胞內(nèi)感染菌抗性侯選基因SLC11A1研究進展＊

徐 佳,丁世才,王生奎,柴 俊,劉旭川,孫紹美,史憲偉,張以芳

胞內(nèi)感染菌抗性侯選基因SLC11A1研究進展＊

徐 佳1,丁世才2,王生奎1,柴 俊3,劉旭川3,孫紹美1,史憲偉1,張以芳1

20世紀初,研究者發(fā)現(xiàn)近交系小鼠中,一種遺傳因素可以影響宿主對包括鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium),杜氏利什曼原蟲 (Leishmania donovani),卡介苗分支桿菌(BCG)等胞內(nèi)病原體的早期反應(yīng)。抵抗這些病原體相關(guān)的基因分別稱為Ity、Lsh、Bcg基因。此后人們發(fā)現(xiàn)不同鼠系對結(jié)核分支桿菌感染耐受性不同。Bcg基因也對鼠傷寒沙門菌和杜氏利什曼原蟲敏感性基因連鎖,統(tǒng)稱為Ity/L sh/Bcg基因;當(dāng)以上基因分別獨立定位于小鼠1號常染色體定位的同一個位置時,研究者認為是同一個基因參與了宿主抵抗機制,并命名為Bcg基因。1993年,Vidal等通過定位克隆的方法分離出Bcg的候選基因溶質(zhì)性載體蛋白家族11成員1(Solute carrier family 11 member 1,SLC11A 1)〔1〕。SLC11A 1曾被命名為自然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白(natural resistance associated macrophagee protein,NRAM P1)。

SLC11A 1與宿主對一些病毒、細菌、寄生蟲等引起的傳染病(如:結(jié)核病、麻風(fēng)病)的抗性相關(guān),同時也與一些自身免疫性疾病(如:川崎病、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腸炎病〔2〕、糖尿病)和癌癥的發(fā)生存在密切聯(lián)系。細菌、病毒、寄生蟲的感染,長期接觸刺激性化學(xué)藥品或者非消化性的顆粒往往導(dǎo)致機體慢性炎癥,而慢性炎癥使機體自身免疫病和癌癥發(fā)病率增高。

結(jié)核病是一重大的公共衛(wèi)生問題,根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布,全球結(jié)核病每年的新增病例約8百萬,每年約有2百萬人死于結(jié)核病。但結(jié)核病感染人群中只有10%發(fā)病。以往國內(nèi)結(jié)核病研究主要集中于致病菌本身以及環(huán)境因素(糖尿病、酗酒、H IV感染病人和長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素)的影響。隨著基因組流行病學(xué)發(fā)展,宿主抗性基因成為新的研究熱點,SLC11A 1便是一個主要的自然抗性候選基因。

1 SLC11A1基因

人的 SLC11A 1基因位于2號染色體長臂(2q35)全長14kb。包含15個外顯子。由A lu元件和4個內(nèi)含子分開。與鼠同源性為89%,只有一個拷貝。在5’和3’非編碼區(qū)(untranslated region,U TRs)、內(nèi)含子存在明顯的種屬差異性。

人類SLC11A 1m RNA長2.5kb。SLC11A 1基因3’非編碼區(qū)包含四個AUUUA重復(fù)序列,是一種富含AU的重復(fù)序列(AU-rich element,ARE),該重復(fù)序列位于2248到2287長約40bp。這些序列與短壽命的致癌基因、細胞因子和生長因子等的m RNA中發(fā)現(xiàn)的一些不穩(wěn)定序列具有同源性。ARE可以通過結(jié)合RNA結(jié)合蛋白,調(diào)控這些m RNA的生成和降解的。小鼠SLC11A 1 3’U TR不含有ARE,其SLC11A 1m RNA具有較長半衰期。

SLC11A 1基因至少有4種多態(tài)性可能影響機體對胞內(nèi)感染菌的抗性,包括啟動子的多態(tài)性;第4內(nèi)含子的單個核酸469+14G/C改變(IN T4)多態(tài)性;第 543位密碼子的非保守堿基 G/A替換(D543N)多態(tài)性和3’U TR TGTG缺失多態(tài)性。

