nèi)長時間、穩(wěn)定地生成 siRNA〔5-6〕。通過表達載體在細胞內(nèi)表達siRNA是研究者為了更有效地利用RNAi而找到的一條新的產(chǎn)生siRNA s的途徑。陸續(xù)有研究嘗試質(zhì)粒DNA載體介導(dǎo)表達,即用質(zhì)粒載體表達在細胞內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成siRNA的前體,克服了將化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)染入細胞中的一些缺點。

1.2.1 用 RNA聚合酶Ⅱ(RNA polⅡ)啟動子引導(dǎo)的表達體系 在不產(chǎn)生或存在弱的干擾素反應(yīng)的有機體或細胞類型中,可以采用能夠表達 shRNA的質(zhì)粒DNA載體。這種載體用RNA polⅡ作啟動子來啟動 shRNA的表達,后被Dicer裂解為siRNA。這種表達體系可以有效地沉默靶基因的表達。

1.2.2 用 RNA聚合酶Ⅲ(RNA polⅢ)啟動子引導(dǎo)的表達體系使用RNA polⅢ啟動子的質(zhì)粒載體表達體系可以產(chǎn)生siRNA,而不引起明顯的干擾素反應(yīng)。這種表達體系主要有兩類RNA polⅢ啟動子,即U 6啟動子與 H1啟動子,它們都是 RNA polⅢ啟動子家族中的成員。RNA polⅢ識別4個以上連續(xù) T堿基的末端終止信號,以便在沒有其他因子作用時準(zhǔn)確有效地停止轉(zhuǎn)錄。

用RNA polⅢ啟動子質(zhì)粒載體來表達siRNA有兩種方法。一是用不同的串聯(lián)啟動子來表達siRNA的有義和無義鏈。二是表達shRNA后被Dicer裂解為siRNA。Zhang等〔7〕構(gòu)建了帶有U 6啟動子和嵌合體h TERT/U 6啟動子的兩種shRNA表達載體,這兩種啟動子的載體分別靶向 EGFP和h TERT基因。構(gòu)建的這四種質(zhì)粒DNA載體分別命名為:shRNA-EGFP-U 6,shRNA-EGFP-h TERT/U6,shRNA-hTERT-U6和shRNA-h TERT-hTERT/U6。結(jié)果顯示,HELF-EGFP細胞和SMMC-7721-EGFP細胞 GFP的表達均能被 shRNA-EGFP-U 6載體表達的shRNA抑制。無論在體內(nèi)還是體外,h TERT的表達均能在轉(zhuǎn)染shRNA-h TERT-U 6或shRNA-h TERT-h TERT/U 6的細胞中被抑制。

1.3 病毒載體法 病毒載體憑借高轉(zhuǎn)染率在基因載體領(lǐng)域中占有重要地位。研究用病毒載體須經(jīng)過改良,去除其病原性的同時保留其高效的基因轉(zhuǎn)染性。常用的病毒載體包括:腺病毒載體,腺相關(guān)病毒載體和慢病毒載體。

1.3.1 腺病毒載體 腺病毒載體具有載體包裝能力強、細胞毒性反應(yīng)低等優(yōu)點,成為近年來RNAi領(lǐng)域研究的重點。目前,利用腺病毒載體將siRNA傳遞到組織細胞內(nèi)以干擾相關(guān)靶基因的表達已取得了較好的效果。Junn等〔8〕構(gòu)建了可以從一個轉(zhuǎn)錄本編碼多個shRNA的腺病毒載體,這些shRNA分別靶向不同的基因位點。結(jié)果顯示,這種表達多順反子shRNA的腺病毒載體可以沉默相應(yīng)的靶基因的表達,其沉默效率和表達單一shRNA的腺病毒載體相同。

1.3.2 腺相關(guān)病毒載體 腺相關(guān)病毒載體具有可定點整合,攜帶的外源基因長期持續(xù)穩(wěn)定表達,并可調(diào)控;感染率高,但無致病性,且免疫反應(yīng)輕微等特性已被廣泛應(yīng)用。Chen等〔9〕通過使用雙鏈伴隨腺病毒-8假模標(biāo)本載體(dsAAV 2/8)來轉(zhuǎn)運shRNA到HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,結(jié)果表明該方法能長期有效地將該模型肝細胞中 HBV蛋白、m RNA、復(fù)制型DNA抑制在一個低量的穩(wěn)定水平。

