石桂英，全雄志，陳顯達(dá)，陳陟陽(yáng)，董 偉，張連峰，鞠振宇

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021）

Cramp（cathelin-related antimicrobial peptide）基因，位于9號(hào)染色體，其編碼蛋白為cathelin-related antimicrobial peptide，即cathelicidin。該類蛋白是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)多變的抗微生物肽，因在表達(dá)的信號(hào)肽與成熟肽之間含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族［1］。Cathelicidin是宿主免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。目前已知其主要功能是抗菌活性，此外，還具有抑制組織損傷、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)、結(jié)合內(nèi)毒素、誘導(dǎo)血管生成等多種生物學(xué)功能。Jiang等［2］研究發(fā)現(xiàn)，Cramp在衰老的組織和器官中高表達(dá)，并與肝硬化等慢性病相關(guān)。為深入研究Cramp在衰老中的作用及機(jī)制，我們構(gòu)建了Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠。

1 材料和方法

1.1 Cramp表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

將Cramp cDNA重組到pcDNA3.1+載體中，用Sac I（寶生物工程有限公司）酶切線性化載體，調(diào)整濃度為5ng/μL。用顯微注射法將上述線性化片段注射入BDF1小鼠受精卵內(nèi)，用ICR小鼠做假孕受體［小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所康藍(lán)公司，XCXK（京）2004-001］，制備轉(zhuǎn)基因小鼠。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為GC05004。

1.2 PCR方法鑒定Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

用2周齡小鼠尾尖堿裂解法提取基因組DNA，PCR鑒定基因型。PCR上游引物為5′GGCTGTGGCGGTCACTATC 3′，下游引物為5′TCACCACCCCCTGTTCCTT 3′，引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20μL（試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。目的片段長(zhǎng)度為276bp。

1.3 RT-PCR檢測(cè)Cramp基因表達(dá)

取2～3月齡F1代Cramp轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性及同窩陰性小鼠，Trizol提取小鼠骨髓總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ferments）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-PCR檢測(cè)Cramp基因表達(dá)水平。引物同1.2，產(chǎn)物長(zhǎng)度276bp。用glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease（GAPDH）基因做內(nèi)參，用FAM標(biāo)記的Taqman探針監(jiān)測(cè)內(nèi)參，用SYBR GREEN監(jiān)測(cè)目的基因。Taqman探針為ABI公司生產(chǎn)。

1.4 Western blotting檢測(cè)Cramp蛋白表達(dá)

取2～3月齡F1代Cramp轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性及同窩陰性小鼠的肝臟，液氮速凍，切割組織5mg，加入蛋白裂解液600μL，超聲破碎組織30s，間隔10s，至組織完全破碎，加入6×蛋白上樣緩沖液，沸水煮10min，分裝后，凍存于-80℃，備用。肝臟總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE梯度膠電泳（4％～12％聚丙烯酰胺梯度凝膠購(gòu)自百事創(chuàng)新公司），蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上（Millipore），用5％BSA封閉。一抗（Santa Cruz公司生產(chǎn)）為兔抗鼠Cramp，二抗（購(gòu)自中杉金橋公司）為HRP標(biāo)記羊抗兔。HRP標(biāo)記的鼠抗β-actin（購(gòu)自中杉金橋公司）為內(nèi)參。曝光液為Thermo公司生產(chǎn)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒Cramp-pcDNA3.1+的鑒定

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Electrophoretic identification of recombinant plasmid with restriction enzyme digestion

將重組質(zhì)粒Cramp-pcDNA3.1+分別用NotⅠ、HindⅢ進(jìn)行酶切電泳后得到544bp的小片段，與預(yù)期大小一致，且連接方向正確，將此重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列分析，確認(rèn)Cramp-pcDNA3.1+序列正確（圖1）。

2.2 Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得及F0代轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定

將Cramp-pcDNA3.1+用SacⅠ酶切后回收純化的片段顯微注射到小鼠受精卵的雄原核中。共注射受精卵344枚，成活275枚，將存活的受精卵移植到10只假母，共產(chǎn)子鼠75只，鼠尾DNA鑒定陽(yáng)性14只，即為F0代。部分鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 部分F0代小鼠鑒定結(jié)果Fig.2 PCR analysis of some of F0 generation mice

2.3 RT-PCR檢測(cè)Cramp基因表達(dá)結(jié)果

每個(gè)founder取2只PCR鑒定陽(yáng)性小鼠，提RNA后反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)實(shí)RT-PCR檢測(cè)，有5個(gè)founder為高表達(dá)的，分別為L(zhǎng)-2、4、9、10、13、14。部分結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 RT-PCR結(jié)果Fig.3 RT-PCR results

2.4 Western blotting檢測(cè)Cramp蛋白表達(dá)結(jié)果

每個(gè)Founder取2只PCR鑒定陽(yáng)性小鼠，取肝臟組織提起蛋白樣品，Western blotting鑒定3個(gè)品系為高表達(dá)品系，L-3、13、14，部分結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 Western blotting結(jié)果Fig.4 Identification of Cramp protein by Western blotting

3 討論

本研究，成功構(gòu)建了Cramp cDNA載體，用顯微注射法建立了Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠，獲得14只F0代轉(zhuǎn)基因小鼠，將這些小鼠與C57野生型小鼠交配，產(chǎn)生F1代轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)對(duì)F1代小鼠進(jìn)行RTPCR和Western blotting鑒定，篩選出3個(gè)高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠品系。從RT-PCR和Western blotting結(jié)果可以看到，轉(zhuǎn)基因小鼠Cramp的表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照小鼠，我們可以應(yīng)用此轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究Cramp的功能及作用機(jī)制。目前對(duì)Cramp的研究多集中于其抗菌作用［3-5］，Jiang等［2］研究發(fā)現(xiàn)，Cramp蛋白在衰老的組織和器官中高表達(dá)，但其在衰老中的作用及機(jī)制尚需深入研究。我們構(gòu)建的Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠為這方面研究提供了動(dòng)物模型。

［1］Gallo RL，Kim KJ，BernfieldM，etal.Identification of CRAMP，a cathelin-related antimicrobial peptide expressed in the embryonic and adult mouse［J］.J Biol Chem，1997，272：13088-13093.

［2］Jiang H，Schiffer E，Song Z，et al.Proteins induced by telomere dysfunction and DNA damage represent biomarkers of human aging and disease［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：11299-11304.

［3］Kang SW，Lee DG，Yang ST，et al.CRAMP analog having potent antibiotic activity without hemolytic activity［J］.Protein Pept Lett，2002，9：275-282.

［4］Kirikae T，Hirata M，Yamasu H，et al.Protective effects of a human 18-kilodalton cationic antimicrobial protein（CAP18）-derived peptide against murine endotoxemia［J］.Infect Immun，1998，66：1861-1868.

［5］Murakami M，Ohtake T，Dorschner RA，et al.Cathelicidin antimicrobial peptides are expressed in salivary glands and saliva［J］.J Dent Res，2002，81：845-850.