1.1 SLC11A 1啟動子多態(tài)性 SLC11A 1 5’末端的Z-DNA微衛(wèi)星重復(fù)序列啟動子有四個等位基因。等位基因1和4的頻率為0.001,等位基因2的頻率為0.2-0.25,等位基因3的頻率為0.75-0.8。等位基因1、2、4為弱啟動子,等位基因3為強啟動子。等位基因2和等位基因3為人類兩個主要的SLC11A 1啟動子等位基因。這兩個等位基因?qū)τ赟LC11A 1表達水平具有相反的作用。等位基因2,T(GT)5AC(GT)5A C(GT)10GGCA GA(G)6導(dǎo)致SLC11A 1基因低水平地表達,與胞內(nèi)感染性疾病有關(guān)。相反等位基因3,T(GT)5AC(GT)5AC(GT)9GG CAGA(G)6促進SLC11A 1基因高水平地表達,與自身免疫疾病和癌癥。有關(guān)〔3〕。地域性傳染病多發(fā)人群,等位基因3通常具有高的分布。而不同人群中存在基因的多樣性單模標本結(jié)構(gòu)和連鎖不平衡現(xiàn)象,這會改變該人群對疾病的易感性和疾病的感染過程,甚至影響疫苗保護效價,以及預(yù)防用藥和治療用藥的醫(yī)療效果〔4〕。

1.2 IN T4與D543N多態(tài)性 對多個多態(tài)性位點進行單獨基因多態(tài)性分析和復(fù)等位基因分析,發(fā)現(xiàn)IN T4與D543N只有在形成的雜合子時對宿主抗性產(chǎn)生影響,推測各種基因多態(tài)性之間對宿主抗性有可能存在協(xié)同作用。

1.3 3’U TR TGTG缺失多態(tài)性 3’U TR TGTG缺失多態(tài)性可能通過影響正常的基因轉(zhuǎn)錄過程,導(dǎo)致感染結(jié)核后容易發(fā)病。

2 SLC11A1蛋白表達

2.1 表達SLC11A 1的細胞系 SLC11A 1在外周血中表達量最高,其次為肺和脾。SLC11A 1在人類網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的單核巨噬細胞表達量較高,在髓系細胞〔5〕、神經(jīng)元細胞〔6〕和包括有垂體前葉、腎上腺髓質(zhì)和胰島在內(nèi)的內(nèi)分泌組織中呈現(xiàn)限制性的表達特征。人類SLC11A 1基因轉(zhuǎn)化后的紅細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞和單核巨噬細胞途徑中的前體細胞(KG1,U 937,THP)和前髓白血病細胞系 HL-60中不能表達。但這些細胞在粒細胞或者單核巨噬細胞分化途徑過程中被區(qū)別處理后可以誘導(dǎo)SLC11A 1強烈表達,其影響機制還不清楚。

2.2 SLC11A 1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控 SLC11A 1的調(diào)控機制在種間存在差異。不同物種間 SLC11A 1 U TR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的類型和位置存在差異。人類活性轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcrip tion factor-3,o r AP-1-like element,A TF3)的結(jié)合位點與5’Z-DNA型的微衛(wèi)星多態(tài)性鄰近,但在小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)這樣的鄰近。A TF3對于 TLR4有負調(diào)節(jié)作用〔7〕。A TF3與JUN蛋白形成異形二聚體可以激活SLC11A 1轉(zhuǎn)錄。但A TF3自己形成的同型二聚體與DNA結(jié)合時抑制 SLC11A 1轉(zhuǎn)錄。A TF3是基礎(chǔ)亮氨酸拉鏈型轉(zhuǎn)錄因子A TF/CREB家族的成員。正常條件下A TF3在大多數(shù)細胞系里面表達量相對較低,但在生理環(huán)境改變情況下,可作為一個快速早期反應(yīng)基因被強烈誘導(dǎo)表達。這個B-DNA型序列是在大鼠腫瘤抑制基因啟動子(p53)和人類轉(zhuǎn)移生長因子B(transfom ing grow th fact B)基因中發(fā)現(xiàn)的。雖然它與 SLC11A 1 5’啟動子 Z-DNA型微衛(wèi)星多態(tài)性鄰近。但是還不清楚這些微衛(wèi)星是否是SLC11A 1 A TF-3結(jié)合位點。Z-DNA的結(jié)構(gòu)對于調(diào)節(jié)抑制性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)具有重要作用。A TF3結(jié)合位點可能是一個在SLC11A 1啟動子上的轉(zhuǎn)錄活性位點,Z-DNA微衛(wèi)星重復(fù)鄰近區(qū)域的變異會阻斷的不同等位基因間的連鎖,可能會影響染色質(zhì)的形態(tài)恢復(fù)和轉(zhuǎn)錄因子的接近〔8〕。