1.3.3 慢病毒載體 慢病毒載體是一類重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體,由慢病毒經(jīng)過改造而成,具有高效整合、高效轉(zhuǎn)錄、高效表達和宿主范圍廣的特點,因此它是真核系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移的有力工具。各種慢病毒載體的結(jié)構(gòu)和作用機制基本相同,主要由三種包含不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒構(gòu)成,分別是轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、包膜糖蛋白表達質(zhì)粒。慢病毒載體介導(dǎo)RNAi就是將慢病毒載體高效感染和整合的特性與RNAi特異性抑制同源基因表達的作用相結(jié)合。Stew art等〔10〕于2003年首次報道使用慢病毒介導(dǎo)RNAi的技術(shù)。他們首先在 HeLa細胞和原代培養(yǎng)的樹突狀細胞(dendritic cell,DC)中表達外源性綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP),然后利用慢病毒載體在這兩種細胞中表達針對 GFP的shRNA。實驗結(jié)果顯示:在分裂相細胞(HeLa細胞)和非分裂相細胞(DC)中,慢病毒介導(dǎo)的RNAi都能特異性抑制 GFP的表達。此后的研究證明,慢病毒載體能在原代培養(yǎng)的人巨噬細胞和造血干細胞等哺乳動物各類細胞中實現(xiàn)穩(wěn)定有效的 RNAi〔11-12〕。Deng 等〔13〕基于慢病毒 RNAi系統(tǒng)來表達針對乙肝病毒(HBV)基因組的特異性的shRNA,然后將該表達shRNA的慢病毒載體與HBV質(zhì)粒共注射 HBV復(fù)制小鼠動物模型。結(jié)果顯示,在 HBV m RNA和DNA合成水平上,慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)表達的shRNA均可引起顯著的抑制效果。筆者目前也在利用RNAi技術(shù)開展了病原與宿主細胞間相互作用的研究,其基礎(chǔ)是建立在慢病毒表達系統(tǒng)結(jié)合U 6 Entry Clone載體上,通過制備抗某種病毒的細胞系,來研究病原與宿主細胞及病原與抑制靶基因的相互關(guān)系。

2 RNAi在免疫相關(guān)基因功能鑒定中的進展

分子生物學(xué)研究的早期,人們對基因的了解都是通過基因突變而獲得的。近年來,反向遺傳學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因功能的研究,使人們對基因功能的研究取得了飛躍式的發(fā)展,但該技術(shù)在基因重組方面耗時費力。在如今的后基因組時代,RNAi技術(shù)以其獨特的優(yōu)勢成為分析基因功能的又一種方法,得到了廣泛的認同。利用RNAi技術(shù)來抑制(或敲低)脊椎動物細胞中任何基因的表達開始了反義遺傳學(xué)的革命。Lassus等〔14〕研究結(jié)果證明,RNAi作為一種實用工具誘導(dǎo)細胞內(nèi)的基因表達沉默,使得我們以前許多無法運用傳統(tǒng)功能基因組學(xué)技術(shù)研究的機制和模型成為可能,開創(chuàng)了研究基因和蛋白質(zhì)功能的新天地。

2.1 RNAi技術(shù)鑒定基因功能的策略 抑制某個基因表達可以為研究者提供該基因功能的有關(guān)信息,這是基因功能研究常用的思路。傳統(tǒng)的基因敲除、反義寡核苷酸和核酶技術(shù)正是運用了這一思路。雖然這些方法曾為基因研究甚至疾病的基因治療起到過一定的作用,但最終因其低效、復(fù)雜、費時而不能得到推廣。自從1998年 Fire等發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象以后,研究者們紛紛用dsRNA誘導(dǎo)目的基因的表達抑制,很快RNAi以其特異性和高效性抑制特定基因的表達而成為研究基因功能的強大工具,顯示出明顯優(yōu)于基因敲除和反義核酸技術(shù)的優(yōu)勢。其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在如下幾個方面:RNAi比基因敲除簡便易行;RNAi容易誘導(dǎo)產(chǎn)生,并且能將目的基因的表達抑制到極低的水平,甚至完全抑制而優(yōu)于反義核酸技術(shù);RNAi適合進行大規(guī)?；蚬δ艿难芯俊?/p>

RNAi技術(shù)作為基因功能研究中重要的工具,其原理是:它可針對某個已知基因,設(shè)計出可誘導(dǎo)其沉默的dsRNA,通過合適的手段導(dǎo)入細胞或機體,使該基因表達水平下降或完全沉默,從而了解該基因的功能,這是RNAi技術(shù)在目前最廣泛的應(yīng)用。借助操作簡便的RNAi技術(shù),可在基因組水平批量地沉默眾多基因,從而實現(xiàn)大量基因功能的研究鑒定。這些研究已在一些模式生物上成功應(yīng)用,如果蠅〔15〕、線蟲〔16〕、酵母〔17〕等。

2.2 RNAi在免疫相關(guān)基因功能鑒定中的應(yīng)用進展 1999年 Tuschl等〔18〕報道在哺乳動物中也存在RNAi,只是導(dǎo)入的 RNA是siRNA。2001年Bernstein等〔19〕的研究結(jié)果表明:只有22bp的siRNA才能特異性地阻斷m RNA,同時他們還發(fā)現(xiàn)了一個體內(nèi)分解dsRNA為siRNA的酶-Dicer。以上研究報道為RNA i技術(shù)研究免疫相關(guān)基因功能開辟了道路,使人們認識到小于30bp(約19bp-25bp)的 siRNA是哺乳動物RNAi賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。siRNA由于片段小,并且可能會通過模仿Dicer酶的酶切產(chǎn)物而并入到RNA i途徑中,從而避免引起PKR反應(yīng)。

