王亞利，范春雷，竇曉兵

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310053)

血管疾病的主要危險(xiǎn)因子之一。低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDL-R)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用在低密度脂蛋白(LDL)的代謝過程中起著重要作用?，F(xiàn)代研究表明，許多藥物具有降血脂作用，如絞股藍(lán)總皂苷［1］、姜黃素［2］、黃連素［3］、多廿醇［4］等。本文研究旨在用不同濃度的絞股藍(lán)總皂苷干預(yù)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞系來分析細(xì)胞LDL受體的功能活性。

1 材料與方法

1.1 材料 肝細(xì)胞HepG2，購自中科院細(xì)胞庫;絞股藍(lán)總皂苷，安徽甙爾塔天然有機(jī)化合物信息中心提供;DiI-LDL，本實(shí)驗(yàn)室制備［5］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)絞股藍(lán)總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活力的影響 用體積分?jǐn)?shù)0.1 FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞以1.0 ×104/孔接種于 96 孔板，每孔 100 μl，加入不同劑量的絞股藍(lán)總皂苷，終濃度分別為 1、2、5、10、20、30、40、50、70 μmol·L－1?？瞻讓?duì)照組不加藥。每組 6 復(fù)孔，培養(yǎng)48 h;加入 MTT 孵育，4 h 后加入 DMSO 150 μl，震蕩10 min，以無細(xì)胞空白孔為零點(diǎn)，在波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)OD值。

1.2.2 絞股藍(lán)總皂苷對(duì)肝細(xì)胞HepG2LDLR基因表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)給藥組，一個(gè)空白對(duì)照組，一個(gè)無脂血清(LPDS)陽性對(duì)照組，一個(gè)陰性抑制對(duì)照組。給藥組加入含絞股藍(lán)總皂苷的體積分?jǐn)?shù)0.1 FBS的DMEM培養(yǎng)液，使其終濃度分別達(dá)到5、10、20 mg·L－1。空白對(duì)照組不加絞股藍(lán)總皂苷培養(yǎng)液，陽性對(duì)照組分別用體積分?jǐn)?shù)0.1的LPDS和20 μmol·L－1的姜黃素;而陰性對(duì)照組用 10 mg·L－1的 25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol，25-HC)。其它步驟與給藥組相同。操作如下:① 按上述分組培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2及分別加藥繼續(xù)培養(yǎng)48 h;②倒掉培養(yǎng)液，各加入D-Hanks洗液，輕輕搖晃培養(yǎng)板，洗滌細(xì)胞;③ 加DiI-LDL，終濃度至20 mg·L－1，37℃孵育 4 h，再置4℃，30 min;④ 充分洗滌殘余DiI;⑤熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行定性定量分析。

2 結(jié)果

2.1 絞股藍(lán)總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活力的影響 不同濃度的絞股藍(lán)總皂苷與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)2 d后，用MTT法測(cè)定。結(jié)果表明70 mg·L－1濃度內(nèi)的絞股藍(lán)總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性無影響。

2.2 絞股藍(lán)總皂苷對(duì)肝細(xì)胞HepG2LDL-R基因表達(dá)的影響 熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明，5、10和20 mg·L－1不同濃度的絞股藍(lán)總皂苷以及陽性對(duì)照組LPDS和姜黃素均增加HepG2細(xì)胞LDL-R的表達(dá)。陰性抑制對(duì)照組25-HC則抑制HepG2細(xì)胞LDL-R的表達(dá)。

流式細(xì)胞儀定量分析結(jié)果表明，和對(duì)照組相比，5、10和20 mg·L－1不同濃度的絞股藍(lán)總皂苷對(duì)增加HepG2細(xì)胞LDL-R表達(dá)的作用明顯，各組的DiI熒光幾何平均數(shù)分別為26.6、32.6、45.6;空白對(duì)照組為21.9;陽性對(duì)照組體積分?jǐn)?shù)0.1 LPDS 及 20 μmol·L－1姜黃素分別為 41.4、34.2;陰性對(duì)照組10 mg·L－125-HC為3.8。陽性對(duì)照組及絞股藍(lán)總皂苷均增加HepG2細(xì)胞LDL-R的表達(dá);陰性對(duì)照組則抑制了HepG2細(xì)胞LDL-R的表達(dá)。

3 討論

肝臟是血漿LDL-C代謝的主要器官。因此，本文研究中，以肝細(xì)胞系HepG2為材料，研究了絞股藍(lán)總皂苷對(duì)LDLR表達(dá)的影響。中藥成分可能會(huì)影響培養(yǎng)細(xì)胞正常生長(zhǎng)。MTT實(shí)驗(yàn)表明70 mg·L－1以內(nèi)的絞股藍(lán)總皂苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性無明顯影響。

LDL作為L(zhǎng)DL-R的配體，可與細(xì)胞LDL-R特異性結(jié)合，并可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。本文用熒光試劑DiI標(biāo)記LDL，可作為熒光探針檢測(cè)細(xì)胞LDL-R的活性。結(jié)果表明5、10和20 mg·L－1不同濃度的絞股藍(lán)總皂苷組及兩個(gè)陽性組LPDS和姜黃素均促進(jìn)了LDL-R的表達(dá)。陰性抑制對(duì)照組25-HC中LDL-R的表達(dá)則被明顯抑制。說明實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的目標(biāo)蛋白準(zhǔn)確?？傊?，上調(diào)LDL-R的基因表達(dá)是絞股藍(lán)總皂苷降血脂和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制之一。

［1］ 周傳林，劉延才，蘇懷玲.絞股藍(lán)總甙治療原發(fā)性高脂血癥54例報(bào)告［J］.山東醫(yī)藥，2003，43(16):65.

［1］ Zhou C L，Liu Y C，Su H L.Gypenosides treatment of primary hyperlipidemia report of 54 cases［J］.Shandong Pharm，2003，43(16):65.

［2］ Chunlei F，Xingde W，Ying Q，et al.Effect of curcumin on the expression of LDL receptor in mouse macrophages［J］.J Ethnopharmacol，2006，105(1 －2):251 －4.

［3］ Weijia K，Jing W，Parveen A，et al.Berberine is a novel cholesterol-loweringdrug working through a unique mechanism distinct from statins［J］.Nat Med，2004，10:1344 －51.

［4］ 何鳳英，龐偉毅，陸繼培，韋小敏.多廿醇對(duì)人單核細(xì)胞低密度脂蛋白受體活性的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，7:946－8.

［4］ He F Y，Pang W Y，Lu J P，Wei X M.Effect of policosanol on activity of LDL-R［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，7:946 －8.

［5］ 竇曉兵，范春雷，胡林峰，等.膠體金－熒光素雙標(biāo)配體法研究細(xì)胞低密度脂蛋白受體的功能［J］.中國藥學(xué)雜志，2007，42(10):729－32.

［5］ Dou X B，F(xiàn)an C L，Hu L F，et al.Colloidal gold-fluorescein pairs of HCG study of LDL-R function of cells［J］.Chin Pharm J，2007，42(10):729－32.