小鼠巨噬細胞中SLC11A 1的表達可被細菌的脂多糖、IFN-γ、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和炎癥刺激上調(diào)。

在區(qū)分處理后的 HL-60細胞中,SLC11A 1的誘導(dǎo)與SLC11A 1m RNA產(chǎn)生量有關(guān)。可以通過調(diào)控m RNA的轉(zhuǎn)錄過程來調(diào)節(jié)SLC11A 1的表達量。包含有AREs的m RNA在沒有激活的細胞中快速降解,但在特殊的生長狀態(tài)或者應(yīng)激狀況下,可以改變m RNA的降解速度。

SLC11A 1 ARE通過結(jié)合RNA結(jié)合蛋白,調(diào)控m RNA的生成和降解的?，F(xiàn)已經(jīng)證實很多蛋白可以結(jié)合在3’U TR上,尤其是ARE上。在這些蛋白中,多形核核蛋白(DAU F1 o r heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D,hnRNP D)可以加速m RNA的降解,而 HuR穩(wěn)定 m RNA阻礙其降解。HuR是胚胎致死性異常性家族(embryonic lethal abno rmal vision family)的 m RNA s結(jié)合蛋白,36-kDa,包含三個RNA識別位點。這些識別位點對于ARE具有高的親和力。HuR通過在細胞核內(nèi)與特異的m RNA結(jié)合,與m RNA一同轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)內(nèi),并使m RNA不快速降解。HuR通過作用于ARE對SLC11A 1基因進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。但它是否能調(diào)節(jié)SLC11A 1基因的表達還沒有被證實。實驗表明HuR在佛波醇豆蔻酸鹽(phorbol myristate acetate,PMA)處理的細胞中SLC11A 1結(jié)合量大于沒有處理過的細胞。PMA誘導(dǎo)的細胞質(zhì)的 HuR聚合物與 HuR在SLC11A 1 ARE結(jié)合量升高和SLC11A 1 m RNA產(chǎn)生量的升高平行相關(guān)。這表明 HuR細胞質(zhì)內(nèi)的量對于SLC11A 1表達的調(diào)控具有重要作用。同時,用RNA干擾劑RNAi下調(diào) HuR的表達造成了SLC11A 1表達量下調(diào),而該下調(diào)可以通過在在RNAi處理過的細胞中加入 HuR蛋白而得以修復(fù)。HuR在 HL-60細胞中的過度表達可以明顯增加SLC11A 1 m RNA的穩(wěn)定性〔9〕。

2.3 SLC11A 1蛋白 SLC11A 1蛋白是一個高度糖基化和磷酸化的膜整合蛋白,具有2個N端糖基化位點及5個蛋白酶C磷酸化位點。分子量約90-110kDa。具有12個跨膜區(qū)(transmembrane domains,TMDs),該跨膜區(qū)為包括人類和細菌在內(nèi)的不同的物種所具有。同時還有1個進化遺留下來的轉(zhuǎn)運點。

在SLC11A 1的MD4上的氨基酸169發(fā)生錯譯突變一個天然的甘氨酸(wild-type;Slc11a1wt)轉(zhuǎn)變成天冬氨酸(mutant;Slc11a1mut)導(dǎo)致小鼠對胞內(nèi)病原體易感性增加。但是Slc11a1mut小鼠表形難以與SLC11A 1-/-中斷突變體區(qū)分。然而,在MD4上插入大的帶負電的天冬氨酸殘基將在巨噬細胞活化過程中發(fā)揮的多效性作用。但具體分子機制還不清楚。

Slc11a1wt巨噬細胞和 Slc11a1mut巨噬細胞的吞噬體和溶酶體膜上有低水平的SLC11A 1蛋白。在內(nèi)涵體膜和Slc11a1mut巨噬細胞控制激活的溶酶體也發(fā)現(xiàn)了低水平的 SLC11A 1蛋白。大多SLC11A 1mut存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),其中含有部分糖基化中間產(chǎn)物。盡管 N端糖基化位點被阻斷了,但SLC11A 1wt能正確的轉(zhuǎn)移到內(nèi)涵體內(nèi),糖基化并不影響蛋白質(zhì)的空間折疊和分類。G169D突變體導(dǎo)致SLC11A 1定點錯誤折疊,從而被保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,表現(xiàn)出功能的喪失。SLC11A 1的變種通常與感染性疾病或者自身免疫性疾病有關(guān)〔10〕。