為了更有效地利用RNAi途徑,研究者找到了一條新的產(chǎn)生siRNA的途徑,即構(gòu)建直接表達長約21-23 bp小片段siRNA的表達載體。Sui等構(gòu)建的pBS/U 6載體,可以以載體內(nèi)的DNA序列為模板,直接在轉(zhuǎn)染的細胞中產(chǎn)生特異的高效的siRNA,成功地抑制了內(nèi)源基因Lamin A/C,Lamin B等的表達。同樣,B rummelkamp等〔20〕構(gòu)建了p SUPER載體,也可有效抑制內(nèi)源免疫相關(guān)基因CDH-1,cyc-Dl,p53的表達。Turner小組〔21〕也作了類似的實驗,得到了相應(yīng)的抑制結(jié)果。這些結(jié)果表明,RNAi在哺乳動物細胞中是可行的,可以用此技術(shù)來鑒定免疫相關(guān)基因的功能。

RNAi作為一種有效、快捷和成本相對低廉的基因功能研究手段,它可以通過對免疫相關(guān)基因的關(guān)鍵序列進行RNAi來確定該基因的功能。例如,A lvarez A rias DA 等〔22〕利用 RNAi技術(shù)培育了缺失網(wǎng)格蛋白接頭分子(A P-1)的小鼠,在其胸腺細胞中抑制AP-1的表達,結(jié)果阻礙了未成熟的雙陽性胸腺細胞進一步發(fā)育,導(dǎo)致CD4+T細胞完全消失和CD3+CD8+T細胞嚴(yán)重減少。AP-1缺失在CD4+T細胞和抗原提呈細胞交互作用中的影響表明,AP-1對T細胞的活化和有效免疫突觸的形成至關(guān)重要。同時該實驗解釋揭示了AP-1在胸腺細胞發(fā)育中發(fā)揮功能的可能機制。Tu siRNA實驗組將體外構(gòu)建的siRNA分別導(dǎo)入大鼠成纖維細胞和小鼠細胞,分別抑制了它們的21個不同類型基因,并重新界定了部分必須基因和非必須基因。Boutros M等〔15〕利用RNAi技術(shù)建立了一個大規(guī)模研究基因功能的方法,該方法能夠確定果蠅生長發(fā)育的所有基因的功能和作用。這是首先用高通量全基因組掃描的方法對每一個基因的功能進行研究。Zheng L等〔23〕不但應(yīng)用 RNAi研究了細胞中某些關(guān)鍵基因的作用,還探索了siRNA在基因組水平上的篩選方法。他們從人類基因文庫中選擇8 000個靶基因,每個基因設(shè)計兩個靶序列,應(yīng)用pDual siRNA表達系統(tǒng)產(chǎn)生siRNA表達框架并構(gòu)建siRNA表達框文庫,通過它來高通量篩選NFkB信號途徑中已知的及未知的特有免疫相關(guān)基因。Huo Q等〔24〕利用p Geneclip U 1發(fā)英克隆系統(tǒng)構(gòu)建了針對胞外信號調(diào)節(jié)激酶-2(ERK2)的shRNA表達載體,然后轉(zhuǎn)染進 Eca109細胞系來研究人類食道癌Eca109細胞中 ERK2的作用。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染進shRNA-ERK2載體的 Eca109細胞與對照組相比,其生長受到顯著地抑制。轉(zhuǎn)染后96h的抑制比率為10.45%,ERK2的表達也與對照組相比受到顯著地抑制,并且細胞周期停留在了 G1期。

3 現(xiàn)存問題及展望

雖然RNAi技術(shù)已在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用,為研究生物免疫器官分化和生長發(fā)育過程中基因功能提供了有效方法,但仍有許多亟待解決的問題,如:RNAi作用的確切機制;siRNA跨膜擴散的分子基礎(chǔ);尋找定向?qū)雜iRNA的手段;哺乳類動物中的干擾素反應(yīng);脫靶效應(yīng);進行RNAi的時間和靶位點等。所以,今后的研究重點主要集中在RNAi作用的機制,以及如何進一步完善RNAi技術(shù)來研究基因的功能。

筆者現(xiàn)已構(gòu)建了多個抑制口蹄疫病毒復(fù)制的U6瞬時載體,在 PK-15細胞中證明均有抑制口蹄疫病毒復(fù)制的作用。下一步將結(jié)合慢病毒表達系統(tǒng)建立穩(wěn)定干擾口蹄疫病毒復(fù)制的細胞系,在細胞模型水平闡明抑制口蹄疫病毒復(fù)制的靶基因及其相互作用機理,并為抗病育種打下基礎(chǔ)?？梢詳嘌?RNAi技術(shù)的應(yīng)用前景將是不可估量的,特別是在未來功能基因組學(xué)和轉(zhuǎn)基因育種中將會起到舉足輕重的作用。隨著RNAi篩選策略的完善,RNAi在基因功能研究中的應(yīng)用會日趨成熟。

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1002-2694(2010)11-1067-04

Q789

A

＊“十一五”國家科技支撐計劃重大項目(2006BAD06A 03)資助

劉湘濤,Email:hnxiangtao@hotmail.com

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室 ,國家口蹄疫參考實驗室 ,農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點開放實驗室,蘭州 730046

2010-02-15;

2010-06-03