3 SLC11A1作用機理

3.1 SLC11A 1與自由基 SLC11A 1蛋白存在于巨噬細胞的酸性的的吞噬體和溶酶體內(nèi)。在靜息態(tài)的巨噬細胞SLC11A 1主要是在吞噬溶酶體中。但當(dāng)巨噬細胞轉(zhuǎn)為激活態(tài),SLC11A 1將會轉(zhuǎn)移到吞噬體溶酶體膜上,并充當(dāng)一個順著金屬陽離子濃度梯度轉(zhuǎn)運二價金屬離子轉(zhuǎn)運體。同時二價金屬離子比如Fe2+、M n2+的濃度水平又反饋調(diào)節(jié) SLC11A 1。正常生理狀態(tài)下,SCL 11A 1在細胞質(zhì)與酸性吞噬體、溶酶體之間轉(zhuǎn)運二價金屬陽離子。酸性晚期吞噬體和溶酶體內(nèi)發(fā)生 Fenton或者 Haber-Wesis反應(yīng),產(chǎn)生毒性抗菌的自由基,從而對吞噬體內(nèi)的微生物產(chǎn)生直接的抗微生物活性〔11〕。巨噬細胞受外界刺激活化產(chǎn)生毒性自由基主要是活性氧和含氮自由基。活性氧包括有過氧化物、單線態(tài)氧、過氧化氫、羥自由基〔12〕。含氮自由基主要是在一氧化氮合成酶作用下產(chǎn)生一氧化氮。細菌自身也會合成自身的以Fe2+或其他金屬離子為輔助因子的活性氧清除系統(tǒng),如SOD、CA T等來清除自由基。SLC11A 1順濃度梯度外排金屬離子,讓細菌自身合成的自由基清除系統(tǒng)失活,從而由自由基清除機體病原微生物。是一種機體防御機制。

但同時,自由基長期積累往往導(dǎo)致組織損傷,誘發(fā)一些包括腫瘤和癌癥在內(nèi)的漸進性發(fā)展疾病。來源于活化態(tài)巨噬細胞的過氧化氫可以一些過度元素結(jié)合,通過SLC11A 1轉(zhuǎn)運進溶酶體、晚期吞噬體內(nèi)的DNA或者RNA或者擴散到原子核,引起變性損傷,甚至導(dǎo)致腫瘤變異。同時SLC11A 1是順p H梯度的由高到低轉(zhuǎn)運金屬離子。

檢測類風(fēng)濕病人的滑膜和動脈粥樣硬化病人的泡沫細胞鐵離子明顯增高。這很有可能是與SLC11A 1相關(guān)。因為由死亡細胞釋放的核酸和蛋白質(zhì)微粒作為自身抗原,能被具 T細胞受體(TLR)3,7,8,9激活了的B淋巴細胞識別,進而B細胞成為具有抗體產(chǎn)生能力的漿細胞〔13〕,SLC11A 1可能也與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機制有關(guān)。感染牛結(jié)核的小鼠吞噬體中SLC11A 1的含量明顯高于沒有被感染的小鼠。

3.2 SLC11A 1與免疫應(yīng)答反應(yīng) 胞內(nèi)病原菌如沙門氏菌減弱菌株可以廣泛用作工程菌傳遞和表達疫苗抗原。而SLC11A 1可以通過控制細菌的復(fù)制、重組抗原劑量、M HCⅡ表達和佐劑的活性來影響重組細菌疫苗反應(yīng)?；蛘咄ㄟ^控制晚期吞噬體蛋白酶活性來影響抗原加工,SLC11A 1在巨噬細胞中調(diào)控鐵離子的動態(tài)平衡從而多效性地影響巨噬細胞系統(tǒng),包括增強干擾素(IL-1β)、促進趨化因子 KC(chemokine KC)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的生成〔14〕和促進一氧化氮的釋放(NO)。通過造成M HCⅡ表達數(shù)量上的差異,影響抗原信息傳遞給 T細胞的過程。通過序列測定和定點克隆,發(fā)現(xiàn)含有SLC11A 1的野生型等位基因老鼠活體中傾向于Th1的免疫反應(yīng)。Th1細胞有益于抵抗巨噬細胞胞內(nèi)病原體的感染,但是有可能造成Ⅰ型糖尿病。誘發(fā)Th2免疫反應(yīng)的小鼠則含有突變體等位基因。

SLC11A 1促進炎性復(fù)合物的聚集和巨噬細胞分泌前白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)。并可以在細胞質(zhì)解旋酶維甲酸誘導(dǎo)蛋白 Ⅰ(retinoic acidinducible protein I,RIG-I)和黑素瘤化相關(guān)蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5,MDA 5)作用下調(diào)控抗病毒反應(yīng)。SLC11A 1通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide–oligomerization Domains,NODs)功能影響細胞凋亡過程。NODs是炎性復(fù)合物的組成部分。NODs蛋白功能的失去或者獲得會導(dǎo)致機體對幾種免疫反應(yīng)失調(diào)喪失調(diào)控能力。細胞內(nèi)基因在含鐵量降低時,阻礙細胞生長。所以SLC11A 1轉(zhuǎn)錄的激活導(dǎo)致細胞凋亡,相反,轉(zhuǎn)錄抑制時細胞繼續(xù)生存。SLC11A 1通過調(diào)節(jié)晚期吞噬體內(nèi)抗原加工提呈過程和影響相關(guān)蛋白酶激活來影響病毒載體傳遞系統(tǒng)的免疫反應(yīng)。例如皰疹病毒的Cp G載體傳遞系統(tǒng)、腺病毒雙鏈RNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單鏈 RNA、腺病毒相關(guān)病毒載體單鏈DNA和桿狀病毒載體〔15-17〕。

SLC11A 1導(dǎo)致細胞因子在感染部位的聚集,并影響感染后的結(jié)果。例如巨噬細胞活化可能表現(xiàn)為只單獨存在IL-6、IL-6和 TGF-β兩者都有或者只有TGF-β三種狀態(tài),表現(xiàn)何種狀態(tài)決定著何種型的Th細胞被激活。在 IL-6的單獨誘導(dǎo)下,前列腺素生成量提高。前列腺素在氧自由基的生成過程中有重要作用〔18〕。IL-6與 TGF-β協(xié)同對于幼稚 T細胞分化成為能產(chǎn)生IL-17前炎癥 Th細胞。在試驗動物模型中IL-17與慢性炎癥和自身免疫病的發(fā)生有關(guān)〔19〕。TGF-β可單獨在神經(jīng)末梢周圍誘生抗炎癥的雙叉蛋白3(forkhead box protein.FOXP3)表達調(diào)控 T細胞〔20〕。結(jié)核皮膚測試陽性病例與陰性病例的FOXP3基因表達存在明顯差異。

另一類調(diào)節(jié)性T細胞在長期高水平的IL-10影響下缺乏FOXP3的生成。這類抑制性 T細胞能抑制特異性抗原反應(yīng)和下調(diào)病理免疫反應(yīng)。SLC11A 1啟動子等位基因2多態(tài)性,影響 IL-10的生成并造成不同年齡、性別、種族的結(jié)核病人或者結(jié)核痊愈病人產(chǎn)生高水平的IL-10。激活的巨噬細胞和主要SLC11A 1等位基因在SLC11A 1功能中發(fā)揮不同的作用。但是SLC11A 1怎樣通過調(diào)節(jié)這些細胞因子的生成而影響感染后的結(jié)果的機制還不清楚〔21〕。

4 展 望

根據(jù)SLC11A 1具體的作用機制可通過生物技術(shù)研發(fā)合成人類新型的具有廣譜抗菌作用抗生素藥品和保健藥物。在抗病育種方面也可培育廣譜抗病性的金屬離子高效吸收轉(zhuǎn)運的動、植物新品種。開展基因組流行病學(xué)研究,有助于肺結(jié)核等傳染病高危人群的預(yù)測,從而為優(yōu)選干預(yù)措施提供科學(xué)依據(jù)。

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1002-2694(2010)11-1071-04

R37

A

＊云南省高層次科技人才培引工程(2009 CI 125)和云南省自然科學(xué)基金(2009 CD 058)項目聯(lián)合資助

張以芳,Email,zyfkm@yahoo.com.cn

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201;2.云南省曲靖市婦幼醫(yī)院檢驗科,曲靖 655000;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),昆明 650201

2010-05-26;

2010-08-31